短小芽孢杆菌作试验菌测定四环素类抗生素效价
作者：傅燕芳 张正洁 张玉良 李晓珍
单位：张正洁张玉良(西安制药厂)；傅燕芳 李晓珍(西安市药品检验所 西安 710054)
关键词：四环素类抗生素；短小芽孢杆菌；藤黄微球菌；微生物检定法；
摘要 采用管碟法 摘要 采用管碟法，测定短小芽孢杆菌对四环素类抗生素的敏感度，并与藤黄微球菌进行比较。结果概率分析表明，两种试验菌测定的效价无显著差异，表明短小芽孢杆菌法优于中国药典1995年版方法。
四环素类抗生素(土霉素、金霉素、四环素等)微生物检定法采用的试验菌种，各国药典规定不一。英国药典〔1〕采用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，美国药典〔2〕采用金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，日本标准〔3〕与中国药典〔4〕均采用藤黄微球菌(Micrococcus lutea)。鉴于以藤黄微球菌作试验菌存在诸多缺点(菌种容易变异、培养时间长、抑菌圈边缘欠清晰、测定结果误差大)，而英美两国药典所收载的色谱法〔1，2〕在我国目前又难于普及，本文试用短小芽孢杆菌作为四环素类抗生素效价测定的试验菌种，并获较满意结果。
, 百拇医药
1 材料
1.1 药品 四环素类抗生素(西安药厂、光华药厂及福州抗生素厂等，包括原料药、片剂、软膏)；四环素类抗生素标准品(中国药品生物制品检定所)。
1.2 实验菌株 短小芽孢杆菌〔CMCC(B)63202〕(按中国药典1995版二部附录72页方法制成透光率为25%的菌液)；藤黄微球菌〔CMCC(B)28001〕(制成透光率为20%的菌液)。
1.3 培养基 Ⅰ号培养基pH 7.8～8.0，Ⅱ号培养基pH 6.6(中国药品生物制品检定所)。
1.4 磷酸盐缓冲液 pH6.0缓冲液(KH2PO4 8 g，K2HPO4 2 g，加水至1L；pH8.0缓冲液(KH2PO4 0.523 g，K2HPO4 16.73 g，加水至1L)；pH 4.5缓冲液(KH2PO4 13.6 g，加水至1L)。
, 百拇医药
2 方法
采用短小芽孢杆菌：一剂量法〔5〕测定四环素与土霉素效价的标准曲线剂间比例为1∶0.8，中心浓度为8 u/ml，浓度范围为4～20 u/ml。二剂量法〔4〕高低剂量分别为8，4 u/ml。一剂量法测定金霉素效价的标准曲线剂间比例为1∶0.8，中心浓度为1 u/ml，浓度范围为0.25～10 u/ml。二剂量法高低剂量分别为1，0.5 u/ml。
采用藤黄微球菌：标准曲线制备同中国药典1977年版，二剂量法按中国药典1995年版操作。
2 结果
2.1 抑菌圈 采用pH6.0磷酸盐缓冲液及Ⅱ号培养基，短小芽孢杆菌的抑菌圈清晰度较好。按2%～3%比例将短小芽孢杆菌液加入培养基作为菌层，35℃～37℃的条件下培养14～16 h，所得到的抑菌圈大小较为合适(表1)。
, 百拇医药
表1 短小芽孢杆菌测定抑菌圈直径(mm) 样品
菌液加入量(%)
高剂量
低剂量
四环素
2
22
19
土霉素
2
21
18
金霉素
, http://www.100md.com
3
20
17
2.2 试验菌测定的标准曲线 见表2。表2 两种试验菌标准曲线斜率 样品
短小芽孢杆菌
藤黄微球菌
四环素
1.67
1.41
土霉素
1.13
1.18
, 百拇医药
金霉素
1.36
1.49
2.3 两种试验菌测定的效价 表3～5。 表3 两种试验菌测定土霉素效价对比 样品*
序号
短小芽孢菌
藤黄微球菌
差值
片剂
(%)
1
72.3
, 百拇医药
73.9
-1.6
2
93.6
93.1
0.5
3
69.2
69.5
-0.3
4
98.3
100.1
, 百拇医药
-1.8
5
82.2
79.7
2.5
6
95.4
93.1
2.3
7
81.3
82.6
-1.3
, 百拇医药
8
81.9
81.5
0.4
9
92.0
91.0
1.0
10
101.9
102.8
-0.9
原料
, 百拇医药
(u/mg)
11
93.8
92.4
1.4
12
878
878
0
13
876
874
4
, 百拇医药
14
876
875
1
15
874
873
1
16
865
875
-10
17
859
, http://www.100md.com
875
-10
注：*序号12～17样品数据由西安光华制药厂提供表4 两种试验菌测定四环素效价对比 样品*
序号
短小芽孢杆菌
藤黄微球菌
差值
片剂
(%)
1
78.5
76.4
, http://www.100md.com
2.1
2
97.1
91.7
5.4
3
86.2
89.1
-2.9
4
94.2
95.8
-1.6
, 百拇医药
5
81.3
82.6
-1.3
6
85.2
86.1
0.9
原料
(u/mg)
7
999
978
, 百拇医药
21
8
986
978
8
9
986
976
10
10
976
979
-3
11
, 百拇医药
994
989
5
12
988
979
9
13
991
988
3
14
983
979
, 百拇医药
4
15
985
979
6
16
986
980
6
17
987
981
6
18
, 百拇医药
976
970
6
粗制品
19
716
704
-12
(u/mg)
20
682
681
1
, http://www.100md.com 注：*序号8～19样品数据由西安制药厂提供表5 两种试验菌测定金霉素效价对比 样品
序号
短小芽孢杆菌
藤黄微球菌
差值
原料
(u/mg)
1
890.0
896.8
-6.0
2
, http://www.100md.com
877.1
893.6
-16.5
3
881.0
884.0
-3
4
871.0
868.2
2.8
5
888.6
, 百拇医药
873.4
15.2
6
906.7
916.9
-10.2
软膏(%)
7
103.8
103.8
0
2.4 杂质含量测定 结果见表6。表6 两种试验菌测定四环素产品杂质含量结果(u/mg) 杂质名称
, http://www.100md.com
短小芽孢杆菌
藤黄微球菌
差值
4-差向四环素
394.8
372.0
22.8
脱水差向四环素
5.9
6.0
-0.1
脱水四环素
17.6
, 百拇医药
7.6
10.0
4 讨论与小结
①表2显示，两种试验菌测定结果无显著差异，曲线斜率均较稳定，两条直线互相平行。②表3～表5列出四环素(20批)、土霉素(17批)及金霉素(7批)的考核数据。概率分析表明，两种试验菌测定的效价无显著差异(P>0.05)。③四环素类抗生素不够稳定，尤其是四环素与金霉素的差向化均较快，产品中差向金霉素含量可高达16%～17%。表6显示，两种试验菌对各种杂质的敏感度无明显差异(表中脱水四环素之测定含量两项数据，有待进一步予以验证)。④四环类抗生素微生物检定法改用短小芽孢杆菌测定的优点在于：菌液稳定，可保存较长时间，供随时取用，无需临时制备；菌种灵敏；抑菌圈成形快(培养时间短于15 h)；抑菌圈清晰，边缘整齐，便于准确测量，故而误差小，复试率低；菌液耐温，可在70℃左右的培养基上摊布菌层。
参考文献
1 BP 1993：150，472，661；A166
2 USP ⅩⅩⅢ,1995:1510,621(1221)
3 日本抗生物质医药品基准解说1990：333
4 中国药典1995年版二部.1995：附录70～74
5 中国药典1977年版二部.1997：附录
(收稿：1998-07-08), 百拇医药
单位：张正洁张玉良(西安制药厂)；傅燕芳 李晓珍(西安市药品检验所 西安 710054)
关键词：四环素类抗生素；短小芽孢杆菌；藤黄微球菌；微生物检定法；
摘要 采用管碟法 摘要 采用管碟法，测定短小芽孢杆菌对四环素类抗生素的敏感度，并与藤黄微球菌进行比较。结果概率分析表明，两种试验菌测定的效价无显著差异，表明短小芽孢杆菌法优于中国药典1995年版方法。
四环素类抗生素(土霉素、金霉素、四环素等)微生物检定法采用的试验菌种，各国药典规定不一。英国药典〔1〕采用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，美国药典〔2〕采用金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，日本标准〔3〕与中国药典〔4〕均采用藤黄微球菌(Micrococcus lutea)。鉴于以藤黄微球菌作试验菌存在诸多缺点(菌种容易变异、培养时间长、抑菌圈边缘欠清晰、测定结果误差大)，而英美两国药典所收载的色谱法〔1，2〕在我国目前又难于普及，本文试用短小芽孢杆菌作为四环素类抗生素效价测定的试验菌种，并获较满意结果。
, 百拇医药
1 材料
1.1 药品 四环素类抗生素(西安药厂、光华药厂及福州抗生素厂等，包括原料药、片剂、软膏)；四环素类抗生素标准品(中国药品生物制品检定所)。
1.2 实验菌株 短小芽孢杆菌〔CMCC(B)63202〕(按中国药典1995版二部附录72页方法制成透光率为25%的菌液)；藤黄微球菌〔CMCC(B)28001〕(制成透光率为20%的菌液)。
1.3 培养基 Ⅰ号培养基pH 7.8～8.0，Ⅱ号培养基pH 6.6(中国药品生物制品检定所)。
1.4 磷酸盐缓冲液 pH6.0缓冲液(KH2PO4 8 g，K2HPO4 2 g，加水至1L；pH8.0缓冲液(KH2PO4 0.523 g，K2HPO4 16.73 g，加水至1L)；pH 4.5缓冲液(KH2PO4 13.6 g，加水至1L)。
, 百拇医药
2 方法
采用短小芽孢杆菌：一剂量法〔5〕测定四环素与土霉素效价的标准曲线剂间比例为1∶0.8，中心浓度为8 u/ml，浓度范围为4～20 u/ml。二剂量法〔4〕高低剂量分别为8，4 u/ml。一剂量法测定金霉素效价的标准曲线剂间比例为1∶0.8，中心浓度为1 u/ml，浓度范围为0.25～10 u/ml。二剂量法高低剂量分别为1，0.5 u/ml。
采用藤黄微球菌：标准曲线制备同中国药典1977年版，二剂量法按中国药典1995年版操作。
2 结果
2.1 抑菌圈 采用pH6.0磷酸盐缓冲液及Ⅱ号培养基，短小芽孢杆菌的抑菌圈清晰度较好。按2%～3%比例将短小芽孢杆菌液加入培养基作为菌层，35℃～37℃的条件下培养14～16 h，所得到的抑菌圈大小较为合适(表1)。
, 百拇医药
表1 短小芽孢杆菌测定抑菌圈直径(mm) 样品
菌液加入量(%)
高剂量
低剂量
四环素
2
22
19
土霉素
2
21
18
金霉素
, http://www.100md.com
3
20
17
2.2 试验菌测定的标准曲线 见表2。表2 两种试验菌标准曲线斜率 样品
短小芽孢杆菌
藤黄微球菌
四环素
1.67
1.41
土霉素
1.13
1.18
, 百拇医药
金霉素
1.36
1.49
2.3 两种试验菌测定的效价 表3～5。 表3 两种试验菌测定土霉素效价对比 样品*
序号
短小芽孢菌
藤黄微球菌
差值
片剂
(%)
1
72.3
, 百拇医药
73.9
-1.6
2
93.6
93.1
0.5
3
69.2
69.5
-0.3
4
98.3
100.1
, 百拇医药
-1.8
5
82.2
79.7
2.5
6
95.4
93.1
2.3
7
81.3
82.6
-1.3
, 百拇医药
8
81.9
81.5
0.4
9
92.0
91.0
1.0
10
101.9
102.8
-0.9
原料
, 百拇医药
(u/mg)
11
93.8
92.4
1.4
12
878
878
0
13
876
874
4
, 百拇医药
14
876
875
1
15
874
873
1
16
865
875
-10
17
859
, http://www.100md.com
875
-10
注：*序号12～17样品数据由西安光华制药厂提供表4 两种试验菌测定四环素效价对比 样品*
序号
短小芽孢杆菌
藤黄微球菌
差值
片剂
(%)
1
78.5
76.4
, http://www.100md.com
2.1
2
97.1
91.7
5.4
3
86.2
89.1
-2.9
4
94.2
95.8
-1.6
, 百拇医药
5
81.3
82.6
-1.3
6
85.2
86.1
0.9
原料
(u/mg)
7
999
978
, 百拇医药
21
8
986
978
8
9
986
976
10
10
976
979
-3
11
, 百拇医药
994
989
5
12
988
979
9
13
991
988
3
14
983
979
, 百拇医药
4
15
985
979
6
16
986
980
6
17
987
981
6
18
, 百拇医药
976
970
6
粗制品
19
716
704
-12
(u/mg)
20
682
681
1
, http://www.100md.com 注：*序号8～19样品数据由西安制药厂提供表5 两种试验菌测定金霉素效价对比 样品
序号
短小芽孢杆菌
藤黄微球菌
差值
原料
(u/mg)
1
890.0
896.8
-6.0
2
, http://www.100md.com
877.1
893.6
-16.5
3
881.0
884.0
-3
4
871.0
868.2
2.8
5
888.6
, 百拇医药
873.4
15.2
6
906.7
916.9
-10.2
软膏(%)
7
103.8
103.8
0
2.4 杂质含量测定 结果见表6。表6 两种试验菌测定四环素产品杂质含量结果(u/mg) 杂质名称
, http://www.100md.com
短小芽孢杆菌
藤黄微球菌
差值
4-差向四环素
394.8
372.0
22.8
脱水差向四环素
5.9
6.0
-0.1
脱水四环素
17.6
, 百拇医药
7.6
10.0
4 讨论与小结
①表2显示，两种试验菌测定结果无显著差异，曲线斜率均较稳定，两条直线互相平行。②表3～表5列出四环素(20批)、土霉素(17批)及金霉素(7批)的考核数据。概率分析表明，两种试验菌测定的效价无显著差异(P>0.05)。③四环素类抗生素不够稳定，尤其是四环素与金霉素的差向化均较快，产品中差向金霉素含量可高达16%～17%。表6显示，两种试验菌对各种杂质的敏感度无明显差异(表中脱水四环素之测定含量两项数据，有待进一步予以验证)。④四环类抗生素微生物检定法改用短小芽孢杆菌测定的优点在于：菌液稳定，可保存较长时间，供随时取用，无需临时制备；菌种灵敏；抑菌圈成形快(培养时间短于15 h)；抑菌圈清晰，边缘整齐，便于准确测量，故而误差小，复试率低；菌液耐温，可在70℃左右的培养基上摊布菌层。
参考文献
1 BP 1993：150，472，661；A166
2 USP ⅩⅩⅢ,1995:1510,621(1221)
3 日本抗生物质医药品基准解说1990：333
4 中国药典1995年版二部.1995：附录70～74
5 中国药典1977年版二部.1997：附录
(收稿：1998-07-08), 百拇医药