用Percoll分离的大鼠睾丸间质细胞对绒毛膜促性腺激素刺激的反应
作者：窦京涛 李明 邵迎红 马芳玲 潘长玉 李江源
单位：解放军总医院内分泌科，北京 100853
关键词：睾丸间质细胞；睾丸酮；Percoll；人绒毛膜促性腺激素
军医进修学院学报科学990321 摘要 目的：了解用分离液Percoll分离的Leydig细胞对人绒毛膜促性腺激素刺激的反应规律。方法：将大鼠睾丸间质细胞混悬液用不连续梯度 (20%～80%) Percoll分离液分离并进行为期 5 d 的培养，观察不同培养时间Leydig对不同剂量hCG刺激的反应。结果：Percoll分离、纯化的Leydig细胞纯度可达 80%～85%；随着培养时间的延长，Leydig细胞功能逐渐减低，对hCG刺激反应以培养 d 1 和 d 2 最大；小剂量hCG(1 IU/ml) 即可使睾酮分泌达到峰值，加大剂量则会抑制细胞分泌睾酮的功能。结论：Percoll分离液能明显的提高Leydig细胞纯度；培养的 d 1～2 为最佳刺激时间，hCG用量以 1 IU/ml 为宜。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 Q 45
The response of leydig cells isolated by Percoll to the stimulation of human Chorionic Gonadotropin
Dou Jingtao, Li Ming, Shao Yinghong, Ma Fangling, Pan Changyu, Li jiangyuan (Department of Endocrinology, PLA General Hospital, Beijing, 100853, China)
Abstract Objective:To observe the response of Leydig cells isolated by Percoll to the stimulation of human Chorionic Gonadotropin. Methods:Leydig cells were isolated and purified by a discontinuous Percoll gradient of 20%～80% and then cultured for 5 days. human Choronic Gonadotropin was given in different time and in different dosage. Testosterone was measured. Results:The purity of Leydig cells was 80%～85%. Testosterone decreased with time going. The peak of testosterone stimulated by hCG was in the first and second day of culturing. Low dose of hCG could cause highest production of testosterone. High dose of hCG may inhibit secreting of Testosterone. Conclusions:Highly purified Leydig cells could be obtained with Percoll. Both the first and second day of cluturing were the best time to stimulate with hCG. The available dosage of hCG was 1 IU/ml.
, 百拇医药
Key words Leydig cells; testosterone; Percoll; human Chorionic Gonadotropin
睾丸间质细胞(Leydig细胞)是雄激素的主要来源，研究其功能的变化对于了解睾丸在生殖内分泌中的作用有重要意义。由于技术水平的限制，以往对于大鼠睾丸Leydig细胞的研究多用混合细胞培养法〔1，2〕，常常影响结果的准确性。近些年国外用Percoll细胞分离液来分离Leydig细胞，可使细胞纯度达到 85% 以上〔3，4〕，为进一步研究提供了手段。本文观察了用Percoll分离的Leydig细胞对人绒毛膜促性腺激素刺激的反应，以期探讨其变化规律。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物 雄性Wistar大鼠，体重 220～250 g，由解放军总医院实验动物中心提供。
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1.1.2 试剂 McCoy 5 A 培养基系GIBCO产品；胎牛血清系天津血制品研究所产品；Ⅰ型胶元酶购自华美生物工程公司，应用浓度 0.03%；人绒毛膜促性腺激素(hCG)，购自中国科学院动物研究所，纯度 6000 IU/mg; Percoll细胞分离液系Pharmacia公司产品；应用时按 9∶1 与 1.5 mol/L 氯化钠液混合成等渗溶液。磷酸缓冲液：pH 7.5，含青霉素 100 IU/ml，链霉素 100 IU/ml。
1.1.3 仪器 CO2 培养箱(Heraeus公司，德国)；ACS： 180 化学发光分析仪(Chiron公司，美国)；himac CR22E 离心机(HITACHI公司，日本)。
1.2 方法
1.2.1 Leydig细胞的分离纯化 参照文献方法〔1，3〕并加以改良。步骤如下：断头处死大鼠，游离睾丸并用冷磷酸缓冲液冲洗 3 遍；祛除白膜和血管后置含有 0.03% Ⅰ型胶元酶的McCoy 5 A 培养基中， 37 ℃ 震荡 15 min，加入等量的McCoy 5 A 培养基终止反应。消化液用 300 目不锈钢网过滤，收集过滤液 1000 r/min 离心 10 min，弃上清，沉淀物用McCoy 5 A 培养基洗 2 遍，条件同前。最后沉淀物混悬于 1 ml McCoy 5 A 培养基中。用McCoy 5 A 培养基将等渗Percoll细胞分离液配置成 13 个浓度梯度 (20%～80%)，并依次加入离心管中，将 1 ml 细胞混悬液(约 105 细胞)置细胞分离液顶端， 1 000 g 室温离心 30 min，细胞依据比重不同分为 13 个层面；间质细胞位于第六个密度层面，吸取该层面细胞并用培养基洗 2 遍 (1 000 r/min, 10 min)， 2 ml 培养基悬浮细胞后计数。
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1.2.2 Leydig细胞培养 用含 1% 胎牛血清的McCoy 5 A 培养基将Leydig细胞浓度调整至 105/ml，按每孔 1 ml 接种于 24 孔培养板(Evergreen Scientific 公司，美国)中；培养条件： 5% CO2， 95% 空气， 37 ℃ 饱和水蒸气。
1.3 培养的大鼠Leydig细胞对绒毛膜促性腺激素刺激的反应
1.3.1 不同培养时间的大鼠Leydig细胞对绒毛膜促性腺激素刺激的反应 大鼠Leydig细胞分为 6 组，对照组(A组)及分别在 1～5 d 加入hCG组(B～F组)。以上各组均培养 6 d，各处理组分别在相应时间加入hCG， 24 h 后收集培养液，其余各天均更换培养液；hCG的最终浓度为 30 IU/ml〔5〕。
1.3.2 培养的大鼠Leydig细胞对不同浓度绒毛膜促性腺激素刺激的反应 大鼠Leydig细胞分为 6 组，培养 d 1 加入不同浓度hCG，最终浓度分别为 0 IU/ml； 0.1 IU/ml; 1 IU/ml; 5 IU/ml; 10 IU/ml; 50 IU/ml。 24 h 后收集培养液待测。
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1.4 睾酮测定 采用化学发光法，批内变异系数 5.3%～5.5%，批间变异系数 5.2%～6.7%；可测范围 0.1～50 nmol/L。
1.5 数据及统计学处理 全部数据均采用平均数±标准差(
±s)表示，数据间比较采用F-Q验。
2 结 果
2.1 培养的大鼠Leydig细胞形态学观察 接种初期细胞近似圆形，局部有轻度凹陷， 3～4 h 左右贴壁， 6～8 h 一些细胞突起伸展， 12 h 细胞贴壁呈单层生长。典型的Leydig细胞形态呈椭圆形或树叶形，均质色淡，胞质内无明显颗粒，细胞核淡染。细胞纯度可达 80%～95%。
2.2 培养的大鼠Leydig细胞对绒毛膜促性腺激素刺激的反应
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2.2.1 不同培养时间的大鼠Leydig细胞对绒毛膜促性腺激素刺激的反应 在无hCG刺激的情况下，各处理组随着培养时间的延长，睾酮的分泌量逐渐下降；而对hCG刺激的反应也随着时间的延长逐渐减低，增加的绝对值 d 1 约为 8 nmol/L， d 2 约为 8 nmol/L， d 3 降为 2.4 nmol/L，到培养的 d 4 与对照组已无明显差异(附表)。
附表 培养不同时间的Lcydig细胞(105)用hCG(30IU/ml)刺激后睾酮的变化(n＝4，±s，C/nmol.L-1) 组别
培养时间(d)
1
2
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3
4
5
A组
9.8±0.5
4.3±0.2
1.2±0.1
0.9±0.1
0.4±0.1
B组
17.6±0.6**
3.7±0.3*
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0.7±0.1**
0.4±0.1**
0.2±0.1*
C组
9.7±0.6
12.0±1.8**
2.5±0.3**
0.5±0.1**
0.1±0.0**
D组
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9.7±0.8
4.5±0.6
3.6±0.4**
0.7±0.3
0.2±0.0**
E组
9.5±1.2
4.1±0.7
1.0±0.3
0.8±0.2
0.4±0.2
F组
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9.4±0.3
4.3±0.4
1.1±0.1
0.9±0.2
0.5±0.2
与A组比较 * P<0.05； ** P<0.01
2.2.2 培养的大鼠Leydig细胞对不同浓度绒毛膜促性腺激素刺激的反应 hCG为 0 IU/ml 时，睾酮的浓度为 (3.1±0.18) nmol/L；hCG浓度为 1 IU/ml 时，睾酮的分泌量达到高峰 (22.08±2.22) nmol/L；此后随着hCG剂量的增加，睾酮的分泌量反而下降，hCG的浓度为 50 IU/ml 时，睾酮分泌量仅为 (15.95±1.87) nmol/L。
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3 讨 论
以往Leydig细胞的培养所采用的方法是通过胶原酶消化睾丸组织而得到富含Leydig细胞的混悬液〔1，2〕，其中不但有所需要的Leydig细胞，而且还有大量的各级生精细胞和支持细胞，常常不能精确计算Leydig细胞含量，再者其含量也随消化程度不同有所改变；若将富含Leydig细胞的混悬液用于不同处理组之间的比较，则明显的会影响其结果的准确性。所以分离、纯化Leydig细胞是研究其功能变化的基础。Percoll分离液是由包被着聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的二氧化硅胶体微粒构成，无毒，通过高速离心或与常规梯度分离剂混合而形成不同密度梯度，依据分离物的密度不同将其分离开，是一种比较理想的生命物质分离液。Kumar等〔3〕将Percoll配置成不同浓度梯度来分离大鼠Leydig细胞，细胞纯度可以达到 85% 以上。作者依据文献用Percoll分离纯化了大鼠Leydig细胞，纯度也达到 80%～85%。富含Leydig细胞的混悬液通过Percoll分离纯化后其纯度大大提高，为进一步研究Leydig细胞形态和功能变化提供了条件。
, 百拇医药
Risberidge等〔6〕用DMEM培养分离、纯化后的大鼠Leydig细胞，并用hCG进行刺激以检验细胞的反应性，结果显示细胞的功能只维持 3 d。本文资料也显示体外培养的Leydig细胞活力随着时间的延长而有所下降，到 d 4 以后基础睾酮分泌和对hCG刺激的反应明显降低，提示此时Leydig细胞基本丧失了分泌睾酮的能力。与Risberidge等报告的结果相似。培养的Leydig细胞之所以出现功能减弱是因为：①细胞失去了促性腺激素的刺激；②纯化后的细胞接近于单一细胞，失去了体内细胞相互作用的环境，缺乏旁分泌所释放的某些促生长刺激因子，如IGF、TGF等〔7〕。本文结果显示培养 d 1 和 d 2 用hCG刺激后睾酮分泌增加的绝对值分别为 8 nmol/L，明显高于 d 3 的 2.4 nmol/L，提示培养的 d 1 和d 2 细胞尚维持正常反应，为刺激的最佳时间，此后则不能真正反映细胞功能变化。
本研究发现小剂量hCG刺激即可以使睾酮的分泌达到高峰，而加大hCG刺激量不但不能使睾酮分泌量增加，反而抑制了其合成。本资料显示，B组用hCG (30 IU/ml) 刺激后 d 3 睾酮分泌量显著低于对照组(P<0.05)，至培养结束仍低于对照组；这种现象也可以见于其余各组。上述现象说明大剂量hCG使Leydig细胞分泌睾酮的功能明显降低，即使细胞出现了失敏感性。细胞失敏感性时睾酮合成过程中的各种酶系功能均受到不同程度的抑制，致使睾酮合成和分泌量下降。有报道认为这种失敏感性需要 6～10 d 才能恢复〔8〕。故此，要获得最大刺激反应，hCG用量不宜太大，按本试验条件 105 个Leydig细胞最佳刺激剂量为 1 IU/ml。
, 百拇医药
(本实验得到中国科学院动物研究所庄临之研究员的悉心指导，特致谢)
参考文献
1 向红丁，迟芝盛，庄临之.GnRH-A对雄性大鼠睾丸内分泌功能的抑制作用.中华内分泌代谢杂志，1985，1(1)：45
2 王忠山，王成忠，左之静等.青春期糖尿病大鼠睾丸间质细胞功能和细胞核雄激素受体的影响.中国病理生理杂志，1996，12(6)：575
3 Kumar S, Blumberg D, Canas JA et al. Human Chorionic gonadotropin (hCG) increase cystosolic free calcium in adult rat leydig cells. Cell Calcium, 1994，15:349
, 百拇医药 4 Browning JY, D Agata R, Grotjan Jr HE. Isolation of purified rat leydig cells using continuous Percoll gradients. Endocrinol, 1981， 109:667
5 Lin T, Calkins JH, Morris PL et al. Regulation of Leydig cell Function in primary culture by inhibin and activin. Endocrinol, 1989，125(4):2134
6 Risbridger GP, IIedger MP. Adult rat leydig cell cultures: minimum requirements for maintenan of luteinizing hormone responsiveness and testosterone production. Mole Cell Endocrinol, 1992，83:125
7 Skinner MK. Cell-cell interactions in testis. Endocrinol Rev, 1991，12:45
8 窦京涛，李江源，汪寅章 等.人绒毛膜促性腺激素对大鼠睾丸相关激素受体的影响.中华医学杂志，1994，74(9)：570
(1999—02—02收稿，1999—04—14修回), 百拇医药
单位：解放军总医院内分泌科，北京 100853
关键词：睾丸间质细胞；睾丸酮；Percoll；人绒毛膜促性腺激素
军医进修学院学报科学990321 摘要 目的：了解用分离液Percoll分离的Leydig细胞对人绒毛膜促性腺激素刺激的反应规律。方法：将大鼠睾丸间质细胞混悬液用不连续梯度 (20%～80%) Percoll分离液分离并进行为期 5 d 的培养，观察不同培养时间Leydig对不同剂量hCG刺激的反应。结果：Percoll分离、纯化的Leydig细胞纯度可达 80%～85%；随着培养时间的延长，Leydig细胞功能逐渐减低，对hCG刺激反应以培养 d 1 和 d 2 最大；小剂量hCG(1 IU/ml) 即可使睾酮分泌达到峰值，加大剂量则会抑制细胞分泌睾酮的功能。结论：Percoll分离液能明显的提高Leydig细胞纯度；培养的 d 1～2 为最佳刺激时间，hCG用量以 1 IU/ml 为宜。
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中国图书资料分类法分类号 Q 45
The response of leydig cells isolated by Percoll to the stimulation of human Chorionic Gonadotropin
Dou Jingtao, Li Ming, Shao Yinghong, Ma Fangling, Pan Changyu, Li jiangyuan (Department of Endocrinology, PLA General Hospital, Beijing, 100853, China)
Abstract Objective:To observe the response of Leydig cells isolated by Percoll to the stimulation of human Chorionic Gonadotropin. Methods:Leydig cells were isolated and purified by a discontinuous Percoll gradient of 20%～80% and then cultured for 5 days. human Choronic Gonadotropin was given in different time and in different dosage. Testosterone was measured. Results:The purity of Leydig cells was 80%～85%. Testosterone decreased with time going. The peak of testosterone stimulated by hCG was in the first and second day of culturing. Low dose of hCG could cause highest production of testosterone. High dose of hCG may inhibit secreting of Testosterone. Conclusions:Highly purified Leydig cells could be obtained with Percoll. Both the first and second day of cluturing were the best time to stimulate with hCG. The available dosage of hCG was 1 IU/ml.
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Key words Leydig cells; testosterone; Percoll; human Chorionic Gonadotropin
睾丸间质细胞(Leydig细胞)是雄激素的主要来源，研究其功能的变化对于了解睾丸在生殖内分泌中的作用有重要意义。由于技术水平的限制，以往对于大鼠睾丸Leydig细胞的研究多用混合细胞培养法〔1，2〕，常常影响结果的准确性。近些年国外用Percoll细胞分离液来分离Leydig细胞，可使细胞纯度达到 85% 以上〔3，4〕，为进一步研究提供了手段。本文观察了用Percoll分离的Leydig细胞对人绒毛膜促性腺激素刺激的反应，以期探讨其变化规律。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物 雄性Wistar大鼠，体重 220～250 g，由解放军总医院实验动物中心提供。
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1.1.2 试剂 McCoy 5 A 培养基系GIBCO产品；胎牛血清系天津血制品研究所产品；Ⅰ型胶元酶购自华美生物工程公司，应用浓度 0.03%；人绒毛膜促性腺激素(hCG)，购自中国科学院动物研究所，纯度 6000 IU/mg; Percoll细胞分离液系Pharmacia公司产品；应用时按 9∶1 与 1.5 mol/L 氯化钠液混合成等渗溶液。磷酸缓冲液：pH 7.5，含青霉素 100 IU/ml，链霉素 100 IU/ml。
1.1.3 仪器 CO2 培养箱(Heraeus公司，德国)；ACS： 180 化学发光分析仪(Chiron公司，美国)；himac CR22E 离心机(HITACHI公司，日本)。
1.2 方法
1.2.1 Leydig细胞的分离纯化 参照文献方法〔1，3〕并加以改良。步骤如下：断头处死大鼠，游离睾丸并用冷磷酸缓冲液冲洗 3 遍；祛除白膜和血管后置含有 0.03% Ⅰ型胶元酶的McCoy 5 A 培养基中， 37 ℃ 震荡 15 min，加入等量的McCoy 5 A 培养基终止反应。消化液用 300 目不锈钢网过滤，收集过滤液 1000 r/min 离心 10 min，弃上清，沉淀物用McCoy 5 A 培养基洗 2 遍，条件同前。最后沉淀物混悬于 1 ml McCoy 5 A 培养基中。用McCoy 5 A 培养基将等渗Percoll细胞分离液配置成 13 个浓度梯度 (20%～80%)，并依次加入离心管中，将 1 ml 细胞混悬液(约 105 细胞)置细胞分离液顶端， 1 000 g 室温离心 30 min，细胞依据比重不同分为 13 个层面；间质细胞位于第六个密度层面，吸取该层面细胞并用培养基洗 2 遍 (1 000 r/min, 10 min)， 2 ml 培养基悬浮细胞后计数。
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1.2.2 Leydig细胞培养 用含 1% 胎牛血清的McCoy 5 A 培养基将Leydig细胞浓度调整至 105/ml，按每孔 1 ml 接种于 24 孔培养板(Evergreen Scientific 公司，美国)中；培养条件： 5% CO2， 95% 空气， 37 ℃ 饱和水蒸气。
1.3 培养的大鼠Leydig细胞对绒毛膜促性腺激素刺激的反应
1.3.1 不同培养时间的大鼠Leydig细胞对绒毛膜促性腺激素刺激的反应 大鼠Leydig细胞分为 6 组，对照组(A组)及分别在 1～5 d 加入hCG组(B～F组)。以上各组均培养 6 d，各处理组分别在相应时间加入hCG， 24 h 后收集培养液，其余各天均更换培养液；hCG的最终浓度为 30 IU/ml〔5〕。
1.3.2 培养的大鼠Leydig细胞对不同浓度绒毛膜促性腺激素刺激的反应 大鼠Leydig细胞分为 6 组，培养 d 1 加入不同浓度hCG，最终浓度分别为 0 IU/ml； 0.1 IU/ml; 1 IU/ml; 5 IU/ml; 10 IU/ml; 50 IU/ml。 24 h 后收集培养液待测。
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1.4 睾酮测定 采用化学发光法，批内变异系数 5.3%～5.5%，批间变异系数 5.2%～6.7%；可测范围 0.1～50 nmol/L。
1.5 数据及统计学处理 全部数据均采用平均数±标准差(
±s)表示，数据间比较采用F-Q验。2 结 果
2.1 培养的大鼠Leydig细胞形态学观察 接种初期细胞近似圆形，局部有轻度凹陷， 3～4 h 左右贴壁， 6～8 h 一些细胞突起伸展， 12 h 细胞贴壁呈单层生长。典型的Leydig细胞形态呈椭圆形或树叶形，均质色淡，胞质内无明显颗粒，细胞核淡染。细胞纯度可达 80%～95%。
2.2 培养的大鼠Leydig细胞对绒毛膜促性腺激素刺激的反应
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2.2.1 不同培养时间的大鼠Leydig细胞对绒毛膜促性腺激素刺激的反应 在无hCG刺激的情况下，各处理组随着培养时间的延长，睾酮的分泌量逐渐下降；而对hCG刺激的反应也随着时间的延长逐渐减低，增加的绝对值 d 1 约为 8 nmol/L， d 2 约为 8 nmol/L， d 3 降为 2.4 nmol/L，到培养的 d 4 与对照组已无明显差异(附表)。
附表 培养不同时间的Lcydig细胞(105)用hCG(30IU/ml)刺激后睾酮的变化(n＝4，
±s，C/nmol.L-1) 组别培养时间(d)
1
2
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3
4
5
A组
9.8±0.5
4.3±0.2
1.2±0.1
0.9±0.1
0.4±0.1
B组
17.6±0.6**
3.7±0.3*
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0.7±0.1**
0.4±0.1**
0.2±0.1*
C组
9.7±0.6
12.0±1.8**
2.5±0.3**
0.5±0.1**
0.1±0.0**
D组
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9.7±0.8
4.5±0.6
3.6±0.4**
0.7±0.3
0.2±0.0**
E组
9.5±1.2
4.1±0.7
1.0±0.3
0.8±0.2
0.4±0.2
F组
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9.4±0.3
4.3±0.4
1.1±0.1
0.9±0.2
0.5±0.2
与A组比较 * P<0.05； ** P<0.01
2.2.2 培养的大鼠Leydig细胞对不同浓度绒毛膜促性腺激素刺激的反应 hCG为 0 IU/ml 时，睾酮的浓度为 (3.1±0.18) nmol/L；hCG浓度为 1 IU/ml 时，睾酮的分泌量达到高峰 (22.08±2.22) nmol/L；此后随着hCG剂量的增加，睾酮的分泌量反而下降，hCG的浓度为 50 IU/ml 时，睾酮分泌量仅为 (15.95±1.87) nmol/L。
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3 讨 论
以往Leydig细胞的培养所采用的方法是通过胶原酶消化睾丸组织而得到富含Leydig细胞的混悬液〔1，2〕，其中不但有所需要的Leydig细胞，而且还有大量的各级生精细胞和支持细胞，常常不能精确计算Leydig细胞含量，再者其含量也随消化程度不同有所改变；若将富含Leydig细胞的混悬液用于不同处理组之间的比较，则明显的会影响其结果的准确性。所以分离、纯化Leydig细胞是研究其功能变化的基础。Percoll分离液是由包被着聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的二氧化硅胶体微粒构成，无毒，通过高速离心或与常规梯度分离剂混合而形成不同密度梯度，依据分离物的密度不同将其分离开，是一种比较理想的生命物质分离液。Kumar等〔3〕将Percoll配置成不同浓度梯度来分离大鼠Leydig细胞，细胞纯度可以达到 85% 以上。作者依据文献用Percoll分离纯化了大鼠Leydig细胞，纯度也达到 80%～85%。富含Leydig细胞的混悬液通过Percoll分离纯化后其纯度大大提高，为进一步研究Leydig细胞形态和功能变化提供了条件。
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Risberidge等〔6〕用DMEM培养分离、纯化后的大鼠Leydig细胞，并用hCG进行刺激以检验细胞的反应性，结果显示细胞的功能只维持 3 d。本文资料也显示体外培养的Leydig细胞活力随着时间的延长而有所下降，到 d 4 以后基础睾酮分泌和对hCG刺激的反应明显降低，提示此时Leydig细胞基本丧失了分泌睾酮的能力。与Risberidge等报告的结果相似。培养的Leydig细胞之所以出现功能减弱是因为：①细胞失去了促性腺激素的刺激；②纯化后的细胞接近于单一细胞，失去了体内细胞相互作用的环境，缺乏旁分泌所释放的某些促生长刺激因子，如IGF、TGF等〔7〕。本文结果显示培养 d 1 和 d 2 用hCG刺激后睾酮分泌增加的绝对值分别为 8 nmol/L，明显高于 d 3 的 2.4 nmol/L，提示培养的 d 1 和d 2 细胞尚维持正常反应，为刺激的最佳时间，此后则不能真正反映细胞功能变化。
本研究发现小剂量hCG刺激即可以使睾酮的分泌达到高峰，而加大hCG刺激量不但不能使睾酮分泌量增加，反而抑制了其合成。本资料显示，B组用hCG (30 IU/ml) 刺激后 d 3 睾酮分泌量显著低于对照组(P<0.05)，至培养结束仍低于对照组；这种现象也可以见于其余各组。上述现象说明大剂量hCG使Leydig细胞分泌睾酮的功能明显降低，即使细胞出现了失敏感性。细胞失敏感性时睾酮合成过程中的各种酶系功能均受到不同程度的抑制，致使睾酮合成和分泌量下降。有报道认为这种失敏感性需要 6～10 d 才能恢复〔8〕。故此，要获得最大刺激反应，hCG用量不宜太大，按本试验条件 105 个Leydig细胞最佳刺激剂量为 1 IU/ml。
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(本实验得到中国科学院动物研究所庄临之研究员的悉心指导，特致谢)
参考文献
1 向红丁，迟芝盛，庄临之.GnRH-A对雄性大鼠睾丸内分泌功能的抑制作用.中华内分泌代谢杂志，1985，1(1)：45
2 王忠山，王成忠，左之静等.青春期糖尿病大鼠睾丸间质细胞功能和细胞核雄激素受体的影响.中国病理生理杂志，1996，12(6)：575
3 Kumar S, Blumberg D, Canas JA et al. Human Chorionic gonadotropin (hCG) increase cystosolic free calcium in adult rat leydig cells. Cell Calcium, 1994，15:349
, 百拇医药 4 Browning JY, D Agata R, Grotjan Jr HE. Isolation of purified rat leydig cells using continuous Percoll gradients. Endocrinol, 1981， 109:667
5 Lin T, Calkins JH, Morris PL et al. Regulation of Leydig cell Function in primary culture by inhibin and activin. Endocrinol, 1989，125(4):2134
6 Risbridger GP, IIedger MP. Adult rat leydig cell cultures: minimum requirements for maintenan of luteinizing hormone responsiveness and testosterone production. Mole Cell Endocrinol, 1992，83:125
7 Skinner MK. Cell-cell interactions in testis. Endocrinol Rev, 1991，12:45
8 窦京涛，李江源，汪寅章 等.人绒毛膜促性腺激素对大鼠睾丸相关激素受体的影响.中华医学杂志，1994，74(9)：570
(1999—02—02收稿，1999—04—14修回), 百拇医药