非洲猪瘟病毒j5R膜蛋白的电脑预测和实验证实
作者：孙怀昌Linda K. Dixon R. M. E Parkhouse
单位：扬州大学畜牧兽医学院动医系，扬州 225009
关键词：非洲猪瘟病毒；j5R阅读框；膜蛋白
中国病毒学/990308 摘 要 蛋白多肽二级结构的电脑预测表明，非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)j5R阅读框编码12.9 kDa膜蛋白。该蛋白的C末端含有一个潜在抗原决定簇，针对其合成肽的抗体能在ASFV感染细胞和病毒颗粒中检测到23或25 kDa(取决于不同毒株)特异蛋白。免疫荧光试验显示，j5R蛋白主要位于感染细胞的病毒复制部位。油水两相分离和细胞分级分离试验结果证明j5R蛋白是膜相关蛋白。
Computer-Based Prediction and Experimental Confirmation of
, 百拇医药
the j5R Membrane Protein of African Swine Fever Virus
Sun Huaichang
(Dept. of Vet. Med., Anim. Sci. and Vet Med. Coll., Yangzhou Univ., Yangzhou 225009)
Linda K Dixon R. M. E Parkhouse
(Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 ONF, UK)
Abstract The j5R open reading frame (ORF) of African swine fever virus was predicted by computing to encode a 12.9 kDa protein with two successive N-terminal transmembrane domains and one C-terminal antigenic epitope. Antibodies raised against a synthetic peptide derived from the C-terminal epitope detected a specific protein of 23 or 25 kDa (depending on different isolates) in ASFV-infected cells or purified extracellular ASFV virions. Immunofluorescence showed that the j5R protein was mainly located in the virus assembly sites within ASFV-infected cells. Phase separation of purified extracellular ASFV virions and fractionation of ASFV-infected cells demonstrated that the j5R protein was in the detergent phase and membrane fraction, confirming that the j5R protein was membrane-associated.
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Key words African swine fever virus(ASFV), j5R ORF, Membrane protein
病毒膜蛋白是激发机体产生免疫应答或参与病毒装配的重要蛋白质。这些蛋白质借助其跨膜片段的疏水性质，将其多肽链导向脂质单位膜，因此常存在于有囊膜病毒或其感染细胞的表面。前者与病毒吸附、介导细胞膜融合或穿透细胞、参与病毒感染早期过程密切相关，针对这些病毒蛋白的抗体对阻止病毒感染扩散起着至关重要的作用。后者具有表面和外部抗原的强免疫原性质，常常是激发机体免疫应答，尤其是细胞毒性T淋巴细胞的有效抗原[1]。经电脑预测，ASFV j5R阅读框编码由111个氨基酸组成的膜蛋白。本文报道该蛋白的表达与鉴定。
1 材料和方法
1.1 材料
用于蛋白多肽二级结构分析的GCG程序购于美国威斯康星大学。除另有说明外，所有化学药品均来自Sigma公司。分子生物学试剂，包括限制性内切酶、Taq DNA聚合酶 、连接酶、强化化学荧光蛋白转印杂交(Enhanced Chemiluminescent Western Blot, ECL Western Blot)试剂等，分别购自德国Beohinger Mannheim、美国Promega及英国Amersha公司。所有细胞、病毒、血清等均由英国动物健康研究所提供。
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1.2 方法
1.2.1 蛋白多肽的二级结构分析
先将ASFV(Malawi LIL 20/1)j5R阅读框的核苷酸序列[2]转译成氨基酸序列，然后用Peptidestructure程序预测其抗原性(antigenicity)、弹性度(flexibility)、亲水性(hydrophilicity)及表面概率(surface probability)；用Sigcleave程序预测其蛋白水解部位；用Motifs程序预测其潜在氨基酸功能区。
1.2.2 多肽合成和抗体制备
根据电脑预测，j5R蛋白的第86～103个氨基酸具有较高的抗原指数，为潜在的抗原决定簇(图1)。根据此决定簇序列，用固相法[3]合成由17个氨基酸(亮-赖-谷-丙-谷-天冬酰胺-赖-酪-色-色-谷氨酰胺-天冬酰胺-酪-天冬-脯-酪-丝氨酸)组成的多肽。
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将500 μg合成肽溶于750 μL PBS中，与等体积佛氏完全佐剂混匀后分5点(1点肌肉，4点皮下)注射一只新西兰白兔。注射后第21和42天，每只兔用1/2剂量与不完全佐剂混合的合成肽加强免疫。第64天时，免疫兔的ELISA滴度仍不很高，遂用500 μg合成肽再次加强免疫。3周后采血，分离血清。兔抗合成肽免疫球蛋白用ProtOn亲和柱按厂家(Multiple Peptide system)说明提纯。
1.2.3 病毒纯化和病毒蛋白抽提
用Percoll梯度离心法从ASFV(Uganda株)感染细胞上清中提纯细胞外病毒按Carrascosa法[4]进行。
将100 μL纯化病毒置于离心浓缩管(Centricon-100)中，向管中加入10% N-Octyl β-D-glacopyranoside(NOG)至最终浓度为0.1%，4 ℃孵育1 h后离心(3000 r/min, Denley BR 401低温离心机)分离病毒颗粒和洗脱蛋白，收集下管中的抽提蛋白，病毒再分别用0.25%、0.5%和1.0%NOG按上述方法抽提一次。抽提蛋白和抽提后的病毒用兔抗j5R合成肽抗体进行ECL Western Blot分析。
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1.2.4 病毒感染细胞
猪骨髓细胞培养按发表的方法[5]制备。向长成单层的10 mL细胞管中加入0.5 mL Malawi LIL 20/1 ASFV病毒液，继续培养至出现明显血吸附现象(约48 h)时倾去培养液，并向培养管中加入0.5 mL细胞裂解缓冲液(50 mmol/L Tris HCl, pH8.0, 120 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 0.5%NP40)，裂解细胞保存于-70 ℃备用。
1.2.5 ECL Western blot
10%SDS-PAGE按常规方法进行。电泳后，用Western Blotter按厂家说明将蛋白转印到Immobilon-P膜上(0.8～1.0 mA/cm2膜，25～30 min)。蛋白杂交按常规方法进行，封闭液为含10%犊牛血清和0.1% Tween 20的PBS， 第一抗体为兔抗j5R合成肽Ig，第二抗体为辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白，用ECL Western Blotting Detection Reagents按厂家说明显示杂交信号。
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1.2.6 免疫荧光
BSC40细胞培养于Lab-Tek细胞培养仓内。待细胞接近单层时，用Uganda ASFV感染细胞(37 ℃, 2 h)。于感染后不同时间倾去培养液，并用PBS洗涤后进行免疫荧光染色。表面染色直接用活细胞或经4%副甲醛固定(室温30 min)的细胞进行；细胞内染色的细胞先用冷却甲醇固定5 min，然后按常规方法染色。第一抗体为兔抗j5R合成肽Ig，第二抗体为FITC标记的羊抗兔IgG。
1.2.7 两相分离
按Bordier的两相分离试验法[6]，用Triton X-114抽提纯化ASFV颗粒膜蛋白。
1.2.8 细胞分级分离(fractionation)
细胞分级分离按Chatis和Morrison的方法[7]进行。感染细胞为IBRS 2细胞，毒株为Uganda株，阳性对照为35s标记的水泡性口炎病毒(Vescular stomatitis virus, VSV)感染的IBRS 2细胞。
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2 结果
2.1 蛋白多肽的二级结构分析
ASFV(Malawi LIL 20/1)的j5R阅读框位于该病毒基因组SalⅠ酶消化后的J片段，由病毒基因组的正链编码，阅读方向朝向基因组的右端。该阅读框由333 bp组成，编码由111个氨基酸组成的12.9 kDa蛋白质[2]。
用Prosrch和Tfasta程序分别查询Swissprot(Version 28)和Gen EMBL资料库，未发现与之同源的氨基酸序列。查询Prosite资料库(错配=0)发现1个潜在糖基化部位(第65个残基)和4个磷酸化部位(图1)。Peptidestructure程序分析表明，j5R多肽链的N-末端第1～20和25～40个残基的疏水值较高，为潜在膜蛋白跨膜区(图1)。
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图1 ASFV j5R蛋白多肽的2级结构分析。纵坐标代表亲水值(>0)和疏水值(<0)，顶排数字代表氨基酸残基位置，黑色区域代表潜在的膜蛋白跨膜区，阴影区域代表用于制备j5R合成肽的潜在抗原决定簇，P代表磷酸化部位，G代表N-交联的糖基化部位。
Fig.1 Secondary structure analysis of ASFV j5R polypeptide. The ordinate represents hydrophilicity (>0) and hydrophobicity (<0), top row the positions of amino acid residues, darkened areas the putative transmembrane domains, shaded area the potential antigenic determinant used to make the j5R synthetic peptide, P phosphorylation sites, and G N-linked glycosylation site, respectively.
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2.2 j5R蛋白在病毒感染细胞中的表达与定位
用亲和层析纯化的兔抗j5R合成肽的抗体，对ASFV Malawi LIL 20/1株感染48 h后的猪骨髓细胞进行ECL Westen blot分析显示，j5R阅读框C端序列特异抗体能在病毒感染细胞中检测到分子量为23 kDa的特异蛋白，而正常兔血清不能显示此蛋白，正常猪骨髓细胞中也无此蛋白(图2)。
图2 病毒感染细胞的ECL Western blot分析。未感染(Mock-infected, M)和Malawi LIL20/1毒株感染(Infected,I)的猪骨髓细胞(Porcine bone marrow cells, PBM)经10%SDS-PAGE分离后，用兔抗j5R合成肽抗体测定细胞中的j5R蛋白。
Fig.2 ECL Western blotting analysis of ASFV-infected cells. Mock-infected (M) and Malawi LIL20/1 ASFV-infected (I) pig bone marrow cells (PBM) were separated by 10% SDS-PAGE, followed by ECL Western blotting using rabbit anti-j5R peptide Ig as the antibody.
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以兔抗j5R合成肽Ig为抗体，在感染后4～16h进行的免疫荧光试验结果显示，j5R蛋白的细胞表面染色为阴性，但从感染后10 h起，细胞内染色转为阳性。j5R蛋白主要位于靠近细胞核周围的病毒复制部位(图3)。
图3 ASFV感染细胞的免疫荧光分析。Uganda毒株感染16 h后的IBRS2细胞用兔抗j5R合成肽抗体显示j5R病毒蛋白的存在。该蛋白先散在于细胞核周围(见照片中间之细胞)，然后向病毒装配部位(照片中的白色区域)集中(放大倍数100×)。
Fig.3 Immunofluoresccence showing intracellular staining of the j5R protein. IBR2 cells were infected with Uganda ASFV strain, harvested at 16 h post-infection and stained with rabbit anti-j5R peptide Ig followed by FITC-congugated goat anti-rabbit IgG (×100). The protein was detected as multiple small perinuclear foci (in the middle of the picture) and localized in the virus assembly sites (white areas).
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2.3 j5R蛋白在细胞外病毒粒子中的表达和定位
将Percoll梯度离心法从Uganda毒株感染的IBRS 2细胞培养上清中提纯的细胞外病毒蛋白转印到醋酸纤维素膜上，用兔抗j5R合成肽抗体进行ECL Western blot分析。结果表明，j5R阅读框C端序列特异抗体能在纯化的病毒中检测到25 kDa蛋白，而正常兔血清不能显示此蛋白(图4)。
为了进一步证实上述25 kDa蛋白为病毒结构蛋白，依次用0.1%、0.25%、0.5%和1.0%NOG洗涤纯化的细胞外病毒，然后以兔抗j5R合成肽Ig为抗体进行ECL Western blot分析。结果表明，j5R蛋白不在低浓度(0.1%)NOG即能洗脱的非特异性吸附蛋白或病毒外膜蛋白之列，需0.5%的NOG才能从病毒颗粒上洗脱下来(图4)。
, 百拇医药 图4 纯化ASFV颗粒的ECL Western blot分析。A.两轮Percoll梯度离心纯化的细胞外有囊膜病毒经10%SDS-PAGE分离后，用正常兔血清(1)或兔抗j5R合成肽抗体显示j5R蛋白的存在。B.纯化病毒分别用不同浓度的NOG抽提后，用同样抗体显示洗脱液中的j5R蛋白。
Fig.4 ECL Western blotting analysis of purified ASFV particles.A. Extracellular enveloped virus particles purified by 2 cycles of Percoll gradient centrifugation were separated by 10% SDS-PAGE for Western blotting with normal rabbit serum (1)or rabbit anti-j5R peptide Ig (2). B. The purified virus was extracted sequentially with different concentrations of NOG, followed by Western blotting using rabbit anti-j5R peptide Ig as the antibody.
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2.4 j5R蛋白与病毒及其感染细胞膜性结构的关系
纯化的细胞外病毒经3次Triton X-114抽提后，取每次抽提的无机相(水相)和有机相(油相)进行电泳，以兔抗j5R合成肽的Ig为抗体进行ECL Western blot分析，同时用针对ASFV 72 kDa结构蛋白的单抗作为非膜蛋白对照[9]，用针对ASFV编码的Ubiquitin抗体为膜蛋白阳性对照[10]。结果显示，和已知的膜蛋白Ubiquitin一样，j5R蛋白存在于两相分离后的有机相中(图5)。
图5 ASFV的两相分离试验。Percoll梯度离心纯化的细胞外有囊膜病毒顺次用1.0%(1)，0.5%(2)和2.0% Triton X-114抽提后，用兔抗j5R合成肽Ig为抗体，用ECL Western blot法测定油相(1和2)及水相(3)中的j5R蛋白。
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Fig.5 Phase separation of membrane proteins. The extracellular enveloped ASFV particles purified by Percoll gradient centrifugation were sequentially extracted with 1.0% (1), 0.5% (2) and 2.0% Triton X-114 and the existence of the j5R protein in the detergent phases (1 and 2) or aqueous phase was demonstrated by Western blotting using rabbit anti-j5R peptide Ig as the antibody.
用氮气爆破法破碎Uganda ASFV感染16 h后的IBRS 2细胞，用8%蔗糖梯度离心法进行细胞分级分离。分离后的水溶性和膜性蛋白经SDS-PAGE分离后，用兔抗j5R合成肽Ig为抗体进行ECL Western blot分析。试验中，用针对VSV G蛋白的单抗作为膜蛋白阳性抗体对照[7]。结果表明，j5R蛋白存在于病毒感染细胞的膜性结构中(图6)。
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图6 ASFV感染细胞的分级分离试验。Uganda毒株感染的IBRS2细胞经匀浆化后，用8%蔗糖梯度离心法分离细胞内膜性囊泡，然后以兔抗j5R合成肽Ig为抗体，以ECL Western blot法测定经1.2% Triton X-100和12.2%蛋白酶K处理前(1)及处理后(2)的膜性囊泡中的j5R蛋白。
Fig.6 Fractionation of ASFV-infected cells. IBRS2 cells infected with Uganda ASFV strain were homogenized and the vesicles were obtained by 8% sucrose gradient centrifugation. The existence of j5R protein in the vesicles before (1) and after (2) treatment with 1.2% Triton X-100 and 12.2% proteinase K was demonstrated by Western blotting using rabbit anti-j5R peptide Ig as the antibody.
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3 讨论
蛋白多肽的二级结构电脑分析结果表明，ASFV(Malawi LIL 20/1株)的j5R阅读框编码由111个氨基酸组成的12.9 kDa蛋白质，其C末端具有一个潜在的抗原决定簇(图1)。兔抗j5R合成肽的特异抗体能在细胞外病毒(Uganda株)和病毒感染细胞中测到分子量为23或25 kDa的蛋白，而正常兔血清不能显示该蛋白的存在，说明j5R合成肽特异抗体测到的蛋白为ASFV特异蛋白。病毒颗粒和感染细胞中j5R蛋白分子量的差异，与所用病毒之毒株不同有关，详细资料另文发表。值得一提的是，j5R蛋白的实际分子量(23或25 kDa)约是其理论计算分子量(12.9 kDa)的两倍，其原因可能由该蛋白跨膜区α-螺旋结构之间相互作用形成的二聚体或该蛋白在凝胶上的异常移行(含有较多酸碱性氨基酸)所致，而与该基因定序错误、多肽链的糖基化或因二硫键形成的二聚体无关[11]。
Western blot结果显示，j5R蛋白存在于细胞外病毒颗粒上，但据此不能得出j5R蛋白是ASFV结构蛋白的结论，尚有病毒颗粒的非特异性吸附蛋白之可能。为排除这种可能性，作者 先用不同浓度的NOG洗涤纯化的病毒粒子，然后用Western blot测定洗脱液的病毒蛋白。其理论依据是，NOG是作用缓和的非离子去污剂，对病毒粒子蛋白具有洗脱作用，在一定浓度范围内，浓度愈高，洗脱作用愈强，据此不仅可以区别病毒结构蛋白和非特异性吸附蛋白，还可以了解蛋白在病毒粒子中的相对位置，据报道，0.1%NOG即能洗脱ASFV病毒颗粒的非特异吸附蛋白或暴露于病毒颗粒表面的外膜蛋白[8]。从本试验结果来看，j5R蛋白需0.5%NOG才能从病毒粒子上洗脱下来，说明该蛋白不仅是病毒结构蛋白，而且位于病毒粒子的较深层。
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所有膜蛋白均含有1个或多个约由20个疏水氨基酸组成的跨膜片段(即跨膜区)，此跨膜片段与信号肽的核心区(即h-区)相似，能与信号识别颗粒结合，从而将新生肽链导入内质网[12]。目前已有预测膜蛋白的电脑程序，而且准确率很高[13]。用此类程序对j5R蛋白进行的预测结果显示，j5R蛋白的第1～20和25～40个残基的疏水值很高，为两个相邻的潜在跨膜区(图1)，提示j5R蛋白很可能是膜蛋白。在用纯化病毒颗粒进行的两相分离试验中，j5R存在于两相分离后的有机相中，符合膜蛋白的特点，证明该蛋白是膜相关蛋白。
膜蛋白由位于粗面内质网表面的所谓膜性核糖体合成，在转译同时，新生肽链转位进入内质网，并在此初步折叠和加工修饰后，进入高尔基体作进一步加工修饰，最后包裹在膜性囊泡(vesicle)内运往细胞浆膜或其他膜性亚细胞结构[14]。因此，膜蛋白在合成、折叠、加工修饰，直至到达最后目的地的整个过程中，都处于细胞的膜性结构中，这为用细胞分级分离法(fractionation)鉴定膜蛋白提供了理论依据。从试验结果来看，j5R蛋白存在于ASFV感染细胞分级分离后的膜性结构中，进一步证明它是膜蛋白。
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致谢 Drs Wilkinson P J, Hutchings G和Williams S提供病毒株、免疫血清和其他帮助，本院李俊宝副教授仔细阅读此稿，谨致谢忱。
参考文献
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7 Chatis P A, Morrison T G. Vescular stomatitis virus glycoprotein is anchored to intracellular membranes near its carboyl end and proteolytically cleaved at its amino terminus. J Virol, 1979, 29:3957～3963
8 Sun H, Jacobs S C, Smith G L et al. Afrian swine fever virus gene j13L encodes a 25～27 kDa virion protein with variable numbers of amino acid repeats. J Gen Virol, 1995,76:1117～1127
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10 Gvarino L A, Smith G, Dong W. Ubiquitin is attached to membranes of baculovirus particles by a novel type of phospholipid anchor. Cell, 1995,80:2301～2309
11 Brookes SM, Sun H, Dixon L K et al. Characterization of African swine fever virion proteins j5R and j13L: immunolocalization in virus particles and assembly sites. J Gen Virol, (in Press)
12 Pugsley A P. Protein targeting. London: Academic Press Inc, 1989.
13 Von Heijne G. Membrane protein structure prediction: Hydrophobicity analysis and the positive rule. J Mol Biol, 1992, 225:487～494
14 Lewin B. Protein localization, In: Genes VI. Oxford New York Tokyo: Oxford University Press, 1997. 243～283, 百拇医药
单位：扬州大学畜牧兽医学院动医系，扬州 225009
关键词：非洲猪瘟病毒；j5R阅读框；膜蛋白
中国病毒学/990308 摘 要 蛋白多肽二级结构的电脑预测表明，非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)j5R阅读框编码12.9 kDa膜蛋白。该蛋白的C末端含有一个潜在抗原决定簇，针对其合成肽的抗体能在ASFV感染细胞和病毒颗粒中检测到23或25 kDa(取决于不同毒株)特异蛋白。免疫荧光试验显示，j5R蛋白主要位于感染细胞的病毒复制部位。油水两相分离和细胞分级分离试验结果证明j5R蛋白是膜相关蛋白。
Computer-Based Prediction and Experimental Confirmation of
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the j5R Membrane Protein of African Swine Fever Virus
Sun Huaichang
(Dept. of Vet. Med., Anim. Sci. and Vet Med. Coll., Yangzhou Univ., Yangzhou 225009)
Linda K Dixon R. M. E Parkhouse
(Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 ONF, UK)
Abstract The j5R open reading frame (ORF) of African swine fever virus was predicted by computing to encode a 12.9 kDa protein with two successive N-terminal transmembrane domains and one C-terminal antigenic epitope. Antibodies raised against a synthetic peptide derived from the C-terminal epitope detected a specific protein of 23 or 25 kDa (depending on different isolates) in ASFV-infected cells or purified extracellular ASFV virions. Immunofluorescence showed that the j5R protein was mainly located in the virus assembly sites within ASFV-infected cells. Phase separation of purified extracellular ASFV virions and fractionation of ASFV-infected cells demonstrated that the j5R protein was in the detergent phase and membrane fraction, confirming that the j5R protein was membrane-associated.
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Key words African swine fever virus(ASFV), j5R ORF, Membrane protein
病毒膜蛋白是激发机体产生免疫应答或参与病毒装配的重要蛋白质。这些蛋白质借助其跨膜片段的疏水性质，将其多肽链导向脂质单位膜，因此常存在于有囊膜病毒或其感染细胞的表面。前者与病毒吸附、介导细胞膜融合或穿透细胞、参与病毒感染早期过程密切相关，针对这些病毒蛋白的抗体对阻止病毒感染扩散起着至关重要的作用。后者具有表面和外部抗原的强免疫原性质，常常是激发机体免疫应答，尤其是细胞毒性T淋巴细胞的有效抗原[1]。经电脑预测，ASFV j5R阅读框编码由111个氨基酸组成的膜蛋白。本文报道该蛋白的表达与鉴定。
1 材料和方法
1.1 材料
用于蛋白多肽二级结构分析的GCG程序购于美国威斯康星大学。除另有说明外，所有化学药品均来自Sigma公司。分子生物学试剂，包括限制性内切酶、Taq DNA聚合酶 、连接酶、强化化学荧光蛋白转印杂交(Enhanced Chemiluminescent Western Blot, ECL Western Blot)试剂等，分别购自德国Beohinger Mannheim、美国Promega及英国Amersha公司。所有细胞、病毒、血清等均由英国动物健康研究所提供。
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1.2 方法
1.2.1 蛋白多肽的二级结构分析
先将ASFV(Malawi LIL 20/1)j5R阅读框的核苷酸序列[2]转译成氨基酸序列，然后用Peptidestructure程序预测其抗原性(antigenicity)、弹性度(flexibility)、亲水性(hydrophilicity)及表面概率(surface probability)；用Sigcleave程序预测其蛋白水解部位；用Motifs程序预测其潜在氨基酸功能区。
1.2.2 多肽合成和抗体制备
根据电脑预测，j5R蛋白的第86～103个氨基酸具有较高的抗原指数，为潜在的抗原决定簇(图1)。根据此决定簇序列，用固相法[3]合成由17个氨基酸(亮-赖-谷-丙-谷-天冬酰胺-赖-酪-色-色-谷氨酰胺-天冬酰胺-酪-天冬-脯-酪-丝氨酸)组成的多肽。
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将500 μg合成肽溶于750 μL PBS中，与等体积佛氏完全佐剂混匀后分5点(1点肌肉，4点皮下)注射一只新西兰白兔。注射后第21和42天，每只兔用1/2剂量与不完全佐剂混合的合成肽加强免疫。第64天时，免疫兔的ELISA滴度仍不很高，遂用500 μg合成肽再次加强免疫。3周后采血，分离血清。兔抗合成肽免疫球蛋白用ProtOn亲和柱按厂家(Multiple Peptide system)说明提纯。
1.2.3 病毒纯化和病毒蛋白抽提
用Percoll梯度离心法从ASFV(Uganda株)感染细胞上清中提纯细胞外病毒按Carrascosa法[4]进行。
将100 μL纯化病毒置于离心浓缩管(Centricon-100)中，向管中加入10% N-Octyl β-D-glacopyranoside(NOG)至最终浓度为0.1%，4 ℃孵育1 h后离心(3000 r/min, Denley BR 401低温离心机)分离病毒颗粒和洗脱蛋白，收集下管中的抽提蛋白，病毒再分别用0.25%、0.5%和1.0%NOG按上述方法抽提一次。抽提蛋白和抽提后的病毒用兔抗j5R合成肽抗体进行ECL Western Blot分析。
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1.2.4 病毒感染细胞
猪骨髓细胞培养按发表的方法[5]制备。向长成单层的10 mL细胞管中加入0.5 mL Malawi LIL 20/1 ASFV病毒液，继续培养至出现明显血吸附现象(约48 h)时倾去培养液，并向培养管中加入0.5 mL细胞裂解缓冲液(50 mmol/L Tris HCl, pH8.0, 120 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 0.5%NP40)，裂解细胞保存于-70 ℃备用。
1.2.5 ECL Western blot
10%SDS-PAGE按常规方法进行。电泳后，用Western Blotter按厂家说明将蛋白转印到Immobilon-P膜上(0.8～1.0 mA/cm2膜，25～30 min)。蛋白杂交按常规方法进行，封闭液为含10%犊牛血清和0.1% Tween 20的PBS， 第一抗体为兔抗j5R合成肽Ig，第二抗体为辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白，用ECL Western Blotting Detection Reagents按厂家说明显示杂交信号。
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1.2.6 免疫荧光
BSC40细胞培养于Lab-Tek细胞培养仓内。待细胞接近单层时，用Uganda ASFV感染细胞(37 ℃, 2 h)。于感染后不同时间倾去培养液，并用PBS洗涤后进行免疫荧光染色。表面染色直接用活细胞或经4%副甲醛固定(室温30 min)的细胞进行；细胞内染色的细胞先用冷却甲醇固定5 min，然后按常规方法染色。第一抗体为兔抗j5R合成肽Ig，第二抗体为FITC标记的羊抗兔IgG。
1.2.7 两相分离
按Bordier的两相分离试验法[6]，用Triton X-114抽提纯化ASFV颗粒膜蛋白。
1.2.8 细胞分级分离(fractionation)
细胞分级分离按Chatis和Morrison的方法[7]进行。感染细胞为IBRS 2细胞，毒株为Uganda株，阳性对照为35s标记的水泡性口炎病毒(Vescular stomatitis virus, VSV)感染的IBRS 2细胞。
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2 结果
2.1 蛋白多肽的二级结构分析
ASFV(Malawi LIL 20/1)的j5R阅读框位于该病毒基因组SalⅠ酶消化后的J片段，由病毒基因组的正链编码，阅读方向朝向基因组的右端。该阅读框由333 bp组成，编码由111个氨基酸组成的12.9 kDa蛋白质[2]。
用Prosrch和Tfasta程序分别查询Swissprot(Version 28)和Gen EMBL资料库，未发现与之同源的氨基酸序列。查询Prosite资料库(错配=0)发现1个潜在糖基化部位(第65个残基)和4个磷酸化部位(图1)。Peptidestructure程序分析表明，j5R多肽链的N-末端第1～20和25～40个残基的疏水值较高，为潜在膜蛋白跨膜区(图1)。
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图1 ASFV j5R蛋白多肽的2级结构分析。纵坐标代表亲水值(>0)和疏水值(<0)，顶排数字代表氨基酸残基位置，黑色区域代表潜在的膜蛋白跨膜区，阴影区域代表用于制备j5R合成肽的潜在抗原决定簇，P代表磷酸化部位，G代表N-交联的糖基化部位。
Fig.1 Secondary structure analysis of ASFV j5R polypeptide. The ordinate represents hydrophilicity (>0) and hydrophobicity (<0), top row the positions of amino acid residues, darkened areas the putative transmembrane domains, shaded area the potential antigenic determinant used to make the j5R synthetic peptide, P phosphorylation sites, and G N-linked glycosylation site, respectively.
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2.2 j5R蛋白在病毒感染细胞中的表达与定位
用亲和层析纯化的兔抗j5R合成肽的抗体，对ASFV Malawi LIL 20/1株感染48 h后的猪骨髓细胞进行ECL Westen blot分析显示，j5R阅读框C端序列特异抗体能在病毒感染细胞中检测到分子量为23 kDa的特异蛋白，而正常兔血清不能显示此蛋白，正常猪骨髓细胞中也无此蛋白(图2)。
图2 病毒感染细胞的ECL Western blot分析。未感染(Mock-infected, M)和Malawi LIL20/1毒株感染(Infected,I)的猪骨髓细胞(Porcine bone marrow cells, PBM)经10%SDS-PAGE分离后，用兔抗j5R合成肽抗体测定细胞中的j5R蛋白。
Fig.2 ECL Western blotting analysis of ASFV-infected cells. Mock-infected (M) and Malawi LIL20/1 ASFV-infected (I) pig bone marrow cells (PBM) were separated by 10% SDS-PAGE, followed by ECL Western blotting using rabbit anti-j5R peptide Ig as the antibody.
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以兔抗j5R合成肽Ig为抗体，在感染后4～16h进行的免疫荧光试验结果显示，j5R蛋白的细胞表面染色为阴性，但从感染后10 h起，细胞内染色转为阳性。j5R蛋白主要位于靠近细胞核周围的病毒复制部位(图3)。
图3 ASFV感染细胞的免疫荧光分析。Uganda毒株感染16 h后的IBRS2细胞用兔抗j5R合成肽抗体显示j5R病毒蛋白的存在。该蛋白先散在于细胞核周围(见照片中间之细胞)，然后向病毒装配部位(照片中的白色区域)集中(放大倍数100×)。
Fig.3 Immunofluoresccence showing intracellular staining of the j5R protein. IBR2 cells were infected with Uganda ASFV strain, harvested at 16 h post-infection and stained with rabbit anti-j5R peptide Ig followed by FITC-congugated goat anti-rabbit IgG (×100). The protein was detected as multiple small perinuclear foci (in the middle of the picture) and localized in the virus assembly sites (white areas).
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2.3 j5R蛋白在细胞外病毒粒子中的表达和定位
将Percoll梯度离心法从Uganda毒株感染的IBRS 2细胞培养上清中提纯的细胞外病毒蛋白转印到醋酸纤维素膜上，用兔抗j5R合成肽抗体进行ECL Western blot分析。结果表明，j5R阅读框C端序列特异抗体能在纯化的病毒中检测到25 kDa蛋白，而正常兔血清不能显示此蛋白(图4)。
为了进一步证实上述25 kDa蛋白为病毒结构蛋白，依次用0.1%、0.25%、0.5%和1.0%NOG洗涤纯化的细胞外病毒，然后以兔抗j5R合成肽Ig为抗体进行ECL Western blot分析。结果表明，j5R蛋白不在低浓度(0.1%)NOG即能洗脱的非特异性吸附蛋白或病毒外膜蛋白之列，需0.5%的NOG才能从病毒颗粒上洗脱下来(图4)。
, 百拇医药 图4 纯化ASFV颗粒的ECL Western blot分析。A.两轮Percoll梯度离心纯化的细胞外有囊膜病毒经10%SDS-PAGE分离后，用正常兔血清(1)或兔抗j5R合成肽抗体显示j5R蛋白的存在。B.纯化病毒分别用不同浓度的NOG抽提后，用同样抗体显示洗脱液中的j5R蛋白。
Fig.4 ECL Western blotting analysis of purified ASFV particles.A. Extracellular enveloped virus particles purified by 2 cycles of Percoll gradient centrifugation were separated by 10% SDS-PAGE for Western blotting with normal rabbit serum (1)or rabbit anti-j5R peptide Ig (2). B. The purified virus was extracted sequentially with different concentrations of NOG, followed by Western blotting using rabbit anti-j5R peptide Ig as the antibody.
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2.4 j5R蛋白与病毒及其感染细胞膜性结构的关系
纯化的细胞外病毒经3次Triton X-114抽提后，取每次抽提的无机相(水相)和有机相(油相)进行电泳，以兔抗j5R合成肽的Ig为抗体进行ECL Western blot分析，同时用针对ASFV 72 kDa结构蛋白的单抗作为非膜蛋白对照[9]，用针对ASFV编码的Ubiquitin抗体为膜蛋白阳性对照[10]。结果显示，和已知的膜蛋白Ubiquitin一样，j5R蛋白存在于两相分离后的有机相中(图5)。
图5 ASFV的两相分离试验。Percoll梯度离心纯化的细胞外有囊膜病毒顺次用1.0%(1)，0.5%(2)和2.0% Triton X-114抽提后，用兔抗j5R合成肽Ig为抗体，用ECL Western blot法测定油相(1和2)及水相(3)中的j5R蛋白。
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Fig.5 Phase separation of membrane proteins. The extracellular enveloped ASFV particles purified by Percoll gradient centrifugation were sequentially extracted with 1.0% (1), 0.5% (2) and 2.0% Triton X-114 and the existence of the j5R protein in the detergent phases (1 and 2) or aqueous phase was demonstrated by Western blotting using rabbit anti-j5R peptide Ig as the antibody.
用氮气爆破法破碎Uganda ASFV感染16 h后的IBRS 2细胞，用8%蔗糖梯度离心法进行细胞分级分离。分离后的水溶性和膜性蛋白经SDS-PAGE分离后，用兔抗j5R合成肽Ig为抗体进行ECL Western blot分析。试验中，用针对VSV G蛋白的单抗作为膜蛋白阳性抗体对照[7]。结果表明，j5R蛋白存在于病毒感染细胞的膜性结构中(图6)。
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图6 ASFV感染细胞的分级分离试验。Uganda毒株感染的IBRS2细胞经匀浆化后，用8%蔗糖梯度离心法分离细胞内膜性囊泡，然后以兔抗j5R合成肽Ig为抗体，以ECL Western blot法测定经1.2% Triton X-100和12.2%蛋白酶K处理前(1)及处理后(2)的膜性囊泡中的j5R蛋白。
Fig.6 Fractionation of ASFV-infected cells. IBRS2 cells infected with Uganda ASFV strain were homogenized and the vesicles were obtained by 8% sucrose gradient centrifugation. The existence of j5R protein in the vesicles before (1) and after (2) treatment with 1.2% Triton X-100 and 12.2% proteinase K was demonstrated by Western blotting using rabbit anti-j5R peptide Ig as the antibody.
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3 讨论
蛋白多肽的二级结构电脑分析结果表明，ASFV(Malawi LIL 20/1株)的j5R阅读框编码由111个氨基酸组成的12.9 kDa蛋白质，其C末端具有一个潜在的抗原决定簇(图1)。兔抗j5R合成肽的特异抗体能在细胞外病毒(Uganda株)和病毒感染细胞中测到分子量为23或25 kDa的蛋白，而正常兔血清不能显示该蛋白的存在，说明j5R合成肽特异抗体测到的蛋白为ASFV特异蛋白。病毒颗粒和感染细胞中j5R蛋白分子量的差异，与所用病毒之毒株不同有关，详细资料另文发表。值得一提的是，j5R蛋白的实际分子量(23或25 kDa)约是其理论计算分子量(12.9 kDa)的两倍，其原因可能由该蛋白跨膜区α-螺旋结构之间相互作用形成的二聚体或该蛋白在凝胶上的异常移行(含有较多酸碱性氨基酸)所致，而与该基因定序错误、多肽链的糖基化或因二硫键形成的二聚体无关[11]。
Western blot结果显示，j5R蛋白存在于细胞外病毒颗粒上，但据此不能得出j5R蛋白是ASFV结构蛋白的结论，尚有病毒颗粒的非特异性吸附蛋白之可能。为排除这种可能性，作者 先用不同浓度的NOG洗涤纯化的病毒粒子，然后用Western blot测定洗脱液的病毒蛋白。其理论依据是，NOG是作用缓和的非离子去污剂，对病毒粒子蛋白具有洗脱作用，在一定浓度范围内，浓度愈高，洗脱作用愈强，据此不仅可以区别病毒结构蛋白和非特异性吸附蛋白，还可以了解蛋白在病毒粒子中的相对位置，据报道，0.1%NOG即能洗脱ASFV病毒颗粒的非特异吸附蛋白或暴露于病毒颗粒表面的外膜蛋白[8]。从本试验结果来看，j5R蛋白需0.5%NOG才能从病毒粒子上洗脱下来，说明该蛋白不仅是病毒结构蛋白，而且位于病毒粒子的较深层。
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所有膜蛋白均含有1个或多个约由20个疏水氨基酸组成的跨膜片段(即跨膜区)，此跨膜片段与信号肽的核心区(即h-区)相似，能与信号识别颗粒结合，从而将新生肽链导入内质网[12]。目前已有预测膜蛋白的电脑程序，而且准确率很高[13]。用此类程序对j5R蛋白进行的预测结果显示，j5R蛋白的第1～20和25～40个残基的疏水值很高，为两个相邻的潜在跨膜区(图1)，提示j5R蛋白很可能是膜蛋白。在用纯化病毒颗粒进行的两相分离试验中，j5R存在于两相分离后的有机相中，符合膜蛋白的特点，证明该蛋白是膜相关蛋白。
膜蛋白由位于粗面内质网表面的所谓膜性核糖体合成，在转译同时，新生肽链转位进入内质网，并在此初步折叠和加工修饰后，进入高尔基体作进一步加工修饰，最后包裹在膜性囊泡(vesicle)内运往细胞浆膜或其他膜性亚细胞结构[14]。因此，膜蛋白在合成、折叠、加工修饰，直至到达最后目的地的整个过程中，都处于细胞的膜性结构中，这为用细胞分级分离法(fractionation)鉴定膜蛋白提供了理论依据。从试验结果来看，j5R蛋白存在于ASFV感染细胞分级分离后的膜性结构中，进一步证明它是膜蛋白。
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致谢 Drs Wilkinson P J, Hutchings G和Williams S提供病毒株、免疫血清和其他帮助，本院李俊宝副教授仔细阅读此稿，谨致谢忱。
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