我国一株鹦鹉病毒的鉴定及其生化特性
作者：夏 苇* 冯 锋 李天宪 陈绳亮 赵 林
单位：夏 苇* 华中师范大学生命科学学院，武汉430079；冯 锋 李天宪 陈绳亮 赵 林 中国科学院武汉病毒研究所，武汉430071
关键词：澳州长尾小鹦鹉幼雏病病毒；乳多空病毒科；多瘤病毒属
中国病毒学/990313摘 要 1995年作者从湖北濒死鹦鹉体内分离到一株新病毒，经鹦鹉胚成纤维细胞盲传四代过渡到鸡胚成纤维细胞，再传至第五代出现细胞病变。适应细胞的病毒纯化后，经SDS-PAGE分析，发现病毒粒子结构蛋白由8条多肽组成，分子量范围在14.5～60kD之间。病毒的酸碱氨基酸之比为2.51，富含Asp,Clu和Leu,而Arg和Met含量较少。病毒核酸为双链DNA，存在超螺旋型、环型和线型三种形态，G+C的含量为45%。经限制性内切酶分析，核酸的分子量为3.3×106D。根据病毒分类的标准确认为澳州长尾小鹦鹉幼雏病病毒，应归属于乳多空病毒科多瘤病毒属。
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Identification and Biochemical Characteristics of
a New Psittacine Virus in China
Xia Wei* Fong Feng Li Tianxian Chen Shengliang Zhao Lin
(Wuhan Institute of Virology, Academia Sinica, Wuhan 430071)
*(College of Life Sciences, Central China Normal University, Wuhan 430079)
Abstract A strain of new virus was isolated from fledgling budgerigars by authors in 1995. Cytopathic effect became visible after the isolate was passaged 4 generations on budgerigar embryo fibroblast and 5 generations on Chicken embryo fibroblast. The SDS-PAGE proved that viral capsid was composed of eight polypeptides with molecular weight from 60 000 to 14 500 D. The protein was rich in Asp, Glu and Leu, but comparatively poorer in Arg and Met. The ratio of acidic amino acid to basic amino acid was 1∶2.51. The nucleic acid was dsDNA and existed as supercoiled circular, relaxed circular and linear molecules. G+C of viral DNA was 45%. The molecular weight of DNA was 3.3×106D by restriction endonuclease analysis. According to standards of virus classification, it is proved that the isolate was budgerigar fledgling disease virus which had placed into the Polyomavirus genus of Papovaviridae.
, 百拇医药
Key words Budgerigar fledgling disease virus, Papovaviridae, Polyomavirus genus
湖北云梦是我国最大的养鸟基地。七十年代起，养鸟业便在此悄然兴起，平均每年产商品鸟400万对，远销东南亚各国及香港、澳门，年产值3000多万元。1994年2月起，云梦发生了前所未有的大规模鹦鹉幼雏死亡，死亡率超过80%，直接经济损失超过1000万元。同时，北京、山东等地养鸟业也遭受重创。
1995年冯锋等人[1]从濒死鹦鹉幼雏体内分离到一种大小约50nm的病毒粒子，经初步纯化后在健康的澳州长尾小鹦鹉体内进行了感染试验，证明该病毒是引发鹦鹉幼雏死亡的主要病原。为了进一步探索有效的防治方法，本研究对该病毒的生化特性进行了研究，完成了此病毒的鉴定工作，确定了其分类地位。
1 材料与方法
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1.1 标本来源 濒死鹦鹉幼雏由湖北省云梦县畜牧局提供。
1.2 病毒的初步分离 取典型症状的濒死鹦鹉若干只，在无菌条件下取心、肝、脾等脏器，磨碎后低速离心，取上清留待细胞培养用。
1.3 病毒的细胞培养 选取10～16日龄鹦鹉胚做鹦鹉胚成纤维细胞(BEF)，按参考文献[2]的方法。选用含5%小牛血清的199培养液。当BEF长成80%单层后，接种分离的病毒液0.5mL/瓶。培养7d后，收获细胞液，冻融三次，离心后取上清0.5mL，再接种原代BEF，这样每隔4～5d盲传一次，盲传数代后，观察有无细胞病变(CPE)。同时，将每次BEF盲传的分离物接种鸡胚成纤维细胞(CEF)，观察有无CPE。
1.4 病毒的浓缩与纯化 将产生CPE的细胞液冻融三次，低速离心取上清，再经10000r/min高速离心30min和105630g超速离心2h，沉淀用PBS悬浮。浓缩的病毒液经Sepharose-2B柱层析纯化，方法同文献[11]。采用紫外分光光度计检测其纯度。
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1.5 病毒结构蛋白的生化特性
1.5.1 SDS-PAGE分析 参照文献[13]的方法进行。用考马斯亮蓝R250染色，分子量标准蛋白采用上海丽珠东风生物技术有限公司产品。
1.5.2 氨基酸组成分析 将纯化的病毒以6mol/L HCl 110℃条件水解24h，其产物经日立835型氨基酸自动分析仪测定。
1.6 病毒核酸的生化特性
1.6.1 核酸的抽提 采用氯仿-酚法抽提[3]。将抽提的核酸溶于TE buffer中，利用UV-300型双光束分光光度计测核酸的纯度。
1.6.2 核酸类型测定 按照常规方法对病毒核酸进行二苯胺[4]和DNase,RNase消化试验[5]。均以λDNA和酵母RNA为对照。
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1.6.3 核酸链型测定 按文献[6]介绍的方法进行吖啶橙染色，以λDNA和酵母RNA为对照，用450nm波长(高压汞加蓝色滤光片)在荧光显微镜下观察颜色反应。核酸热变性试验按文献[7]并稍加改进，核酸溶液100℃保温10min使之变性，立即冰浴2min，室温下测定紫外吸收光谱，以加热前的紫外吸收光谱为对照。
1.6.4 核酸构型测定 核酸的琼脂糖凝胶电泳按文献[3]的方法进行，琼脂糖浓度为1%，电泳缓冲液为TAE，以λDNA/HindⅢ为对照。采用甲酰胺-细胞色素C法[8]将核酸进行分子展层，展层后用喷碳的Formvar膜粘附，脱水后以60-70角喷涂铂钯合金，电镜下观察、拍照。
1.6.5 核酸(G+C)%的测定 将纯净DNA进行稀释，使其吸光度A260为0.2～0.4，然后采用热变性温度Tm值法[4]测定。
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1.6.6 核酸的限制性内切酶特性 限制性内切酶BamHI,EcoRI,PvuⅡ,HindⅢ,BglI和XhoI均购自华美生物工程公司。酶切反应和琼脂糖凝胶电泳按文献[9]的方法进行，以λDNA/HindⅢ酶切片段为分子量标准绘制标准曲线，测定核酸酶切片段的分子量。
2 结果与分析
2.1 病毒的细胞培养 从组织中分离的病毒经原代BEF盲传四代后，仍然没有出现CPE。将盲传四代的分离物接种到CPE，再在CEF上进行盲传，病毒感染第五代CEF后可见CPE。CPE表现为细胞肿大，变圆。出现CPE的时间最早为48h，第5～7天病变较明显。
2.2 病毒的电镜形态观察和纯度鉴定 病毒粒子在电镜下的形态同文献[1]的报道。提纯的病毒粒子的紫外吸收峰最高在260nm外，最低在250nm外，为典型的核蛋白吸收曲线(见图1)。
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图1 纯化病毒粒子的紫外吸收曲线
Fig.1 Ultraviolet absorptive curve of purified virions
2.3 病毒结构蛋白的生化特性
2.3.1 病毒经SDS-PAGE分析后，呈现8条带，3条主带和5条次带(图2)。按Müller[10]的分析，图2中所示的a,b两条带可能为高分子量蛋白所经过的痕迹。根据标准蛋白工作曲线，可推算出病毒粒子各种多肽的分子量，结果见表1。
表1 病毒结构多肽的分子量表
Table 1 Moleucular weights of viral structural polypeptides 组分
, 百拇医药
Component
1
2
3
4
5
6
7
8
分子量
M.W(D)
60000
56000
, 百拇医药 42000
39000
29000
26000
16200
14500
图2 病毒粒子结构蛋白SDS-PAGE图谱
Fig.2 Pattern of structural protein bands
of the virions by SDS-PAGE
A. Markers B.Viral protein
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2.3.2 氨基酸组成分析结果(表2)表明，此病毒富含Asp、Glu和Leu，而Arg和Met含量较少，其中碱性氨基酸与酸性氨基酸之比为1∶2.51。
表2 病毒结构蛋白的氨基酸组成
Table 2 Amino acid composition of viral structural protein 氨基酸
Amino acid
重量百分比
Weight percentage
摩尔数比
Molar ratio
摩尔数百分比
, 百拇医药
Molar percentage
Asp
10
67.32
9.44
Thr
6.67
50.02
7.01
Ser
5.71
47.48
6.65
, 百拇医药
Glu
15.71
95.22
13.35
Gly
6.19
71.80
10.06
Ala
7.14
70.66
9.09
Cys
, 百拇医药
2.76
10.14
1.42
Val
6.19
48.48
6.80
Met
1.38
4.92
0.69
Ile
4.24
, 百拇医药
28.62
4.01
Leu
8.57
59.04
8.28
Tyr
4.29
20.84
2.92
Phe
6.19
35.24
, 百拇医药
4.94
Lys
6.67
39.26
5.50
His
2.52
14.14
1.98
Arg
1.05
5.28
0.74
, 百拇医药
Pro
6.19
45.00
6.31
总计
101.47
713.46
100
Total
注：由于酸解，Asp=Asp+Asn, Glu=Glu+Gln
2.4 病毒核酸的生化特性
2.4.1 用氯仿-酚法抽提的核酸经紫外扫描分析，呈典型的核酸吸收曲线(如图3所示)，核酸OD260/OD280=0.633/0.347=1.82，说明抽提的核酸比较纯。
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图3 病毒核酸的紫外吸收曲线
Fig.3 Ultraviolet absorptive curve of viral nucleic acid
2.4.2 病毒核酸与二苯胺试剂反应呈蓝色，与λDNA反应相一致，而酵母RNA无蓝色反应。酶消化试验说明，该病毒核酸能被DNA酶消化，而不能被RNA酶消化(见图4)，这两个试验证明病毒核酸为DNA。
图4 病毒核酸的DNase和RNase消化图谱
Fig.4 Viral nucleic acid digested by DNase and
RNase on agarose gel electrophoresis
, 百拇医药
A.λDNA B.λDNA+DNase
C.λDNA+RNase D.Viral nucleic acid
E.Viral nucleic acid+DNase
F. Viral nucleic acid+RNase G.Yeast RNA+RNase
2.4.3 病毒DNA经吖啶橙染色后呈绿色，与对照λDNA(ds)一致，而酵母RNA(ss)呈橙色。病毒DNA加热前后的UV吸收曲线如图5，可见到核酸热变性后紫外吸收值明显增加，显示出双链特性。
图5 病毒DNA加热前后的UV吸收曲线
, 百拇医药 Fig.5 Ultraviolet absorptive curves of
viral DNA before and after heating
2.4.4 核酸的琼脂糖凝胶电泳结果(见图6)，病毒DNA呈现四条带，包括两条主带和两条次带。病毒核酸展层后经电镜观察，此病毒DNA存在三种不同的构型：超螺旋型、环型和线型(图7、8、9)。
图6 病毒核酸的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.6 Viral DNA on agarose gel electrophoresis
A. λDNA/HindⅢ B.Viral DNA
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图7 电镜下的超螺旋型DNA
Fig.7 Electron micrograph of supercoiled DNA
图8 电镜下的环型DNA
Fig.8 Electron micrograph of circular DNA
图9 电镜下的线型DNA
Fig.9 Electron micrograph of
linear DNA
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2.4.5 进行热变性温度Tm值测定时，将各温度下的溶液吸光度校正为25℃数值，用校正值除以25℃的吸光度，得出各温度下的相对吸光度(见表3)。以温度为横坐标，相对吸光度为纵坐标，绘成S形的热变性曲线，其曲线的线性部分的中点相对应的温度即为Tm值(图10)。根据公式计算G+Cmol%=Tm-69.3/0.41=87.75-69.3/0.41=45%。
表3 病毒DNA的热变性测定值
Table 3 Values of determining thermal denaturation of viral DNA 温度(℃)
Temperature
吸光度
Absorbance
, 百拇医药 校正膨胀体积后吸光度
Absorbance adjusted
swollen volume
相对吸光度
Relative absorbance
25
0.245
0.2450
1.0000
82
0.249
0.2558
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1.0441
84
0.256
0.2633
1.0749
85
0.260
0.2671
1.0904
87
0.284
0.2928
1.1949
, 百拇医药
88
0.311
0.3208
1.3092
89
0.327
0.3375
1.3775
90
0.343
0.3543
1.4461
92
, 百拇医药
0.343
0.3548
1.4480
图10 DNA的热变性曲线 (数字示Tm值)
Fig.10 Thermal denaturation curve of
viral DNA (Number means the value of Tm)
图11 病毒DNA的限制性内切酶图谱
Fig.11 Cleavage of the viral DNA fragments with restriction endonuclease
, 百拇医药
A. λDNA/HindⅢ B.Viral DNA+PvuⅡ
C. Viral DNA+EcoRⅠ D. Viral DNA+BamHⅠ Notes:Asp=Asp+Asn, Glu=Glu+Gln2.4.6 限制性内切酶酶切电泳表明，病毒DNA无HindⅢ、BgⅡ和XhoⅠ的酶切位点，经BamHI、EcoRI、PvuⅡ三种酶酶切，分别得到1、1、2条片段(图11)。以λDNA/HindⅢ为标准，计算出各酶切片段的分子量分别为3.3×106D、3.3×106D和(2.7×106+0.6×106)D。因此，此病毒核酸的分子量为3.3×106D。
5 分离病毒的分类鉴定 通过对所分离病毒的形态学、细胞培养特性，对理化因子的敏感性、蛋白质和核酸特性以及血清学特性(另文发表)的研究，根据病毒分类的标准并结合资料[10～13]，证明分离的病毒为澳州长尾小鹦鹉幼雏病病毒(Budgerigar fledgling disease virus, BFDV)，归属于乳多空病毒科的多瘤病毒属。
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3 讨论
澳州长尾小鹦鹉幼雏病首先在美国和加拿大报道[11，14]，随后，此病迅速蔓延到日本、意大利、匈牙利、德国和澳大利亚[15]。1981年Bozeman[11]证明此病是由病毒引起的，他把濒死鹦鹉脏器中分离的病毒命名为澳州长尾小鹦鹉幼雏病病毒(BFDV)，归属于乳多空病毒科；1984年Dykstra[12]克隆了BFDV核酸的全部基因；1986年Müller等人[10，13]对BFDV的外壳蛋白和核酸进行了详细的研究；1988年Rott[16]完成了BFDV基因的核苷酸全序列分析；从1988年至1996年，对BFDV的研究主要集中在早期编码区编码的两种非结构蛋白(大T抗原和小T抗原)和晚期编码区编码的三种主要外壳蛋白(VP1、VP2和VP3)[16，17]。澳州长尾小鹦鹉幼雏病在我国发现较晚，国内对BFDV的研究几乎是一个空白。虽然国外对BFDV的研究工作进行了十多年，但至今没有一种行之有效的防治方法。我们对此病毒的生化特性和分子生物学特性作了较为详细、全面的报道，旨在为BFDV的深入研究和寻找有效的防治方法打下坚实基础。
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在BFDV的细胞培养特性研究中，我们采用了Bozeman[11]的方法。BFDV先在BEF上盲传再过渡到CEF。由于鹦鹉胚个体小，制备细胞困难，收获病毒量少，因此，我们也尝试了将分离的BFDV接种传代细胞(Vero, Hep,BHK等细胞)和在原代CEF盲传两种方法，希望找到细胞制作简单、病毒量收获大的培养方法，但BFDV均不在这些细胞上生长。在试验中，我们发现盲传后BFDV接种CEF，第五代分离物经提纯在电镜下观察到许多病毒粒子，其浓度和纯度已达到生化分析的要求。此方法的研究成功将对今后研制该病的弱毒活苗成为可能。
我们采用传统方法抽提BFDV的核酸，经琼脂糖凝胶电泳呈现四条核酸带，核酸展层分析后，电镜下该病毒DNA存在超螺旋型、环型和线型三种不同形态。这种现象与Müller的报道十分类似[10]。但是，我们发现电泳后经EB染色看到的核酸带与Müller描述的四条相对应的带之间在亮度和相对位置上有一定的区别，而且通过苯酚-氯仿抽提，在其它条件均相同的情况下，每次抽提到的核酸带的亮度和位置也不完全相同。BFDV DNA会不会是小分子量的环状DNA，在酚抽提过程中或者高度缠绕呈超螺旋型，或者断裂呈线型，形成了电镜下见到的三种形态，而且每次抽提DNA断裂的部位可能不同，经琼脂糖凝胶电泳形成的带在亮度和相对位置上也会出现变化，这一假设尚需进一步的试验证实。
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参考文献
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单位：夏 苇* 华中师范大学生命科学学院，武汉430079；冯 锋 李天宪 陈绳亮 赵 林 中国科学院武汉病毒研究所，武汉430071
关键词：澳州长尾小鹦鹉幼雏病病毒；乳多空病毒科；多瘤病毒属
中国病毒学/990313摘 要 1995年作者从湖北濒死鹦鹉体内分离到一株新病毒，经鹦鹉胚成纤维细胞盲传四代过渡到鸡胚成纤维细胞，再传至第五代出现细胞病变。适应细胞的病毒纯化后，经SDS-PAGE分析，发现病毒粒子结构蛋白由8条多肽组成，分子量范围在14.5～60kD之间。病毒的酸碱氨基酸之比为2.51，富含Asp,Clu和Leu,而Arg和Met含量较少。病毒核酸为双链DNA，存在超螺旋型、环型和线型三种形态，G+C的含量为45%。经限制性内切酶分析，核酸的分子量为3.3×106D。根据病毒分类的标准确认为澳州长尾小鹦鹉幼雏病病毒，应归属于乳多空病毒科多瘤病毒属。
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Xia Wei* Fong Feng Li Tianxian Chen Shengliang Zhao Lin
(Wuhan Institute of Virology, Academia Sinica, Wuhan 430071)
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Abstract A strain of new virus was isolated from fledgling budgerigars by authors in 1995. Cytopathic effect became visible after the isolate was passaged 4 generations on budgerigar embryo fibroblast and 5 generations on Chicken embryo fibroblast. The SDS-PAGE proved that viral capsid was composed of eight polypeptides with molecular weight from 60 000 to 14 500 D. The protein was rich in Asp, Glu and Leu, but comparatively poorer in Arg and Met. The ratio of acidic amino acid to basic amino acid was 1∶2.51. The nucleic acid was dsDNA and existed as supercoiled circular, relaxed circular and linear molecules. G+C of viral DNA was 45%. The molecular weight of DNA was 3.3×106D by restriction endonuclease analysis. According to standards of virus classification, it is proved that the isolate was budgerigar fledgling disease virus which had placed into the Polyomavirus genus of Papovaviridae.
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Key words Budgerigar fledgling disease virus, Papovaviridae, Polyomavirus genus
湖北云梦是我国最大的养鸟基地。七十年代起，养鸟业便在此悄然兴起，平均每年产商品鸟400万对，远销东南亚各国及香港、澳门，年产值3000多万元。1994年2月起，云梦发生了前所未有的大规模鹦鹉幼雏死亡，死亡率超过80%，直接经济损失超过1000万元。同时，北京、山东等地养鸟业也遭受重创。
1995年冯锋等人[1]从濒死鹦鹉幼雏体内分离到一种大小约50nm的病毒粒子，经初步纯化后在健康的澳州长尾小鹦鹉体内进行了感染试验，证明该病毒是引发鹦鹉幼雏死亡的主要病原。为了进一步探索有效的防治方法，本研究对该病毒的生化特性进行了研究，完成了此病毒的鉴定工作，确定了其分类地位。
1 材料与方法
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1.1 标本来源 濒死鹦鹉幼雏由湖北省云梦县畜牧局提供。
1.2 病毒的初步分离 取典型症状的濒死鹦鹉若干只，在无菌条件下取心、肝、脾等脏器，磨碎后低速离心，取上清留待细胞培养用。
1.3 病毒的细胞培养 选取10～16日龄鹦鹉胚做鹦鹉胚成纤维细胞(BEF)，按参考文献[2]的方法。选用含5%小牛血清的199培养液。当BEF长成80%单层后，接种分离的病毒液0.5mL/瓶。培养7d后，收获细胞液，冻融三次，离心后取上清0.5mL，再接种原代BEF，这样每隔4～5d盲传一次，盲传数代后，观察有无细胞病变(CPE)。同时，将每次BEF盲传的分离物接种鸡胚成纤维细胞(CEF)，观察有无CPE。
1.4 病毒的浓缩与纯化 将产生CPE的细胞液冻融三次，低速离心取上清，再经10000r/min高速离心30min和105630g超速离心2h，沉淀用PBS悬浮。浓缩的病毒液经Sepharose-2B柱层析纯化，方法同文献[11]。采用紫外分光光度计检测其纯度。
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1.5 病毒结构蛋白的生化特性
1.5.1 SDS-PAGE分析 参照文献[13]的方法进行。用考马斯亮蓝R250染色，分子量标准蛋白采用上海丽珠东风生物技术有限公司产品。
1.5.2 氨基酸组成分析 将纯化的病毒以6mol/L HCl 110℃条件水解24h，其产物经日立835型氨基酸自动分析仪测定。
1.6 病毒核酸的生化特性
1.6.1 核酸的抽提 采用氯仿-酚法抽提[3]。将抽提的核酸溶于TE buffer中，利用UV-300型双光束分光光度计测核酸的纯度。
1.6.2 核酸类型测定 按照常规方法对病毒核酸进行二苯胺[4]和DNase,RNase消化试验[5]。均以λDNA和酵母RNA为对照。
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1.6.3 核酸链型测定 按文献[6]介绍的方法进行吖啶橙染色，以λDNA和酵母RNA为对照，用450nm波长(高压汞加蓝色滤光片)在荧光显微镜下观察颜色反应。核酸热变性试验按文献[7]并稍加改进，核酸溶液100℃保温10min使之变性，立即冰浴2min，室温下测定紫外吸收光谱，以加热前的紫外吸收光谱为对照。
1.6.4 核酸构型测定 核酸的琼脂糖凝胶电泳按文献[3]的方法进行，琼脂糖浓度为1%，电泳缓冲液为TAE，以λDNA/HindⅢ为对照。采用甲酰胺-细胞色素C法[8]将核酸进行分子展层，展层后用喷碳的Formvar膜粘附，脱水后以60-70角喷涂铂钯合金，电镜下观察、拍照。
1.6.5 核酸(G+C)%的测定 将纯净DNA进行稀释，使其吸光度A260为0.2～0.4，然后采用热变性温度Tm值法[4]测定。
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1.6.6 核酸的限制性内切酶特性 限制性内切酶BamHI,EcoRI,PvuⅡ,HindⅢ,BglI和XhoI均购自华美生物工程公司。酶切反应和琼脂糖凝胶电泳按文献[9]的方法进行，以λDNA/HindⅢ酶切片段为分子量标准绘制标准曲线，测定核酸酶切片段的分子量。
2 结果与分析
2.1 病毒的细胞培养 从组织中分离的病毒经原代BEF盲传四代后，仍然没有出现CPE。将盲传四代的分离物接种到CPE，再在CEF上进行盲传，病毒感染第五代CEF后可见CPE。CPE表现为细胞肿大，变圆。出现CPE的时间最早为48h，第5～7天病变较明显。
2.2 病毒的电镜形态观察和纯度鉴定 病毒粒子在电镜下的形态同文献[1]的报道。提纯的病毒粒子的紫外吸收峰最高在260nm外，最低在250nm外，为典型的核蛋白吸收曲线(见图1)。
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图1 纯化病毒粒子的紫外吸收曲线
Fig.1 Ultraviolet absorptive curve of purified virions
2.3 病毒结构蛋白的生化特性
2.3.1 病毒经SDS-PAGE分析后，呈现8条带，3条主带和5条次带(图2)。按Müller[10]的分析，图2中所示的a,b两条带可能为高分子量蛋白所经过的痕迹。根据标准蛋白工作曲线，可推算出病毒粒子各种多肽的分子量，结果见表1。
表1 病毒结构多肽的分子量表
Table 1 Moleucular weights of viral structural polypeptides 组分
, 百拇医药
Component
1
2
3
4
5
6
7
8
分子量
M.W(D)
60000
56000
, 百拇医药 42000
39000
29000
26000
16200
14500
图2 病毒粒子结构蛋白SDS-PAGE图谱
Fig.2 Pattern of structural protein bands
of the virions by SDS-PAGE
A. Markers B.Viral protein
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2.3.2 氨基酸组成分析结果(表2)表明，此病毒富含Asp、Glu和Leu，而Arg和Met含量较少，其中碱性氨基酸与酸性氨基酸之比为1∶2.51。
表2 病毒结构蛋白的氨基酸组成
Table 2 Amino acid composition of viral structural protein 氨基酸
Amino acid
重量百分比
Weight percentage
摩尔数比
Molar ratio
摩尔数百分比
, 百拇医药
Molar percentage
Asp
10
67.32
9.44
Thr
6.67
50.02
7.01
Ser
5.71
47.48
6.65
, 百拇医药
Glu
15.71
95.22
13.35
Gly
6.19
71.80
10.06
Ala
7.14
70.66
9.09
Cys
, 百拇医药
2.76
10.14
1.42
Val
6.19
48.48
6.80
Met
1.38
4.92
0.69
Ile
4.24
, 百拇医药
28.62
4.01
Leu
8.57
59.04
8.28
Tyr
4.29
20.84
2.92
Phe
6.19
35.24
, 百拇医药
4.94
Lys
6.67
39.26
5.50
His
2.52
14.14
1.98
Arg
1.05
5.28
0.74
, 百拇医药
Pro
6.19
45.00
6.31
总计
101.47
713.46
100
Total
注：由于酸解，Asp=Asp+Asn, Glu=Glu+Gln
2.4 病毒核酸的生化特性
2.4.1 用氯仿-酚法抽提的核酸经紫外扫描分析，呈典型的核酸吸收曲线(如图3所示)，核酸OD260/OD280=0.633/0.347=1.82，说明抽提的核酸比较纯。
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图3 病毒核酸的紫外吸收曲线
Fig.3 Ultraviolet absorptive curve of viral nucleic acid
2.4.2 病毒核酸与二苯胺试剂反应呈蓝色，与λDNA反应相一致，而酵母RNA无蓝色反应。酶消化试验说明，该病毒核酸能被DNA酶消化，而不能被RNA酶消化(见图4)，这两个试验证明病毒核酸为DNA。
图4 病毒核酸的DNase和RNase消化图谱
Fig.4 Viral nucleic acid digested by DNase and
RNase on agarose gel electrophoresis
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A.λDNA B.λDNA+DNase
C.λDNA+RNase D.Viral nucleic acid
E.Viral nucleic acid+DNase
F. Viral nucleic acid+RNase G.Yeast RNA+RNase
2.4.3 病毒DNA经吖啶橙染色后呈绿色，与对照λDNA(ds)一致，而酵母RNA(ss)呈橙色。病毒DNA加热前后的UV吸收曲线如图5，可见到核酸热变性后紫外吸收值明显增加，显示出双链特性。
图5 病毒DNA加热前后的UV吸收曲线
, 百拇医药 Fig.5 Ultraviolet absorptive curves of
viral DNA before and after heating
2.4.4 核酸的琼脂糖凝胶电泳结果(见图6)，病毒DNA呈现四条带，包括两条主带和两条次带。病毒核酸展层后经电镜观察，此病毒DNA存在三种不同的构型：超螺旋型、环型和线型(图7、8、9)。
图6 病毒核酸的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.6 Viral DNA on agarose gel electrophoresis
A. λDNA/HindⅢ B.Viral DNA
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图7 电镜下的超螺旋型DNA
Fig.7 Electron micrograph of supercoiled DNA
图8 电镜下的环型DNA
Fig.8 Electron micrograph of circular DNA
图9 电镜下的线型DNA
Fig.9 Electron micrograph of
linear DNA
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2.4.5 进行热变性温度Tm值测定时，将各温度下的溶液吸光度校正为25℃数值，用校正值除以25℃的吸光度，得出各温度下的相对吸光度(见表3)。以温度为横坐标，相对吸光度为纵坐标，绘成S形的热变性曲线，其曲线的线性部分的中点相对应的温度即为Tm值(图10)。根据公式计算G+Cmol%=Tm-69.3/0.41=87.75-69.3/0.41=45%。
表3 病毒DNA的热变性测定值
Table 3 Values of determining thermal denaturation of viral DNA 温度(℃)
Temperature
吸光度
Absorbance
, 百拇医药 校正膨胀体积后吸光度
Absorbance adjusted
swollen volume
相对吸光度
Relative absorbance
25
0.245
0.2450
1.0000
82
0.249
0.2558
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1.0441
84
0.256
0.2633
1.0749
85
0.260
0.2671
1.0904
87
0.284
0.2928
1.1949
, 百拇医药
88
0.311
0.3208
1.3092
89
0.327
0.3375
1.3775
90
0.343
0.3543
1.4461
92
, 百拇医药
0.343
0.3548
1.4480
图10 DNA的热变性曲线 (数字示Tm值)
Fig.10 Thermal denaturation curve of
viral DNA (Number means the value of Tm)
图11 病毒DNA的限制性内切酶图谱
Fig.11 Cleavage of the viral DNA fragments with restriction endonuclease
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A. λDNA/HindⅢ B.Viral DNA+PvuⅡ
C. Viral DNA+EcoRⅠ D. Viral DNA+BamHⅠ Notes:Asp=Asp+Asn, Glu=Glu+Gln2.4.6 限制性内切酶酶切电泳表明，病毒DNA无HindⅢ、BgⅡ和XhoⅠ的酶切位点，经BamHI、EcoRI、PvuⅡ三种酶酶切，分别得到1、1、2条片段(图11)。以λDNA/HindⅢ为标准，计算出各酶切片段的分子量分别为3.3×106D、3.3×106D和(2.7×106+0.6×106)D。因此，此病毒核酸的分子量为3.3×106D。
5 分离病毒的分类鉴定 通过对所分离病毒的形态学、细胞培养特性，对理化因子的敏感性、蛋白质和核酸特性以及血清学特性(另文发表)的研究，根据病毒分类的标准并结合资料[10～13]，证明分离的病毒为澳州长尾小鹦鹉幼雏病病毒(Budgerigar fledgling disease virus, BFDV)，归属于乳多空病毒科的多瘤病毒属。
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3 讨论
澳州长尾小鹦鹉幼雏病首先在美国和加拿大报道[11，14]，随后，此病迅速蔓延到日本、意大利、匈牙利、德国和澳大利亚[15]。1981年Bozeman[11]证明此病是由病毒引起的，他把濒死鹦鹉脏器中分离的病毒命名为澳州长尾小鹦鹉幼雏病病毒(BFDV)，归属于乳多空病毒科；1984年Dykstra[12]克隆了BFDV核酸的全部基因；1986年Müller等人[10，13]对BFDV的外壳蛋白和核酸进行了详细的研究；1988年Rott[16]完成了BFDV基因的核苷酸全序列分析；从1988年至1996年，对BFDV的研究主要集中在早期编码区编码的两种非结构蛋白(大T抗原和小T抗原)和晚期编码区编码的三种主要外壳蛋白(VP1、VP2和VP3)[16，17]。澳州长尾小鹦鹉幼雏病在我国发现较晚，国内对BFDV的研究几乎是一个空白。虽然国外对BFDV的研究工作进行了十多年，但至今没有一种行之有效的防治方法。我们对此病毒的生化特性和分子生物学特性作了较为详细、全面的报道，旨在为BFDV的深入研究和寻找有效的防治方法打下坚实基础。
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在BFDV的细胞培养特性研究中，我们采用了Bozeman[11]的方法。BFDV先在BEF上盲传再过渡到CEF。由于鹦鹉胚个体小，制备细胞困难，收获病毒量少，因此，我们也尝试了将分离的BFDV接种传代细胞(Vero, Hep,BHK等细胞)和在原代CEF盲传两种方法，希望找到细胞制作简单、病毒量收获大的培养方法，但BFDV均不在这些细胞上生长。在试验中，我们发现盲传后BFDV接种CEF，第五代分离物经提纯在电镜下观察到许多病毒粒子，其浓度和纯度已达到生化分析的要求。此方法的研究成功将对今后研制该病的弱毒活苗成为可能。
我们采用传统方法抽提BFDV的核酸，经琼脂糖凝胶电泳呈现四条核酸带，核酸展层分析后，电镜下该病毒DNA存在超螺旋型、环型和线型三种不同形态。这种现象与Müller的报道十分类似[10]。但是，我们发现电泳后经EB染色看到的核酸带与Müller描述的四条相对应的带之间在亮度和相对位置上有一定的区别，而且通过苯酚-氯仿抽提，在其它条件均相同的情况下，每次抽提到的核酸带的亮度和位置也不完全相同。BFDV DNA会不会是小分子量的环状DNA，在酚抽提过程中或者高度缠绕呈超螺旋型，或者断裂呈线型，形成了电镜下见到的三种形态，而且每次抽提DNA断裂的部位可能不同，经琼脂糖凝胶电泳形成的带在亮度和相对位置上也会出现变化，这一假设尚需进一步的试验证实。
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