五氯酚对人胎盘碱性磷酸酶构象与活力的影响
作者：耿芳宋 童家明 王秀丽
单位：耿芳宋 王秀丽(青岛大学医学院 生化教研室)；童家明(物理教研室，山东 青岛 266021)
关键词：碱性磷酸酶；五氯酚；荧光；构象；活力
中国医学物理学杂志990323 摘要：目的：研究五氯酚对人胎盘碱性磷酸酶构象与活力的影响。材料和方法: 应用荧光光度法检测不同浓度五氯酚溶液中人胎盘碱性磷酸酶的内源荧光发射光谱，用分光光度法测定其活力。结果: 五氯酚浓度小于1.0mmol/L时，平衡态酶的内源荧光发射强度及其活力迅速下降，发射峰位明显红移;继续提高五氯酚浓度，其荧光发射强度与活力逐渐下降，发射峰位仍在缓慢红移;五氯酚浓度增至5.0mmol/L时,荧光淬灭，但酶仍保留51.4%的活力。结论: 五氯酚抑制了酶活力，并使其构象发生了改变,但其整体构象并未破坏。
中国分类号：Q566 文献标识码：A 文章编号：1005-202X(1999)03-0187-02
, http://www.100md.com
The effect of pentachlorophenol on the conformation and catalytic activity of human placental alkaline phosphatase
GENG Fang-song1, TONG Jia-ming2, WANG Xiu-li1
(Department of Biochemistry, Qingdao Medical College, Shandong Qingdao, 266021,China)
Abstract: Purpose: To study the effect of pentachlorophenol (PCP) on the conformation and catalytic activity of human placental alkaline phosphatase (PLAP,E.C. 3.1.3.1). Method: Fluorometry was used to observe the intrinsic fluorescence emission spectra, and spectrophotometry was used to measure the activity of PLAP in PCP solutions of different concentrations. Result: The PCP concentrations lower than 1.0mmol/L, the enzyme activity and fluorescence intensity rapidly decreases with a marked red shift of emission maximum .The PCP concentrations higherthan 1.0mmol/L,the enzyme activiy and fluoresence intensity gradually decreases with a continuous red shift of emission maximum in PCP solutions of increasing concentrations. At 5.0mmol/L PCP, the enzyme intrinsic fluorescence quenched and the enzyme activity is 51.4%. Conclusion: The PLAP activity is inhibited and its conformation is changed, Whereas the whole conformation of the enzyme is not disrupted by PCP.
, 百拇医药
Key words: alkaline phosphatase; pentachlorophenol; fluorescence; conformation;activity
五氯酚 (Pentachlorophenol,PCP)广泛用于血防灭钉螺、木材防腐、杀菌消毒及防霉等方面，是一种环境污染剂，对动植物和人体均有较大的毒性[1-3]。人胎盘碱性磷酸酶( Placental alkaline phosphatase，PLAP， E.C.3.1.3.1)是位于晚期胎盘细胞膜上的一种糖蛋白，是一个新进化的基因产物[4]；PLAP除了其催化功能外，还是某些物质(如IgG、软骨基质蛋白等)进入胎儿的受体，与胎儿的发育有关[5]。本文通过观测不同浓度PCP溶液中人PLAP内源荧光光谱与活力的变化，以探讨PCP对人PLAP构象与活力的影响，旨在为PCP中毒的防治提供科学资料。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 试剂
DEAE-纤维素系上海试剂二厂产品；DEAE-Sephadex A-50系Pharmacia公司产品；Tris为Sigma公司产品；对硝基酚磷酸二钠(PNPP)为Merck公司产品；PCP为上海试剂一厂产品,分析纯,用无水乙醇配制；其它试剂均为国产分析纯，用双蒸水配制。
1.2 人PLAP的提纯及纯度鉴定
人PLAP按文献[6]的方法提纯。纯化酶经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一区带；反相高压液相色谱分析为单一对称峰。酶浓度用紫外吸收法[6](ε280=1.0mg/ml/cm)测定。
1.3 平衡态酶荧光光谱检测
人PLAP内源荧光光谱的检测在LS- 50型荧光分光光度计上进行。 测定体系含酶19.9
, 百拇医药
μg/ml，100mmol/L，pH9.9 Tris-HCl缓冲液及0～5.0mmol/L的指定浓度的PCP，混匀，20 ℃保温4小时至平衡态。25 ℃恒温下，用280 nm波长激发，监测300～410 nm的发射光谱。用含相应浓度的PCP缓冲液进行校正。
1.4 平衡态酶活力的测定
按文献[7]的方法进行。测活体系中含5mmol/L PNPP,100mmol/L，pH9.9 Tris-HCl缓冲液，2mmol/LMgCl2及0～5.0mmol/L的指定浓度的PCP于25 ℃，用岛津UV-260型分光光度计测定，比色皿光径为1 cm，测定波长为405nm。平衡态酶的终浓度为0.36 μg/ml。测定时，测活体系于25 ℃保温5min，加入平衡态酶液后，混匀，检测其吸光度的变化，按其吸光度的变化值计算酶活力。
2 结果与讨论
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图1表示人PLAP在不同浓度PCP溶液中内源荧光强度和最大发射波长的变化；图2表示人PLAP在不同浓度PCP溶液中活力的变化。由图1和图2可见，PCP浓度小于1.0mmol/L时，酶荧光强度及其活力迅速下降,最大发射峰位明显红移；当PCP浓度大于1.0mmol/L时，荧光强度及其活力缓慢下降,最大发射峰位红移减少；当PCP浓度为5.0mmol/L时，荧光淬灭，但酶仍保留了51.4%的活力。
图1 不同浓度五氯酚溶液中人PLAP的内源荧光变化。酶浓度19.9μg/ml，激发波长280 nm，扫描范围300～410nm，测定温度25 ℃
曲线: 1 最大发射波长， 2 相对荧光强度(%)。
图2 不同浓度五氯酚溶液中人PLAP的活力变化。酶浓度0.36 μg/ml,测定温度25 ℃
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PLAP其溶解形式为二聚体，每个亚基含有4个色氨酸残基和16个酪氨酸残基[8]； 观测这些残基所产生的荧光变化，可以揭示其构象变化的概况。结果显示，PCP使酶的荧光强度下降，发射峰位红移；PCP浓度为5.0mmol/L时，荧光淬灭。这可能是因为PCP是一种脂溶性物质，能够进入酶分子内部，改变了其分子内部色氨酸的微环境，导致色氨酸荧光强度下降，发射峰位红移，并最终使其荧光淬灭。 由于PCP进入酶分子内部而使其构象发生了改变，故使酶活力下降。但此时酶的整体构象并未受到破坏,其理由有二,一是在此测定条件下,酶的整体构象破坏应伴有荧光强度的增强[7]；二是当PCP浓度为5.0mmol/L时，虽然酶的荧光淬灭，但它仍然保留了51.4%的活力。
由于PCP是胎盘细胞膜上的一个组分，其构象的变化不仅使酶的功能发生改变，也可导致胎盘细胞膜的结构和功能发生改变，这些改变对胎儿的正常发育必然产生某些不良影响，为此孕妇应避免接触PCP。
, 百拇医药
基金项目：山东省卫生厅科研基金资助课题
参考文献：
[1] 拓培祥,于广英,胡世和.一起五氯酚钠引起的急性中毒[J].解放军预防医学杂志,1990,8(2):172.
[2] 李海东,崔永立,朱国友,等.一起五氯酚钠污染水源的调查报告[J]. 环境与健康杂志,1995,12(1):9.
[3] 顾志华,邵荣.急性五氯酚钠中毒12例[J]. 人民军医,1990,31(10):27.
[4] Fishman WH.Alkaline phosphatase isozyme:recent progress[J].Clin Biochem,1990,23:99.
[5] Makiya R,Stigbrand T. Placental Alkaline phosphatase as the placental IgG receptor[J]. Clin Chem,1992,38(12):2543.
, http://www.100md.com
[6] 耿芳宋,王秀丽，张金玉，等.人类胎盘碱性磷酸酶的分离纯化[J].青岛医学院学报,1998，34(2):84.
[7] 耿芳宋，王秀丽，童家明，等.盐酸胍对人类胎盘碱性磷酸酶构象与活力的影响[J].生物物理学报，1998，14(3):385.
[8] Millan JL. Molecular cloning sequence analysis of human placental alkaline phosphatase[J].J Biol Chem, 1986,261:3112.
收稿日期：1998-12-24, http://www.100md.com
单位：耿芳宋 王秀丽(青岛大学医学院 生化教研室)；童家明(物理教研室，山东 青岛 266021)
关键词：碱性磷酸酶；五氯酚；荧光；构象；活力
中国医学物理学杂志990323 摘要：目的：研究五氯酚对人胎盘碱性磷酸酶构象与活力的影响。材料和方法: 应用荧光光度法检测不同浓度五氯酚溶液中人胎盘碱性磷酸酶的内源荧光发射光谱，用分光光度法测定其活力。结果: 五氯酚浓度小于1.0mmol/L时，平衡态酶的内源荧光发射强度及其活力迅速下降，发射峰位明显红移;继续提高五氯酚浓度，其荧光发射强度与活力逐渐下降，发射峰位仍在缓慢红移;五氯酚浓度增至5.0mmol/L时,荧光淬灭，但酶仍保留51.4%的活力。结论: 五氯酚抑制了酶活力，并使其构象发生了改变,但其整体构象并未破坏。
中国分类号：Q566 文献标识码：A 文章编号：1005-202X(1999)03-0187-02
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The effect of pentachlorophenol on the conformation and catalytic activity of human placental alkaline phosphatase
GENG Fang-song1, TONG Jia-ming2, WANG Xiu-li1
(Department of Biochemistry, Qingdao Medical College, Shandong Qingdao, 266021,China)
Abstract: Purpose: To study the effect of pentachlorophenol (PCP) on the conformation and catalytic activity of human placental alkaline phosphatase (PLAP,E.C. 3.1.3.1). Method: Fluorometry was used to observe the intrinsic fluorescence emission spectra, and spectrophotometry was used to measure the activity of PLAP in PCP solutions of different concentrations. Result: The PCP concentrations lower than 1.0mmol/L, the enzyme activity and fluorescence intensity rapidly decreases with a marked red shift of emission maximum .The PCP concentrations higherthan 1.0mmol/L,the enzyme activiy and fluoresence intensity gradually decreases with a continuous red shift of emission maximum in PCP solutions of increasing concentrations. At 5.0mmol/L PCP, the enzyme intrinsic fluorescence quenched and the enzyme activity is 51.4%. Conclusion: The PLAP activity is inhibited and its conformation is changed, Whereas the whole conformation of the enzyme is not disrupted by PCP.
, 百拇医药
Key words: alkaline phosphatase; pentachlorophenol; fluorescence; conformation;activity
五氯酚 (Pentachlorophenol,PCP)广泛用于血防灭钉螺、木材防腐、杀菌消毒及防霉等方面，是一种环境污染剂，对动植物和人体均有较大的毒性[1-3]。人胎盘碱性磷酸酶( Placental alkaline phosphatase，PLAP， E.C.3.1.3.1)是位于晚期胎盘细胞膜上的一种糖蛋白，是一个新进化的基因产物[4]；PLAP除了其催化功能外，还是某些物质(如IgG、软骨基质蛋白等)进入胎儿的受体，与胎儿的发育有关[5]。本文通过观测不同浓度PCP溶液中人PLAP内源荧光光谱与活力的变化，以探讨PCP对人PLAP构象与活力的影响，旨在为PCP中毒的防治提供科学资料。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 试剂
DEAE-纤维素系上海试剂二厂产品；DEAE-Sephadex A-50系Pharmacia公司产品；Tris为Sigma公司产品；对硝基酚磷酸二钠(PNPP)为Merck公司产品；PCP为上海试剂一厂产品,分析纯,用无水乙醇配制；其它试剂均为国产分析纯，用双蒸水配制。
1.2 人PLAP的提纯及纯度鉴定
人PLAP按文献[6]的方法提纯。纯化酶经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一区带；反相高压液相色谱分析为单一对称峰。酶浓度用紫外吸收法[6](ε280=1.0mg/ml/cm)测定。
1.3 平衡态酶荧光光谱检测
人PLAP内源荧光光谱的检测在LS- 50型荧光分光光度计上进行。 测定体系含酶19.9
, 百拇医药
μg/ml，100mmol/L，pH9.9 Tris-HCl缓冲液及0～5.0mmol/L的指定浓度的PCP，混匀，20 ℃保温4小时至平衡态。25 ℃恒温下，用280 nm波长激发，监测300～410 nm的发射光谱。用含相应浓度的PCP缓冲液进行校正。
1.4 平衡态酶活力的测定
按文献[7]的方法进行。测活体系中含5mmol/L PNPP,100mmol/L，pH9.9 Tris-HCl缓冲液，2mmol/LMgCl2及0～5.0mmol/L的指定浓度的PCP于25 ℃，用岛津UV-260型分光光度计测定，比色皿光径为1 cm，测定波长为405nm。平衡态酶的终浓度为0.36 μg/ml。测定时，测活体系于25 ℃保温5min，加入平衡态酶液后，混匀，检测其吸光度的变化，按其吸光度的变化值计算酶活力。
2 结果与讨论
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图1表示人PLAP在不同浓度PCP溶液中内源荧光强度和最大发射波长的变化；图2表示人PLAP在不同浓度PCP溶液中活力的变化。由图1和图2可见，PCP浓度小于1.0mmol/L时，酶荧光强度及其活力迅速下降,最大发射峰位明显红移；当PCP浓度大于1.0mmol/L时，荧光强度及其活力缓慢下降,最大发射峰位红移减少；当PCP浓度为5.0mmol/L时，荧光淬灭，但酶仍保留了51.4%的活力。
图1 不同浓度五氯酚溶液中人PLAP的内源荧光变化。酶浓度19.9μg/ml，激发波长280 nm，扫描范围300～410nm，测定温度25 ℃
曲线: 1 最大发射波长， 2 相对荧光强度(%)。
图2 不同浓度五氯酚溶液中人PLAP的活力变化。酶浓度0.36 μg/ml,测定温度25 ℃
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PLAP其溶解形式为二聚体，每个亚基含有4个色氨酸残基和16个酪氨酸残基[8]； 观测这些残基所产生的荧光变化，可以揭示其构象变化的概况。结果显示，PCP使酶的荧光强度下降，发射峰位红移；PCP浓度为5.0mmol/L时，荧光淬灭。这可能是因为PCP是一种脂溶性物质，能够进入酶分子内部，改变了其分子内部色氨酸的微环境，导致色氨酸荧光强度下降，发射峰位红移，并最终使其荧光淬灭。 由于PCP进入酶分子内部而使其构象发生了改变，故使酶活力下降。但此时酶的整体构象并未受到破坏,其理由有二,一是在此测定条件下,酶的整体构象破坏应伴有荧光强度的增强[7]；二是当PCP浓度为5.0mmol/L时，虽然酶的荧光淬灭，但它仍然保留了51.4%的活力。
由于PCP是胎盘细胞膜上的一个组分，其构象的变化不仅使酶的功能发生改变，也可导致胎盘细胞膜的结构和功能发生改变，这些改变对胎儿的正常发育必然产生某些不良影响，为此孕妇应避免接触PCP。
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基金项目：山东省卫生厅科研基金资助课题
参考文献：
[1] 拓培祥,于广英,胡世和.一起五氯酚钠引起的急性中毒[J].解放军预防医学杂志,1990,8(2):172.
[2] 李海东,崔永立,朱国友,等.一起五氯酚钠污染水源的调查报告[J]. 环境与健康杂志,1995,12(1):9.
[3] 顾志华,邵荣.急性五氯酚钠中毒12例[J]. 人民军医,1990,31(10):27.
[4] Fishman WH.Alkaline phosphatase isozyme:recent progress[J].Clin Biochem,1990,23:99.
[5] Makiya R,Stigbrand T. Placental Alkaline phosphatase as the placental IgG receptor[J]. Clin Chem,1992,38(12):2543.
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[6] 耿芳宋,王秀丽，张金玉，等.人类胎盘碱性磷酸酶的分离纯化[J].青岛医学院学报,1998，34(2):84.
[7] 耿芳宋，王秀丽，童家明，等.盐酸胍对人类胎盘碱性磷酸酶构象与活力的影响[J].生物物理学报，1998，14(3):385.
[8] Millan JL. Molecular cloning sequence analysis of human placental alkaline phosphatase[J].J Biol Chem, 1986,261:3112.
收稿日期：1998-12-24, http://www.100md.com