氩激光对体外培养牛视网膜色素上皮细胞损伤及其防护的实验研究
作者：何守志 王凤翔 张鲲 黄靖香 顾峥
单位：何守志 王凤翔 张鲲 解放军总医院眼科，北京 100853；黄靖香 顾峥 解放军总医院病理科
关键词：视网膜色素上皮细胞；激光损伤；地塞米松
氩激光对体外培养牛视网膜色素上皮细胞损伤 及其防护的实验研究 摘要 目的：观察不同功率激光对体外培养的牛视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞的损伤以及地塞米松(Dexamethasone, DXM)对激光损伤的保护作用。方法：采用甲基噻唑基四唑(Methylthiazoly tetrazolium, MTT)方法测定不同功率激光照射对RPE细胞的损伤率。并观察在激光照射前后应用 3 种浓度的DXM后，0.8 W 功率的激光对RPE细胞的不同损伤率。结果：激光输出功率越大RPE细胞损伤越重。激光照射前应用DXM可减轻激光对RPE细胞的损伤，而照射后应用则无明显作用。结论：激光对RPE细胞的损伤率与激光输出功率成正相关，激光照射前应用DXM对RPE细胞有保护作用。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R 816.97
The study of the cytotoxic effects of argon laser photocoagulation on cattle pigment epithelium cells and the preservative effection of dexamethsone
He Shouzhi, Wang Fengxiang, Zhang Kun, Huang Jinxing, Gu zheng (Department of Ophthalmology, General Hospital of PLA, Beijing 100853)
Abstract Objective:Observe the cytotoxic effects of argon laser photocoagulationsa on cattle pigment epithelium cells and the protection effect of dexamethsone (Dex) to the RPE cells. Methods:Different power of argon lasers were used to coagulated confluent RPE cells, then the cell killing rates (CKR) were study by MTT assay. we have observed the killing rate of 0.8 W laser after or before use three different concentration Dex also. Results:Different power of lasers have variable CKRs. The CKRs have a line relationship with the laser powers. The use of Dex before laser coagulation could alleviate the effect of laser, but after laser coagulation had no use.Conclusion:The CKRs of laser has positive correlation with its output power. Using Dex before laser coagulation can protect the RPE cells from being killed partly.
, 百拇医药
Key words pigment epithelium cell; laser injury; Dexamethsone
一定功率的氩激光照射人眼及猴眼后，均可引起RPE细胞损伤，受损的RPE细胞脱离Bruch膜，并发生坏死。体外培养的RPE细胞的激光损伤与活体的RPE细胞的损伤基本一致，即RPE细胞立即破裂、坏死〔1〕。但体外培养的融合状态单层色素上皮细胞氩激光照射之后的细胞损伤情况如何，目前尚无文献报道。本实验应用甲基噻唑基四唑(MTT)测定方法初步观察了不同功率的氩激光对RPE细胞的损伤率及不同剂量的地塞米松(DXM)对细胞的保护作用。
1 材料和方法
1.1 材料 ①牛眼球来自宰杀后的北京黑白花奶牛，10 min 内取材。修剪去眼球壁外周的软组织，用少量肥皂水刷洗，并用Hank液反复冲洗后浸泡在含有 200 μm/ml 庆大霉素的Hank液中备用。②氩激光发射仪为NOVUS-2000 型(Coherent InC)； Clinibio 128 型酶标仪(美国产品)；培养液由RPMI 1640 粉剂(GIBCOI Laboratories USA)配制，10% 小牛血清，pH值 7.0～7.4；DXM(江苏扬州制药厂)及甲基噻唑基四唑(Methylthiazolyl tetrazolium, MTT sigma公司)。
, 百拇医药
1.2 方法 ①细胞培养：无菌条件下自锯齿缘靠后剖开眼球，弃去前节，将后节眼球置于眼球托上，除去玻璃体及色素上皮内视网膜感觉部。后节眼杯用Hank液轻轻漂洗、0.25% 胰蛋白酶消化 15～20 min，分离RPE细胞，经离心、洗涤后接种于RPMI 1640 培养液中，于 37 ℃ 5% CO2 卵箱中培养，原代细胞达融合状态后按 1∶3 传代培养，将第四代传代细胞接种于 96 孔培养板中，每孔约 2×104 个细胞，继续培养 24 h 后细胞贴壁生长呈单层融合状态时使用。②分组：损伤实验组按安全随机分组的原则分为 6 组，氩激光照射的输出功率分别为 0.2 W，0.4 W， 0.8 W， 1.6 W 和 2.4 W。另一组空白作对照。药物保护实验分组按完全随机分组的方法分为 2 大组，激光损伤功率均为 0.8 W，分别在光照前 8 h、光照后立即在不同的培养孔中分别加 0.125 mg/ml， 0.25 及 0.5 mg/ml 的DXM，空白对照组用 0.8 W 激光照射后仍加培养液，每一处理因素为3个孔。③激光照射损伤：裂隙灯发射系统Argon蓝绿激光对RPE细胞进行照射，96 孔板下放置黑纸做背景，激光参数：输出功率按分组中的不同要求，光斑直径 200 μm，激光曝光时间 0.2 s，每孔做 50 个光凝斑。④MTT测定及损伤率的计算〔2，3〕：经激光照射及药物处理后(液体量为 100 μL)，每测定孔中加 10 μL 的MTT溶液，37 ℃ 培养箱中培养 4 h。弃去液体后加二甲基亚砜(DMSO) 100 μL，室温下静置 5 min，用酶标仪比色。记录吸光度(A)值[旧称光密度(OD)]并用以下公式计算。
, 百拇医药
损伤率(%)＝(1-实验组A值/对照组A值)
×100%
1.3 数据处理 采用SAS软件方差分析处理。
2 结 果
2.1 不同功率激光对RPE细胞的损伤 不同功率的激光对RPE细胞的损伤率有显著差异(P<0.001)，随着激光输出功率的增加，细胞损伤率明显增高(表 1)。
表1 不同功率激光对RPE细胞的损伤率(
±s)
激光功率(W)
, 百拇医药
损伤率(%)
0.2
5.86±2.13
0.4
16.98±7.48
0.8
28.40±9.50
1.6
35.19±5.56
2.4
40.12±7.01
* 表示与对照组相比有显著差异(F＝0.66；P＝0.0017)
, 百拇医药
2.2 DEX对激光损伤细胞的保护 用药的时间对激光的损伤率有明显影响(P<0.001)，用方差分析处理结果显示，激光照射前用DXM可使损伤率明显降低(P<0.001)，而三种不同剂量的DXM的影响无明显差异(P>0.05)，激光照射后即刻用药则对激光的损伤率无明显影响(P>0.05，表 2)。
表2 不同剂量的DXM对激光损伤的保护作用(±s)
分组
损伤率(%)
对照组
25.61±8.80
, http://www.100md.com 照射后0.125mg/ml DXM组
29.94±5.58
照射后0.250mg/ml DXM组
25.00±7.35
照射后0.500mg/ml DXM组
21.76±8.51
照射前0.125mg/ml DXM组
16.92±6.69*
照射前0.250mg/ml DXM组
11.19±0.70*
, http://www.100md.com
照射前0.500mg/ml DXM组
7.46±2.69*
* 表示与对照组相比差异有显著性意义(F＝9.67；P＝0.0049)
3 讨 论
战争、意外激光照射均可致眼视网膜损伤。短波长光可引起视网膜光化学损伤，并且主要限定于视网膜RPE细胞和感光细胞的外节。研究表明，活体内激光光凝，急性期即可使RPE细胞凝固坏死，RPE屏障崩解。激光损伤的严重性依赖于激光本身的功率，波长，曝光时间，激光类型，组织的吸收以及照射视网膜中的位置〔4〕。本实验只改变激光本身的功率，其他各项条件相同，观察在体外细胞培养条件下，ARGON激光的直接照射造成细胞光凝损伤率与激光输出功率的关系。应用MTT测定法是因为MTT作用于哺乳动物活细胞线粒体内膜中的呼吸链上，与呼吸链有关的酶可将MTT降解形成甲结晶，结晶量与活细胞的数量成正比，MTT结晶分解后呈现颜色，在一定波长下比色定量，能够以比色值判断活细胞数目的多少及损伤程度。本实验结果表明激光对RPE细胞的损伤率与照射激光的输出功率有关，随着激光功率的增加，细胞损伤的比率呈线性上升。
, 百拇医药
有研究结果表明，长期使用皮质类固醇可使猴眼色素上皮在损伤后保持完整，使RPE细胞在普通光损伤的情况下免受损伤，但是对神经视网膜层则无保护作用〔5〕。还有人在组织病理和形态学指标几个方面评价甲泼尼龙对激光所致视网膜损伤的保护作用，发现大剂量的泼尼松龙可阻止细胞的脂质过氧化，减少细胞膜破裂和细胞死亡，尤其在各种损伤中，同时可减少组织修复中的反应，因此对激光损伤的治疗有益〔6〕。目前认为皮质类固醇的重要作用机制是抗炎作用及稳定细胞膜作用。为更好地观察DXM对RPE细胞单独的保护作用，本实验在细胞培养的基础上观察了DXM对体外培养的RPE细胞激光照射损伤的保护，结果表明，光凝前应用一定剂量的DXM对细胞有保护作用，而损伤后即刻用药则无明显的保护作用。提示，DXM可能通过稳定细胞膜作用而提高其损伤阈值发挥其保护作用，但本实验未做长期观察。另外DXM预防激光损伤的作用机制是否与活体内作用机制一致等，还有待于进一步研究。
“九五”军队医药卫生科研基金资助项目，批准号 96M143
, http://www.100md.com
参考文献
1 Del Priore LV, Glaser BM， Quigley HA. Response of pig retinal pigment epithelium to laser photocoagulation in organ culture. Arch Ophthalmol, 1989，107:119
2 陈卫星，季 峰，黄怀德.热疗联合顺铂对人胃癌细胞株细胞毒作用的动力学研究.中华肿瘤杂志，1996，18：116
3 张胜本，周晓武，张连阳.rhTNF对人结肠癌细胞株SW-480 的作用.中华实验外科杂志，1995，12：85
4 Cai Y S, Du X, Xie M. Clincal, pathological and photochemical studies of laser injury of the retina. Health Physics, 1989，56:643
, 百拇医药
5 Parver L M, Auker C R, Fine B S et al. Dexamethasone protection against photochemical retinal injury. Arch Ophthalmol, 1984，102:772
6 Lam TT, Takahashi K, Fu J et al. Methylprednisolone therapy in laser injury of the retina. Graefe′s Arch Clin Exp Ophthalmol, 1993，231:729
(1999—02—04收稿，1999—04—13修回), 百拇医药
单位：何守志 王凤翔 张鲲 解放军总医院眼科，北京 100853；黄靖香 顾峥 解放军总医院病理科
关键词：视网膜色素上皮细胞；激光损伤；地塞米松
氩激光对体外培养牛视网膜色素上皮细胞损伤 及其防护的实验研究 摘要 目的：观察不同功率激光对体外培养的牛视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞的损伤以及地塞米松(Dexamethasone, DXM)对激光损伤的保护作用。方法：采用甲基噻唑基四唑(Methylthiazoly tetrazolium, MTT)方法测定不同功率激光照射对RPE细胞的损伤率。并观察在激光照射前后应用 3 种浓度的DXM后，0.8 W 功率的激光对RPE细胞的不同损伤率。结果：激光输出功率越大RPE细胞损伤越重。激光照射前应用DXM可减轻激光对RPE细胞的损伤，而照射后应用则无明显作用。结论：激光对RPE细胞的损伤率与激光输出功率成正相关，激光照射前应用DXM对RPE细胞有保护作用。
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中国图书资料分类法分类号 R 816.97
The study of the cytotoxic effects of argon laser photocoagulation on cattle pigment epithelium cells and the preservative effection of dexamethsone
He Shouzhi, Wang Fengxiang, Zhang Kun, Huang Jinxing, Gu zheng (Department of Ophthalmology, General Hospital of PLA, Beijing 100853)
Abstract Objective:Observe the cytotoxic effects of argon laser photocoagulationsa on cattle pigment epithelium cells and the protection effect of dexamethsone (Dex) to the RPE cells. Methods:Different power of argon lasers were used to coagulated confluent RPE cells, then the cell killing rates (CKR) were study by MTT assay. we have observed the killing rate of 0.8 W laser after or before use three different concentration Dex also. Results:Different power of lasers have variable CKRs. The CKRs have a line relationship with the laser powers. The use of Dex before laser coagulation could alleviate the effect of laser, but after laser coagulation had no use.Conclusion:The CKRs of laser has positive correlation with its output power. Using Dex before laser coagulation can protect the RPE cells from being killed partly.
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Key words pigment epithelium cell; laser injury; Dexamethsone
一定功率的氩激光照射人眼及猴眼后，均可引起RPE细胞损伤，受损的RPE细胞脱离Bruch膜，并发生坏死。体外培养的RPE细胞的激光损伤与活体的RPE细胞的损伤基本一致，即RPE细胞立即破裂、坏死〔1〕。但体外培养的融合状态单层色素上皮细胞氩激光照射之后的细胞损伤情况如何，目前尚无文献报道。本实验应用甲基噻唑基四唑(MTT)测定方法初步观察了不同功率的氩激光对RPE细胞的损伤率及不同剂量的地塞米松(DXM)对细胞的保护作用。
1 材料和方法
1.1 材料 ①牛眼球来自宰杀后的北京黑白花奶牛，10 min 内取材。修剪去眼球壁外周的软组织，用少量肥皂水刷洗，并用Hank液反复冲洗后浸泡在含有 200 μm/ml 庆大霉素的Hank液中备用。②氩激光发射仪为NOVUS-2000 型(Coherent InC)； Clinibio 128 型酶标仪(美国产品)；培养液由RPMI 1640 粉剂(GIBCOI Laboratories USA)配制，10% 小牛血清，pH值 7.0～7.4；DXM(江苏扬州制药厂)及甲基噻唑基四唑(Methylthiazolyl tetrazolium, MTT sigma公司)。
, 百拇医药
1.2 方法 ①细胞培养：无菌条件下自锯齿缘靠后剖开眼球，弃去前节，将后节眼球置于眼球托上，除去玻璃体及色素上皮内视网膜感觉部。后节眼杯用Hank液轻轻漂洗、0.25% 胰蛋白酶消化 15～20 min，分离RPE细胞，经离心、洗涤后接种于RPMI 1640 培养液中，于 37 ℃ 5% CO2 卵箱中培养，原代细胞达融合状态后按 1∶3 传代培养，将第四代传代细胞接种于 96 孔培养板中，每孔约 2×104 个细胞，继续培养 24 h 后细胞贴壁生长呈单层融合状态时使用。②分组：损伤实验组按安全随机分组的原则分为 6 组，氩激光照射的输出功率分别为 0.2 W，0.4 W， 0.8 W， 1.6 W 和 2.4 W。另一组空白作对照。药物保护实验分组按完全随机分组的方法分为 2 大组，激光损伤功率均为 0.8 W，分别在光照前 8 h、光照后立即在不同的培养孔中分别加 0.125 mg/ml， 0.25 及 0.5 mg/ml 的DXM，空白对照组用 0.8 W 激光照射后仍加培养液，每一处理因素为3个孔。③激光照射损伤：裂隙灯发射系统Argon蓝绿激光对RPE细胞进行照射，96 孔板下放置黑纸做背景，激光参数：输出功率按分组中的不同要求，光斑直径 200 μm，激光曝光时间 0.2 s，每孔做 50 个光凝斑。④MTT测定及损伤率的计算〔2，3〕：经激光照射及药物处理后(液体量为 100 μL)，每测定孔中加 10 μL 的MTT溶液，37 ℃ 培养箱中培养 4 h。弃去液体后加二甲基亚砜(DMSO) 100 μL，室温下静置 5 min，用酶标仪比色。记录吸光度(A)值[旧称光密度(OD)]并用以下公式计算。
, 百拇医药
损伤率(%)＝(1-实验组A值/对照组A值)
×100%
1.3 数据处理 采用SAS软件方差分析处理。
2 结 果
2.1 不同功率激光对RPE细胞的损伤 不同功率的激光对RPE细胞的损伤率有显著差异(P<0.001)，随着激光输出功率的增加，细胞损伤率明显增高(表 1)。
表1 不同功率激光对RPE细胞的损伤率(
±s)激光功率(W)
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损伤率(%)
0.2
5.86±2.13
0.4
16.98±7.48
0.8
28.40±9.50
1.6
35.19±5.56
2.4
40.12±7.01
* 表示与对照组相比有显著差异(F＝0.66；P＝0.0017)
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2.2 DEX对激光损伤细胞的保护 用药的时间对激光的损伤率有明显影响(P<0.001)，用方差分析处理结果显示，激光照射前用DXM可使损伤率明显降低(P<0.001)，而三种不同剂量的DXM的影响无明显差异(P>0.05)，激光照射后即刻用药则对激光的损伤率无明显影响(P>0.05，表 2)。
表2 不同剂量的DXM对激光损伤的保护作用(
±s)分组
损伤率(%)
对照组
25.61±8.80
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29.94±5.58
照射后0.250mg/ml DXM组
25.00±7.35
照射后0.500mg/ml DXM组
21.76±8.51
照射前0.125mg/ml DXM组
16.92±6.69*
照射前0.250mg/ml DXM组
11.19±0.70*
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照射前0.500mg/ml DXM组
7.46±2.69*
* 表示与对照组相比差异有显著性意义(F＝9.67；P＝0.0049)
3 讨 论
战争、意外激光照射均可致眼视网膜损伤。短波长光可引起视网膜光化学损伤，并且主要限定于视网膜RPE细胞和感光细胞的外节。研究表明，活体内激光光凝，急性期即可使RPE细胞凝固坏死，RPE屏障崩解。激光损伤的严重性依赖于激光本身的功率，波长，曝光时间，激光类型，组织的吸收以及照射视网膜中的位置〔4〕。本实验只改变激光本身的功率，其他各项条件相同，观察在体外细胞培养条件下，ARGON激光的直接照射造成细胞光凝损伤率与激光输出功率的关系。应用MTT测定法是因为MTT作用于哺乳动物活细胞线粒体内膜中的呼吸链上，与呼吸链有关的酶可将MTT降解形成甲结晶，结晶量与活细胞的数量成正比，MTT结晶分解后呈现颜色，在一定波长下比色定量，能够以比色值判断活细胞数目的多少及损伤程度。本实验结果表明激光对RPE细胞的损伤率与照射激光的输出功率有关，随着激光功率的增加，细胞损伤的比率呈线性上升。
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有研究结果表明，长期使用皮质类固醇可使猴眼色素上皮在损伤后保持完整，使RPE细胞在普通光损伤的情况下免受损伤，但是对神经视网膜层则无保护作用〔5〕。还有人在组织病理和形态学指标几个方面评价甲泼尼龙对激光所致视网膜损伤的保护作用，发现大剂量的泼尼松龙可阻止细胞的脂质过氧化，减少细胞膜破裂和细胞死亡，尤其在各种损伤中，同时可减少组织修复中的反应，因此对激光损伤的治疗有益〔6〕。目前认为皮质类固醇的重要作用机制是抗炎作用及稳定细胞膜作用。为更好地观察DXM对RPE细胞单独的保护作用，本实验在细胞培养的基础上观察了DXM对体外培养的RPE细胞激光照射损伤的保护，结果表明，光凝前应用一定剂量的DXM对细胞有保护作用，而损伤后即刻用药则无明显的保护作用。提示，DXM可能通过稳定细胞膜作用而提高其损伤阈值发挥其保护作用，但本实验未做长期观察。另外DXM预防激光损伤的作用机制是否与活体内作用机制一致等，还有待于进一步研究。
“九五”军队医药卫生科研基金资助项目，批准号 96M143
, http://www.100md.com
参考文献
1 Del Priore LV, Glaser BM， Quigley HA. Response of pig retinal pigment epithelium to laser photocoagulation in organ culture. Arch Ophthalmol, 1989，107:119
2 陈卫星，季 峰，黄怀德.热疗联合顺铂对人胃癌细胞株细胞毒作用的动力学研究.中华肿瘤杂志，1996，18：116
3 张胜本，周晓武，张连阳.rhTNF对人结肠癌细胞株SW-480 的作用.中华实验外科杂志，1995，12：85
4 Cai Y S, Du X, Xie M. Clincal, pathological and photochemical studies of laser injury of the retina. Health Physics, 1989，56:643
, 百拇医药
5 Parver L M, Auker C R, Fine B S et al. Dexamethasone protection against photochemical retinal injury. Arch Ophthalmol, 1984，102:772
6 Lam TT, Takahashi K, Fu J et al. Methylprednisolone therapy in laser injury of the retina. Graefe′s Arch Clin Exp Ophthalmol, 1993，231:729
(1999—02—04收稿，1999—04—13修回), 百拇医药