Nd:YAG温热疗法与Ar+激光PDT联合对小鼠S180肉瘤DNA含量的影响研究
作者：李晓原 云径平 谭润初 魏华江
单位：李晓原, 谭润初(中山医科大学 激光医学研究室, 广东 广州 510089)；云径平(中山医科大学 附属肿瘤医院，广东 广州 510060)；魏华江(广东药学院 物理教研室，广东 广州 510224)
关键词：光动力学疗法；激光温热疗法；Ar+激光；Nd:YAG激光；DNA
中国医学物理学杂志990309 摘要： 目的∶本文研究了Nd:YAG激光温热疗法与Ar+激光光动力学疗法联合对小鼠S180肉瘤DNA含量的影响。材料与方法∶实验分为激光温热疗法组、Ar+激光光动力学组、联合作用组及对照组等四组。激光温热疗法用Nd:YAG激光照射肿瘤，功率密度约为424 mW/cm2，控制肿瘤边缘温度为43 ℃照射30 min；Ar+光动力学疗法为激光照射前24小时小鼠腹腔注射HpD (10mg/kg)，以功率为150 mW/cm2 的Ar+ 激光照射15 min，联合作用为Ar+激光光动力学疗法后立刻行激光温热疗法。结果∶在所选定的剂量下，联合作用组的肿瘤DNA含量最小。结论∶联合作用对肿瘤的抑制途径之一是对肿瘤细胞中DNA光敏作用。
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中图分类号：R318 文献标识码：A 文章编号：1005-202X(1999)03-0151-03
Effect of laserthermia induced by ND:YAG laser and photodynamic therapy by Ar+ laser radiation in combination on the DNA of transplanted tumor in mice
LI Xiao-yuan , YUN Jin-ping , TAN Run-chu , et al.
(Department of Laser Medicine., Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510089, China )
, 百拇医药
Abstract∶ Purpose: The present paper reports the effect of laserthermia (HT) induced by Nd:YAG laser and photodynamic therapy (PDT) by Ar+ laser radiation in combination on the DNA of transplanted sarcoma 180 in mice. Material and Methods: The DNA contant of tumor cell were measured with microspectrophotometry after treatment. Tumor-bearing mice were divided into four groups: (A) control group, (B) HT group, (C) PDT group and (D) PDT followed by HT group. HT was induced by Nd:YAG laser radiation and the temperature in tumor edge was control at 43 ℃ (about 424 mW/cm2) for 30 minutes. Tumor-bearing mice of group C and D were given an i.p. injection of HpD (10mg/kg) 24 hours prior to Ar+ laser radiation (150 mW/cm2 for 15 min.) . Results: The experiments show the DNA contents of tumor cells in the four groups are of statistical significance， with that of Group D being the lowest. Conclusion: The decreasing of DNA content of tumor cell may be one of the reasons of the synergism effects of Nd:YAG laser induced laserthermia and Ar+ photodyanmic. It is recommended that the method be studied further based on the experimental results.
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Key words∶photodynamic therapy； laserthermia；Ar+ laser； Nd:YAG laser； DNA
光动力学疗法(Photodynamic Therapy, PDT)不但可用于各种体表肿瘤的治疗，也可利用光纤与内镜配合进入腔内治疗肿瘤，已在临床上得到广泛应用并取得良好的效果[1,2]。
血卟啉衍生物(Hematoporphyrin Derivative，HpD)光动力学疗法常见的照射光源是波长为630nm的染料激光，近年来采用波长为514.5nm的Ar+照射引起人们的关注[3,4]。而有关Nd:YAG温热疗法与Ar+激光光动力学疗法联合作用对肿瘤细胞DNA含量影响的研究笔者尚未见报道。为此，本文以小鼠S180肉瘤为研究对象，观察了Nd:YAG激光温热疗法与Ar+激光光动力学疗法联合对小鼠S180肉瘤DNA含量的影响，以探讨联合作用的途径。
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1 材料与方法
1.1 光源系统
DJ-11型多功能Nd:YAG激光治疗机，波长1060nm，功率0～100 W连续可调，石英光纤400 μm耦合输出；360型氩离子激光器，波长514.5nm，功率0～10 W连续可调，石英光纤400 μm耦合输出；波长为632.8nm的He-Ne激光作Nd:YAG激光的指示光源。
1.2 动物模型
健康雄性昆明小鼠28只，体重(20±2) g，瘤株为腹水传代7天的小鼠S180肉瘤，由中山医科大学肿瘤研究所提供。每只小鼠近右腋窝皮下注射0.2ml稀释液约含6×106个瘤细胞。待肿瘤长至直径约10mm时用于实验。
1.3 处理方法
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荷瘤小鼠随机分成4组，每组7只，照射前肿瘤局部用8%硫化钠脱毛。
A组∶对照组，光纤末端激光输出功率为零。
B组∶Nd:YAG激光温热疗法组，实验时选用波长为1060nm的Nd:YAG激光，He-Ne激光同轴输出作指示光源，光纤输出垂直照射，光斑直径15mm，功率密度据实验确定为424 mW/cm2。同时，用针状热电偶插入肿瘤边缘皮下约1mm，调节激光输出，使肿瘤边缘温度为43℃，照射时间为30 min。
C组∶Ar+激光PDT组，实验选用波长为514.5nm连续输出的Ar+激光作光动力学疗法的照射光源。于照射前24小时给荷瘤小鼠腹腔注射10mg/kg光敏剂HpD((每支25 ml，5mg/ml))，并避光至照射时。光纤输出垂直照射，光斑直径12mm，功率密度由实验确定为150 mW/cm2，照射时间为15 min。
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D组∶联合作用组，联合作用为在PDT后立刻进行Nd:YAG激光温热疗法。
1.4 肿瘤细胞DNA含量测定
激光照射后24时，将小鼠处死，剥下肿瘤立刻放入Carnoy氏液固定并作常规脱水处理，制成厚4 μm的石腊切片。并将各组肿瘤样品用Feulgen 试剂反应染色。用西德Leitz公司产的MPV III型显微分光光度计测定肿瘤细胞DNA。采用双波法测定[5]，根据所测量细胞核Feulgen-DNA染色吸收光谱，选择峰值波长560nm和半峰值波长495nm作为测量用的染色染色光波长。每个切片测量70个细胞，每组测定490个细胞的DNA含量，由与显微分光光度计联机的计算机直接记录、计算和打印结果。本实验采用吸收度作为DNA相对量，单位是A.U.(Arbitary Unit)， 即任意单位。
1.5 数据处理
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所有数据均输入计算机，调用SPSS 8.0 for Windows统计软件包进行统计学处理。
2 结果
表1 不同处理组S180肿瘤细胞内DNA含量 group
No. of cells
Absorption
P
P*
A
490
3.24±0.21
B
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490
2.83±0.21
<0.01
<0.01
C
490
2.43±0.13
<0.01
<0.01
D
490
1.87±0.15
<0.01
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注∶P为处理组与对照组比较；P*为与联合作用组比较
由表1可见三个处理组的瘤细胞DNA平均吸收度均低于对照组(P<0.01)。其中又以联合作用的D组为最低，说明Nd:YAG激光照射及注射光敏剂HpD进行Ar+激光照射后，肿瘤细胞内DNA含量明显减少，而两者联合作用时肿瘤细胞内DNA含量减少的幅度最大。
3 讨论
光动力学疗法是70年代发展的一种激光治疗肿瘤的方法，激光温热疗法则是近年来发展起来的新的激光治疗肿瘤的方法。两种杀伤肿瘤细胞的机制不同。光动力学疗法目前常用的光敏剂为血卟啉衍生物(HpD)，照射光源有波长为630nm的染料激光，或波长为630nm的金蒸汽激光。由于前两种激光设备复杂，成本高，并且HpD对630nm吸收较小，因此有些近年来学者采用波长为514.5nm的Ar+激光照射HpD治疗肿瘤。孙振权等[3]比较了染料激光和Ar+激光进行光动力学治疗鼻咽癌的疗效，认为Ar+激光比630nm的染料激光照射疗效更明显，但Ar+激光对组织的穿透能力较差，难以作深部治疗。Nd:YAG激光则具有穿透能力大的特点，因此作为激光温热疗法的光源。光动力学疗法的最基本原理是HpD分子吸收一定波长的激光后产生单态氧(1O2)而破坏肿瘤细胞。未吸收激光的HpD不可能发生光动力学反应。由于Ar+激光穿透组织深度较小，故对深部肿瘤细胞则难以达到杀伤作用。而Nd:YAG激光由于穿透深度大，因此，联合作用可使Ar+激光光动力学疗法作用不能杀伤的深部肿瘤细胞在Nd:YAG激光照射下变性坏死。Nd:YAG激光还可能使Ar+激光动力学疗法作用后造成的肿瘤细胞亚致死性损伤或潜在性致死损伤的修复在激光照射产生的热作用下中止或减弱。这样，杀伤效果增强，疗效提高。
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很多研究结果表明，光敏作用直接影响肿瘤细胞的DNA，DNA是光敏治癌的一个靶分子。Evensen用含有HpD的培养基培养癌细胞，光照后观察到细胞中染色体的断裂和畸变[6]。Malik观察到经卟啉光敏反应后瘤细胞内RNA和DNA经光照后几乎有50%的肿瘤细胞的DNA和RNA受到抑制[7]。黄卓恒等[8]测得肿瘤组织在受到HpD光敏作用后癌细胞内DNA的吸收率明显下降。本实验对Ar+激光光动力学疗法作用后24小时肿瘤细胞DNA含量测定结果表明，DNA相对吸收度比对照组明显下降，与上述研究结果一致。另外，高温能抑制细胞DNA合成[9]。本实验采用Nd:YAG温热疗法作用后24小时，瘤细胞DNA含量(吸收度)与对照组相比也有明显降低，而Nd:YAG激光温热疗法与Ar+激光光动力学疗法联合使用后24小时肿瘤细胞的DNA含量与单独作用相比降低更为明显(P<0.01)，说明联合作用产生协同性效应的原因之一可能是增强了对肿瘤细胞DNA的损伤，这种损伤使DNA合成受到干扰和抑制，导致DNA修复能力失调，DNA在自我复制、转录、翻译过程中受到各种干扰而含量下降，致使肿瘤细胞活动明显下降，最终发生代谢功能失调，以致细胞大量死亡。
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本研究结果表明，Nd:YAG激光温热疗法与Ar+激光光动力学疗法联合作用的途径之一为对肿瘤细胞中DNA的光敏作用。这些结果对两者联合作用机理研究及临床应用提供参考。
参考文献∶
[1] Fisher AMR,Murphree AL, Gomer CJ.Clinical and preclinical photodynamic therapy [J].Laser Surg Med,1995,17(1):2-31.
[2] Hillegersberg RV, Kort WJ, Wilson JHP.Current status of photodynamic therapy in oncology[J].Drugs.1994;48(4):510-527.
[3] 孙振权,罗国仪.不同光源进行光动力学治疗鼻咽癌的探讨—137例分析[J].中华肿瘤杂志,1992,14(4):290-292.
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[4] 郭友池,李希华,丁华野,等.氩离子激光改良法光动力学治疗浅表膀胱肿瘤(实验研究与临床分析)[J].激光杂志,1990,11(6):305.
[5] 陈其斯,袁中兴.骨折愈合过程中骨痂内修复细胞DNA含量的观察[J].中华医学杂志,1990，70(1):19.
[6] Evensen JF, Moan J.Photodynamic action and chromosomal damage: A comparison of hematoporphrion Derivative (HpD) and light with X-Irradiation [J].Br J Cancer, 1982,45(3):456-465.
[7] Malik Z, Djaldetti M.Destruction of erythroleukemia and Burkitt lymphoma cells by photoactivated protoporphrin[J].Int J Cancer,1980,26(4):495-500.
[8] 黄卓坦，丁华野，郭友池，等. PSD-007光敏剂辐照小鼠H22肝癌DNA含量测定[J].中华理疗杂志,1986,8(4):198-200.
[9] 赵彼得,郭新娜.高频透热治癌[M].北京:人民军医出版社,1994,84.
收稿日期：1999-02-16, 百拇医药
单位：李晓原, 谭润初(中山医科大学 激光医学研究室, 广东 广州 510089)；云径平(中山医科大学 附属肿瘤医院，广东 广州 510060)；魏华江(广东药学院 物理教研室，广东 广州 510224)
关键词：光动力学疗法；激光温热疗法；Ar+激光；Nd:YAG激光；DNA
中国医学物理学杂志990309 摘要： 目的∶本文研究了Nd:YAG激光温热疗法与Ar+激光光动力学疗法联合对小鼠S180肉瘤DNA含量的影响。材料与方法∶实验分为激光温热疗法组、Ar+激光光动力学组、联合作用组及对照组等四组。激光温热疗法用Nd:YAG激光照射肿瘤，功率密度约为424 mW/cm2，控制肿瘤边缘温度为43 ℃照射30 min；Ar+光动力学疗法为激光照射前24小时小鼠腹腔注射HpD (10mg/kg)，以功率为150 mW/cm2 的Ar+ 激光照射15 min，联合作用为Ar+激光光动力学疗法后立刻行激光温热疗法。结果∶在所选定的剂量下，联合作用组的肿瘤DNA含量最小。结论∶联合作用对肿瘤的抑制途径之一是对肿瘤细胞中DNA光敏作用。
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中图分类号：R318 文献标识码：A 文章编号：1005-202X(1999)03-0151-03
Effect of laserthermia induced by ND:YAG laser and photodynamic therapy by Ar+ laser radiation in combination on the DNA of transplanted tumor in mice
LI Xiao-yuan , YUN Jin-ping , TAN Run-chu , et al.
(Department of Laser Medicine., Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510089, China )
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Abstract∶ Purpose: The present paper reports the effect of laserthermia (HT) induced by Nd:YAG laser and photodynamic therapy (PDT) by Ar+ laser radiation in combination on the DNA of transplanted sarcoma 180 in mice. Material and Methods: The DNA contant of tumor cell were measured with microspectrophotometry after treatment. Tumor-bearing mice were divided into four groups: (A) control group, (B) HT group, (C) PDT group and (D) PDT followed by HT group. HT was induced by Nd:YAG laser radiation and the temperature in tumor edge was control at 43 ℃ (about 424 mW/cm2) for 30 minutes. Tumor-bearing mice of group C and D were given an i.p. injection of HpD (10mg/kg) 24 hours prior to Ar+ laser radiation (150 mW/cm2 for 15 min.) . Results: The experiments show the DNA contents of tumor cells in the four groups are of statistical significance， with that of Group D being the lowest. Conclusion: The decreasing of DNA content of tumor cell may be one of the reasons of the synergism effects of Nd:YAG laser induced laserthermia and Ar+ photodyanmic. It is recommended that the method be studied further based on the experimental results.
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Key words∶photodynamic therapy； laserthermia；Ar+ laser； Nd:YAG laser； DNA
光动力学疗法(Photodynamic Therapy, PDT)不但可用于各种体表肿瘤的治疗，也可利用光纤与内镜配合进入腔内治疗肿瘤，已在临床上得到广泛应用并取得良好的效果[1,2]。
血卟啉衍生物(Hematoporphyrin Derivative，HpD)光动力学疗法常见的照射光源是波长为630nm的染料激光，近年来采用波长为514.5nm的Ar+照射引起人们的关注[3,4]。而有关Nd:YAG温热疗法与Ar+激光光动力学疗法联合作用对肿瘤细胞DNA含量影响的研究笔者尚未见报道。为此，本文以小鼠S180肉瘤为研究对象，观察了Nd:YAG激光温热疗法与Ar+激光光动力学疗法联合对小鼠S180肉瘤DNA含量的影响，以探讨联合作用的途径。
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1 材料与方法
1.1 光源系统
DJ-11型多功能Nd:YAG激光治疗机，波长1060nm，功率0～100 W连续可调，石英光纤400 μm耦合输出；360型氩离子激光器，波长514.5nm，功率0～10 W连续可调，石英光纤400 μm耦合输出；波长为632.8nm的He-Ne激光作Nd:YAG激光的指示光源。
1.2 动物模型
健康雄性昆明小鼠28只，体重(20±2) g，瘤株为腹水传代7天的小鼠S180肉瘤，由中山医科大学肿瘤研究所提供。每只小鼠近右腋窝皮下注射0.2ml稀释液约含6×106个瘤细胞。待肿瘤长至直径约10mm时用于实验。
1.3 处理方法
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荷瘤小鼠随机分成4组，每组7只，照射前肿瘤局部用8%硫化钠脱毛。
A组∶对照组，光纤末端激光输出功率为零。
B组∶Nd:YAG激光温热疗法组，实验时选用波长为1060nm的Nd:YAG激光，He-Ne激光同轴输出作指示光源，光纤输出垂直照射，光斑直径15mm，功率密度据实验确定为424 mW/cm2。同时，用针状热电偶插入肿瘤边缘皮下约1mm，调节激光输出，使肿瘤边缘温度为43℃，照射时间为30 min。
C组∶Ar+激光PDT组，实验选用波长为514.5nm连续输出的Ar+激光作光动力学疗法的照射光源。于照射前24小时给荷瘤小鼠腹腔注射10mg/kg光敏剂HpD((每支25 ml，5mg/ml))，并避光至照射时。光纤输出垂直照射，光斑直径12mm，功率密度由实验确定为150 mW/cm2，照射时间为15 min。
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D组∶联合作用组，联合作用为在PDT后立刻进行Nd:YAG激光温热疗法。
1.4 肿瘤细胞DNA含量测定
激光照射后24时，将小鼠处死，剥下肿瘤立刻放入Carnoy氏液固定并作常规脱水处理，制成厚4 μm的石腊切片。并将各组肿瘤样品用Feulgen 试剂反应染色。用西德Leitz公司产的MPV III型显微分光光度计测定肿瘤细胞DNA。采用双波法测定[5]，根据所测量细胞核Feulgen-DNA染色吸收光谱，选择峰值波长560nm和半峰值波长495nm作为测量用的染色染色光波长。每个切片测量70个细胞，每组测定490个细胞的DNA含量，由与显微分光光度计联机的计算机直接记录、计算和打印结果。本实验采用吸收度作为DNA相对量，单位是A.U.(Arbitary Unit)， 即任意单位。
1.5 数据处理
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所有数据均输入计算机，调用SPSS 8.0 for Windows统计软件包进行统计学处理。
2 结果
表1 不同处理组S180肿瘤细胞内DNA含量 group
No. of cells
Absorption
P
P*
A
490
3.24±0.21
B
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490
2.83±0.21
<0.01
<0.01
C
490
2.43±0.13
<0.01
<0.01
D
490
1.87±0.15
<0.01
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注∶P为处理组与对照组比较；P*为与联合作用组比较
由表1可见三个处理组的瘤细胞DNA平均吸收度均低于对照组(P<0.01)。其中又以联合作用的D组为最低，说明Nd:YAG激光照射及注射光敏剂HpD进行Ar+激光照射后，肿瘤细胞内DNA含量明显减少，而两者联合作用时肿瘤细胞内DNA含量减少的幅度最大。
3 讨论
光动力学疗法是70年代发展的一种激光治疗肿瘤的方法，激光温热疗法则是近年来发展起来的新的激光治疗肿瘤的方法。两种杀伤肿瘤细胞的机制不同。光动力学疗法目前常用的光敏剂为血卟啉衍生物(HpD)，照射光源有波长为630nm的染料激光，或波长为630nm的金蒸汽激光。由于前两种激光设备复杂，成本高，并且HpD对630nm吸收较小，因此有些近年来学者采用波长为514.5nm的Ar+激光照射HpD治疗肿瘤。孙振权等[3]比较了染料激光和Ar+激光进行光动力学治疗鼻咽癌的疗效，认为Ar+激光比630nm的染料激光照射疗效更明显，但Ar+激光对组织的穿透能力较差，难以作深部治疗。Nd:YAG激光则具有穿透能力大的特点，因此作为激光温热疗法的光源。光动力学疗法的最基本原理是HpD分子吸收一定波长的激光后产生单态氧(1O2)而破坏肿瘤细胞。未吸收激光的HpD不可能发生光动力学反应。由于Ar+激光穿透组织深度较小，故对深部肿瘤细胞则难以达到杀伤作用。而Nd:YAG激光由于穿透深度大，因此，联合作用可使Ar+激光光动力学疗法作用不能杀伤的深部肿瘤细胞在Nd:YAG激光照射下变性坏死。Nd:YAG激光还可能使Ar+激光动力学疗法作用后造成的肿瘤细胞亚致死性损伤或潜在性致死损伤的修复在激光照射产生的热作用下中止或减弱。这样，杀伤效果增强，疗效提高。
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很多研究结果表明，光敏作用直接影响肿瘤细胞的DNA，DNA是光敏治癌的一个靶分子。Evensen用含有HpD的培养基培养癌细胞，光照后观察到细胞中染色体的断裂和畸变[6]。Malik观察到经卟啉光敏反应后瘤细胞内RNA和DNA经光照后几乎有50%的肿瘤细胞的DNA和RNA受到抑制[7]。黄卓恒等[8]测得肿瘤组织在受到HpD光敏作用后癌细胞内DNA的吸收率明显下降。本实验对Ar+激光光动力学疗法作用后24小时肿瘤细胞DNA含量测定结果表明，DNA相对吸收度比对照组明显下降，与上述研究结果一致。另外，高温能抑制细胞DNA合成[9]。本实验采用Nd:YAG温热疗法作用后24小时，瘤细胞DNA含量(吸收度)与对照组相比也有明显降低，而Nd:YAG激光温热疗法与Ar+激光光动力学疗法联合使用后24小时肿瘤细胞的DNA含量与单独作用相比降低更为明显(P<0.01)，说明联合作用产生协同性效应的原因之一可能是增强了对肿瘤细胞DNA的损伤，这种损伤使DNA合成受到干扰和抑制，导致DNA修复能力失调，DNA在自我复制、转录、翻译过程中受到各种干扰而含量下降，致使肿瘤细胞活动明显下降，最终发生代谢功能失调，以致细胞大量死亡。
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本研究结果表明，Nd:YAG激光温热疗法与Ar+激光光动力学疗法联合作用的途径之一为对肿瘤细胞中DNA的光敏作用。这些结果对两者联合作用机理研究及临床应用提供参考。
参考文献∶
[1] Fisher AMR,Murphree AL, Gomer CJ.Clinical and preclinical photodynamic therapy [J].Laser Surg Med,1995,17(1):2-31.
[2] Hillegersberg RV, Kort WJ, Wilson JHP.Current status of photodynamic therapy in oncology[J].Drugs.1994;48(4):510-527.
[3] 孙振权,罗国仪.不同光源进行光动力学治疗鼻咽癌的探讨—137例分析[J].中华肿瘤杂志,1992,14(4):290-292.
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[4] 郭友池,李希华,丁华野,等.氩离子激光改良法光动力学治疗浅表膀胱肿瘤(实验研究与临床分析)[J].激光杂志,1990,11(6):305.
[5] 陈其斯,袁中兴.骨折愈合过程中骨痂内修复细胞DNA含量的观察[J].中华医学杂志,1990，70(1):19.
[6] Evensen JF, Moan J.Photodynamic action and chromosomal damage: A comparison of hematoporphrion Derivative (HpD) and light with X-Irradiation [J].Br J Cancer, 1982,45(3):456-465.
[7] Malik Z, Djaldetti M.Destruction of erythroleukemia and Burkitt lymphoma cells by photoactivated protoporphrin[J].Int J Cancer,1980,26(4):495-500.
[8] 黄卓坦，丁华野，郭友池，等. PSD-007光敏剂辐照小鼠H22肝癌DNA含量测定[J].中华理疗杂志,1986,8(4):198-200.
[9] 赵彼得,郭新娜.高频透热治癌[M].北京:人民军医出版社,1994,84.
收稿日期：1999-02-16, 百拇医药