霍乱弧菌O139的培养及其菌毛提取和鉴定
作者：贾文祥 杜艳 尹致英 刘聪 刘莉 张再容 孙大锡
单位：贾文祥 杜艳 刘聪 刘莉 张再容 (610041 四川省成都市 华西医科大学微生物学教研室)；尹致英 (四川省卫生防疫站)；孙大锡 (Children's Research Hospital， Tennessee，USA)
关键词：
中华预防医学杂志990312 国外研究者对O139的霍乱毒素(CT)基因、毒素共调菌毛(TCP)基因、辅助定居因子(ACF)基因等都做过分析，发现O139型菌株与E1 Tor型O1菌株具高度同源毒力基因，且毒力蛋白表达的调控也相似。但成人O139型菌株感染的高发病率暗示，潜在的抗毒素免疫并不能对O139型霍乱弧菌感染提供保护[1]。此后，研究热点逐渐转至定居小肠的抗原成分上。霍乱弧菌必需粘附于小肠上皮细胞，定居小肠并分泌外毒素，最终导致细胞内液体大量外流。国外学者认为影响霍乱弧菌粘附和定居的因素有很多，包括脂多糖、外膜蛋白、鞭毛、菌毛、血凝素等，而关于O139型菌株的培养条件、定居因子TCP的高表达及其提取鉴定，国内外人员较少涉及，作者拟就此作一些初探。
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一、材料和方法
1.菌株：O139型M045株(国际标准印度株)，El Tor型95-026株(小川型)。
2.检测试剂：①TcpA6为人工合成多肽，单克隆抗体为抗TcpA6，由美国田纳西大学Taylor RK教授制备；②羊抗鼠IgG-HRP(标准分子量17 000-94 000)购自华美生物工程公司。
3.培养基：①Luria肉汤(LB)，pH值6.7；②AKI培养基[2]，pH值7.0；③定居固子琼脂培养基(CFA)[3]，pH值6.7。
4.培养条件：①AKI培养基，先30℃厌氧培养6～7小时后转有氧环境24～36小时；②CFA培养基，30℃有氧培养36～48小时。
5.TCP菌毛提取方法：①见文献[2]，将收集的菌体悬浮于10 mmol/L(PBS+EDTA)中，洗涤后经过4.5号针2～3次；加乙醇胺多次搅拌、反复离心，上清经透析、浓缩即得。②见文献[3]，用PBS集菌，56℃水浴振荡后离心，上清过膜、透析、硫酸铵沉淀即得。
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6.电子显微镜技术：用接种环挑取平板上少许菌落，玻片上稀释，将蘸有菌稀释液的铜网经1%磷钨酸负染，滤纸吸去多余液体，电镜观察。
7.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：参照Laemmli[4]方法，滤膜水平电泳槽，10%凝胶，电压60 V，时间5～6小时。
8.斑点酶免疫反应(dot blot immunoassay)：包被液稀释的待测抗原(O139型M045株和El Tor型95-026株的TCP)各2 μl，点样于包被液浸泡过的硝酸纤维膜上；自然干燥后用含1%小牛血清的PBS封闭，再加1% McAb室温过夜，PBS-Tween洗膜，加羊抗鼠IgG-HRP作用，底物液显色，TE缓冲液终止反应[5]。
二、结果
1.霍乱弧菌O139型M045株和El Tor型95-026株在AKI、CFA培养基30℃均生长良好。研究发现固体培养基比液体培养基、静止培养比振荡培养更有利于菌毛生长。
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2.菌毛提取量：AKI培养基中相同条件下，800 ml M045株抽提的粗提菌毛量约为391 mg；800 ml 95-026株抽提的菌毛量约为3 528 mg。两者约相差9倍，El Tor型明显高于O139型。
3.电镜照片显示：AKI培养基中易于见到束状毒素共调菌毛，而CFA培养基中则多见菌体周围遍布的短、粗、杂草状菌毛。El Tor型菌株易见到鞭毛，O139型菌株则未见到。
4.SDS-PAGE电泳结果：M045株和95-026株提取纯化的菌毛都存在分子量为20 500条带。
5.DBI结果：M045株和95-026株分别在硝酸纤维膜上出现明显的斑点，可知M045株和95-026株的TcpA存在同源性。
三、讨论
霍乱弧菌之所以难成有效的菌苗，除了霍乱弧菌的有效保护性抗原成分不清楚之外，还与其抗原漂移和足够有效抗原剂量以及免疫效果、维持时间长短等有关。霍乱弧菌所产生的TCP是诱导霍乱免疫的重要成分之一，许多研究者对TCP的纯化方法、生物学特性、致病机理、免疫原性以及用于霍乱菌苗等方面做了研究。关于TCP，Taylor 和Miller[6]最早报道，指出TCP在乳鼠霍乱模型中为重要的定居因子，随后在人类得到证实[7]。1989年Sharma等[8]报道TCP中分子量为20 500的蛋白质是构成菌毛的主要亚单位，由它所诱导产生的抗体能阻断细菌对肠上皮的粘附，防止感染并有效保护乳鼠对霍乱弧菌的攻击。El Tor型和O139型菌株的有效定居小肠，依赖于TCP的表达，而对甘露醇敏感的血凝素菌毛对此并非重要。1996年Attridge等[9]发现MshA突变株在乳鼠霍乱模型中无明显毒性减低或定居力缺失；而TcpA则为强减毒株，引起定居力显著下降，在霍乱弧菌的致病机理中起重要作用。
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本研究结果表明：①两种培养基中霍乱弧菌的形状都典型；②相同条件下，95-026株提纯的菌毛量明显高于M045株，可见El Tor型菌株的菌毛表达也远远高于O139型；③提纯TCP的两种方法中CFA法更优；④SDS-PAGE电泳和DBI结果都表明O139型和El Tor型菌株的TcpA具有同源性，可见TCP是霍乱弧菌的共同抗原之一。
TCP的有效提取为霍乱弧菌亚单位菌苗的研制提供了基础，对TCP的进一步研究将有助于霍乱弧菌致病机理的探索和霍乱菌苗的研制。
*本研究受卫生部科学研究基金资助(编号：96-1-244)
参考文献
1 Nair GB, Ramamurthy, T, Bhattacharya SK, et al. Spread of Vibrio cholerae O139 Bengal in India. J Infect Dis, 1994, 169: 1029-1034.
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2 Sun DX, Mekalanos JJ, Taylor RK. Antibodies directed against the toxin-coregulated pilus isolated from Vibrio cholerae provide protection in the infant mouse experimental cholera model. J Infect Dis, 1990, 161: 1231-1236.
3 Wanaga M, Nakasone N, Yamashiro T, et al. Pili of Vibrio cholera widely distributed in serogroup O1 strains. Microbiol Immunol, 1993, 37: 23-28.
4 Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970，227:680-685.
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5 谭德明，刘双虎，胡国龄，等. 五种HCV基因重组抗原斑点酶免疫反应检测血清抗体HCV. 中华传染病杂志，1997, 15: 92-93.
6 Taylor RK, Miller VL. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proc Natl Acad Sci U S A, 1987, 84: 2833-2837.
7 Herrington DA, Hall RH, Losonsky G, et al. Toxin, toxin-coregulated pili, and the toxR regulon are essential for Vibro cholera pathogenesis in humans. J Exp Med, 1988， 168: 1487-1492.
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8 Sharma DP, Thomas C, Hall RH, et al. Significance of toxin-coregulated pili as protective antigens of Vibrio cholerae in the infant mouse models. Vaccine, 1989, 7: 451-456.
9 Attridge SR, Manning PA, Holmgren J, et al. Relative significance of mannose-sensitive hemagglutinin and toxin-coregulated pili in colonization of infant mice by Vibrio cholerae El Tor. Infect Immun, 1996, 64: 3369-3373.
收稿日期：1998-06-04 修回日期：1998-08-27, http://www.100md.com
单位：贾文祥 杜艳 刘聪 刘莉 张再容 (610041 四川省成都市 华西医科大学微生物学教研室)；尹致英 (四川省卫生防疫站)；孙大锡 (Children's Research Hospital， Tennessee，USA)
关键词：
中华预防医学杂志990312 国外研究者对O139的霍乱毒素(CT)基因、毒素共调菌毛(TCP)基因、辅助定居因子(ACF)基因等都做过分析，发现O139型菌株与E1 Tor型O1菌株具高度同源毒力基因，且毒力蛋白表达的调控也相似。但成人O139型菌株感染的高发病率暗示，潜在的抗毒素免疫并不能对O139型霍乱弧菌感染提供保护[1]。此后，研究热点逐渐转至定居小肠的抗原成分上。霍乱弧菌必需粘附于小肠上皮细胞，定居小肠并分泌外毒素，最终导致细胞内液体大量外流。国外学者认为影响霍乱弧菌粘附和定居的因素有很多，包括脂多糖、外膜蛋白、鞭毛、菌毛、血凝素等，而关于O139型菌株的培养条件、定居因子TCP的高表达及其提取鉴定，国内外人员较少涉及，作者拟就此作一些初探。
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一、材料和方法
1.菌株：O139型M045株(国际标准印度株)，El Tor型95-026株(小川型)。
2.检测试剂：①TcpA6为人工合成多肽，单克隆抗体为抗TcpA6，由美国田纳西大学Taylor RK教授制备；②羊抗鼠IgG-HRP(标准分子量17 000-94 000)购自华美生物工程公司。
3.培养基：①Luria肉汤(LB)，pH值6.7；②AKI培养基[2]，pH值7.0；③定居固子琼脂培养基(CFA)[3]，pH值6.7。
4.培养条件：①AKI培养基，先30℃厌氧培养6～7小时后转有氧环境24～36小时；②CFA培养基，30℃有氧培养36～48小时。
5.TCP菌毛提取方法：①见文献[2]，将收集的菌体悬浮于10 mmol/L(PBS+EDTA)中，洗涤后经过4.5号针2～3次；加乙醇胺多次搅拌、反复离心，上清经透析、浓缩即得。②见文献[3]，用PBS集菌，56℃水浴振荡后离心，上清过膜、透析、硫酸铵沉淀即得。
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6.电子显微镜技术：用接种环挑取平板上少许菌落，玻片上稀释，将蘸有菌稀释液的铜网经1%磷钨酸负染，滤纸吸去多余液体，电镜观察。
7.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：参照Laemmli[4]方法，滤膜水平电泳槽，10%凝胶，电压60 V，时间5～6小时。
8.斑点酶免疫反应(dot blot immunoassay)：包被液稀释的待测抗原(O139型M045株和El Tor型95-026株的TCP)各2 μl，点样于包被液浸泡过的硝酸纤维膜上；自然干燥后用含1%小牛血清的PBS封闭，再加1% McAb室温过夜，PBS-Tween洗膜，加羊抗鼠IgG-HRP作用，底物液显色，TE缓冲液终止反应[5]。
二、结果
1.霍乱弧菌O139型M045株和El Tor型95-026株在AKI、CFA培养基30℃均生长良好。研究发现固体培养基比液体培养基、静止培养比振荡培养更有利于菌毛生长。
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2.菌毛提取量：AKI培养基中相同条件下，800 ml M045株抽提的粗提菌毛量约为391 mg；800 ml 95-026株抽提的菌毛量约为3 528 mg。两者约相差9倍，El Tor型明显高于O139型。
3.电镜照片显示：AKI培养基中易于见到束状毒素共调菌毛，而CFA培养基中则多见菌体周围遍布的短、粗、杂草状菌毛。El Tor型菌株易见到鞭毛，O139型菌株则未见到。
4.SDS-PAGE电泳结果：M045株和95-026株提取纯化的菌毛都存在分子量为20 500条带。
5.DBI结果：M045株和95-026株分别在硝酸纤维膜上出现明显的斑点，可知M045株和95-026株的TcpA存在同源性。
三、讨论
霍乱弧菌之所以难成有效的菌苗，除了霍乱弧菌的有效保护性抗原成分不清楚之外，还与其抗原漂移和足够有效抗原剂量以及免疫效果、维持时间长短等有关。霍乱弧菌所产生的TCP是诱导霍乱免疫的重要成分之一，许多研究者对TCP的纯化方法、生物学特性、致病机理、免疫原性以及用于霍乱菌苗等方面做了研究。关于TCP，Taylor 和Miller[6]最早报道，指出TCP在乳鼠霍乱模型中为重要的定居因子，随后在人类得到证实[7]。1989年Sharma等[8]报道TCP中分子量为20 500的蛋白质是构成菌毛的主要亚单位，由它所诱导产生的抗体能阻断细菌对肠上皮的粘附，防止感染并有效保护乳鼠对霍乱弧菌的攻击。El Tor型和O139型菌株的有效定居小肠，依赖于TCP的表达，而对甘露醇敏感的血凝素菌毛对此并非重要。1996年Attridge等[9]发现MshA突变株在乳鼠霍乱模型中无明显毒性减低或定居力缺失；而TcpA则为强减毒株，引起定居力显著下降，在霍乱弧菌的致病机理中起重要作用。
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本研究结果表明：①两种培养基中霍乱弧菌的形状都典型；②相同条件下，95-026株提纯的菌毛量明显高于M045株，可见El Tor型菌株的菌毛表达也远远高于O139型；③提纯TCP的两种方法中CFA法更优；④SDS-PAGE电泳和DBI结果都表明O139型和El Tor型菌株的TcpA具有同源性，可见TCP是霍乱弧菌的共同抗原之一。
TCP的有效提取为霍乱弧菌亚单位菌苗的研制提供了基础，对TCP的进一步研究将有助于霍乱弧菌致病机理的探索和霍乱菌苗的研制。
*本研究受卫生部科学研究基金资助(编号：96-1-244)
参考文献
1 Nair GB, Ramamurthy, T, Bhattacharya SK, et al. Spread of Vibrio cholerae O139 Bengal in India. J Infect Dis, 1994, 169: 1029-1034.
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2 Sun DX, Mekalanos JJ, Taylor RK. Antibodies directed against the toxin-coregulated pilus isolated from Vibrio cholerae provide protection in the infant mouse experimental cholera model. J Infect Dis, 1990, 161: 1231-1236.
3 Wanaga M, Nakasone N, Yamashiro T, et al. Pili of Vibrio cholera widely distributed in serogroup O1 strains. Microbiol Immunol, 1993, 37: 23-28.
4 Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970，227:680-685.
, http://www.100md.com
5 谭德明，刘双虎，胡国龄，等. 五种HCV基因重组抗原斑点酶免疫反应检测血清抗体HCV. 中华传染病杂志，1997, 15: 92-93.
6 Taylor RK, Miller VL. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proc Natl Acad Sci U S A, 1987, 84: 2833-2837.
7 Herrington DA, Hall RH, Losonsky G, et al. Toxin, toxin-coregulated pili, and the toxR regulon are essential for Vibro cholera pathogenesis in humans. J Exp Med, 1988， 168: 1487-1492.
, 百拇医药
8 Sharma DP, Thomas C, Hall RH, et al. Significance of toxin-coregulated pili as protective antigens of Vibrio cholerae in the infant mouse models. Vaccine, 1989, 7: 451-456.
9 Attridge SR, Manning PA, Holmgren J, et al. Relative significance of mannose-sensitive hemagglutinin and toxin-coregulated pili in colonization of infant mice by Vibrio cholerae El Tor. Infect Immun, 1996, 64: 3369-3373.
收稿日期：1998-06-04 修回日期：1998-08-27, http://www.100md.com