杆状病毒增效蛋白研究进展
作者：马永平 欧 洋 孟小林 徐进平 叶林柏
单位：武汉大学病毒研究所，武汉430072
关键词：杆状病毒；增效蛋白；舞毒蛾核型多角体病毒；颗粒体病毒
中国病毒学/990301 Research Advances on Baculovirus Enhancin
Ma Yongping Ou Yang Meng Xiaolin Xu Jinping Ye Linbai
(Institute of Virology, Wuhan University, Wuhan 430072)
Key words Baculovirus, Enhancin, Lymantria dispar MNPV (LdMNPV), Granulosis virus (GV)
, 百拇医药
昆虫杆状病毒增效蛋白(enhancin)曾被称为病毒促进因子(synergistic factor, SyF)或病毒增效因子(viral enhancing factor, VEF)，它长期以来被认为只存在于昆虫颗粒体病毒(Granulosis virus, GV)中的一类蛋白质，已知有8种GV中含有增效蛋白。自Tanada[1～4]1959年从美洲一星粘虫(Pseudaletia unipuncta, Pu)GV中分离出增效蛋白并证实它有增强PuMNPV的感染力后，一直很受人们关注。从它的作用机理到氨基酸序列和基因结构等方面都进行了大量研究。90年代初，Hashimoto[5]和Roelvink[6]等人先后分别对粉纹夜蛾GV(Trichoplusia ni GV, TnGV)和PuGV、棉铃虫GV(Heliothis armigera, HaGV)的增效蛋白基因进行了克隆和测序，并对它们的氨基酸序列进行了分析，发现三者间有很大的同源性和相似性。Roelvink[6]等人还在另外两种GV：小菜粉蝶GV(Pieris rapae, Pira GV)和旋幽夜蛾GV(Scotogramma trifolii GV, Sctr GV)中检出有增效蛋白的存在。虽然在昆虫痘病毒(entomopoxvirus, EPV)中也有类似的具增效作用的蛋白成分[7]，但它与GV的增效蛋白不同，而在核型多角体病毒(Nuclear polyhedrosis virus, NPV)中长期未见报道。直至1997年，Bischoff[8]等人从一种舞毒蛾NPV(Lymantria dispar MNPV, LdMNPV)基因组中克隆出一个增效蛋白基因，并对它进行了核苷酸和氨基酸序列分析，发现LdMNPV的增效蛋白基因结构和已测序的3种GV(Tn GV, PuGV, HaGV)的增效蛋白基因结构很相似；它与GV的氨基酸序列也有29%的同源性。随后，他们又对LdMNPV的增效蛋白基因进行了表达[9]。在NPV中发现增效蛋白及其基因尚属首例，这一发现对增效蛋白及对GV与MNPV之间关系的研究有重大意义。本文主要对LdMNPV增效蛋白的基因结构、氨基酸序列作一介绍，并与已知的3种GV作一比较。
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1 增效蛋白的性质
增效蛋白是由病毒基因编码的一种磷脂蛋白，分子量大小在89～110kD，它不但能增强多种核型多角体病毒(NPV)对昆虫幼虫的感染力，也能增强NPV对体外培养细胞的感染力，而且还能提高Bt等其它生物杀虫剂的功效[10]。在GV中，增效蛋白存在于包涵体包膜蛋白中[11]，约占GV蛋白质的5%。在LdMNPV中，它存在于多角体蛋白中。现已证明，增效蛋白具有金属蛋白酶活性[12]，能降解昆虫中肠围食膜，PuGV的增效蛋白还具有酯酶活性[13]。就目前所知，增效蛋白以两种模式起增效作用：第一种是发挥金属蛋白酶活性，降解昆虫中肠的围食膜，破坏中肠粘膜的物理屏障，使病毒粒子更容易进入细胞，增加病毒的相对感染量；另一种是直接作用于质膜和病毒包涵体膜上的增效蛋白受体位点，促进病毒粒子与质膜的融合[14～18]，增加NPV的感染力。
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2 LdMNPV的增效蛋白及其基因
LdMNPV的基因组大小为162kb，虽然它的基因组未全部被测序，但与AcMNPV共有的几个基因已被测定。与AcMNPV相比，LdMNPV DNA中额外存在29kb的碱基对，它提示该病毒可能带有几个AcMNPV中不存在的基因，现已证明有两个基因：宿主范围因子-1(hrf-1)基因和G22基因是LdMNPV所特有的，此外，还发现了LdMNPV的增效蛋白基因也是AcMNPV所没有的。
2.1 LdMNPV增效蛋白基因
LdMNPV增效蛋白基因位于25kD FP(few polyhedron)基因和hrf-1基因之间，整个ORF位于SstⅡ片段内，大小约4.2kb。有一个2346bp的ORF，编码分子量为89kD、氨基酸残基数为782的蛋白质，它与3种GV的增效蛋白比较见表1。
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表1 4种病毒增效蛋白及基因比较
Table 1 Comparison of the four enhancins and its genes 病毒
ORF
氨基酸数
所在酶切片段及大小
分子量
LdMNPV
2346bp
782
SstⅡ, 4.2kb
89kD
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TnGV
2703bp
901
HindⅢ-M, 3.5kb
104kD
PuGV
2703bp
901
HindⅢ-M, 3.5kb
104kD
HaGV
2706bp
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902
BamHI, 5.2kb
110kD
LdMNPV增效蛋白的ORF开始于+49，止于+2395位核苷酸，在ORF上游+36处有一可能是杆状病毒晚期启动子的序列TTAAG，与三种GV的增效蛋白基因结构很相似。晚期启动子序列在TnGV中，是ATAAG[5]，在PuGV和HaGV中分别是ATAAG[6]和TTAAG[6]，这说明LdMNPV与GV的增效蛋白可能有相同的启动机理，也暗示它们有相似的起源。另外，在TnGV的ATAAG上游有3个重复的TTACAAGA序列，而在LdMNPV和PuGV\,HaGV的增效蛋白基因中却没有发现，说明它们的基因组结构又有变化。
LdMNPV增效蛋白基因下游与hrf-1基因之间没有Poly(A)信号序列，这一点也与3种GV的增效蛋白基因相似。进一步比较发现，尽管LdMNPV与GV的增效蛋白基因下游结构相似，但LdMNPV的hrf-1与GV的ORF2之间没有任何同源性。
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2.2 LdMNPV增效蛋白的氨基酸序列分析
LdMNPV增效蛋白基因编码的蛋白质分子较GV的小，具体区别见表1。将已知的4种增效蛋白的氨基酸序列进行比较，发现在N-末端有同源性，而C-末端的同源性很小。LdMNPV增效蛋白序列与每种GV增效蛋白氨基酸之间有31%的同源性(与TnGV为32.1%，与PuGV为32.2%，与HaGV为31.4%)，有55%的相似性(与TnGV为54.7%，与PuGV为55.2%，与HaGV为55.6%)，而GV增效蛋白之间氨基酸的同源性达81%～98%，相似性达90%，说明MNPV与GV的增效蛋白基因已发生了分化。
增效蛋白的一个显著特点是在氨基酸序列中有一个典型的金属蛋白酶锌结合保守区氨基酸序列HEXXH，在LdMNPV中于241～246位之间，在3种GV的增效蛋白中于244～248位之间，因此，这4种增效蛋白都是金属蛋白酶超家族成员[19]。在这类酶中，Zn2+与HEXXH序列中的两个H残基络合，然后再与该序列下游20～120氨基酸间的D、H、C、E中的任一氨基酸残基络合。比较4种增效蛋白的氨基酸序列发现，在HEXXH下游20～120位之间有两个E残基和两个D残基非常保守，其中任何一个氨基酸残基都可与Zn2+结合。在金属蛋白酶HEXXH序列中，E残基作为催化基团，使一个水分子极性化亲核攻击肽链上的肽键并使之断裂。1996年，Lepore等[20]证明TnGV的增效蛋白是一个金属蛋白酶，能降解昆虫中肠(围食膜)的粘蛋白。由此推测，其它两种GV和LdMNPV的增效蛋白可能主要是以金属蛋白酶形式起增效作用的。这也就很容易解释为什么TnGV增效蛋白对Bt伴孢晶体和β-外毒素等也有增效作用。
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增效蛋白的另一个显著特点是有丰富的可能的糖基化序列——NXS/T。LdMNPV有9个，TnGV有12个，PuGV有11个，HaGV有7个。这些可能的糖基化位点在GV增效蛋白序列中表现出极大的位置保守性，而TnGV、PuGV中的保守性更大(见表2)，说明这些可能的糖基化位点对增效蛋白的活性是不可缺少的。LdMNPV增效蛋白可能的糖基化位点与GV的不同。但有两个可能的糖基化位点距HEXXH下游的相对位置极相似，由此推断，这两个位点的糖基化可能对增效蛋白的功能是很重要的。表2 4种增效蛋白中可能的糖基化位点比较
Table 2 The potential glycosylation sites in the peptides of the four enhancins
1
2
3
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4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
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18
19
LdMNPV
-237
-166
-157
-104
-22
-16
-
-
-
-
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+186
-
-
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TnGV
-
-177
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+101
-
+292
+345
+372
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PuGV
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HaGV
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+292
+345
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注：距HEXXH上游的相对位置用负号表示，下游的相对位置用正号表示。
增效蛋白的第三个显著特点是含有丰富的酸性氨基酸，4种增效蛋白中酸性氨基酸占总氨基酸百分数分别为：LdMNPV 19.56%、TnGV 20.60%、PuGV 21.42%、HaGV 22.28%，平均为20.97%。而碱性氨基酸所占的百分数较低，依次为11.25%、11.43%、5.43%和12.41%，平均为10.13%。增效蛋白的氨基酸组成也很相似，推测它可能由同一个共同的基因进化而来。
综上所述，无论从基因结构还是氨基酸序列，LdMNPV与GV的增效蛋白都极其相似，那么，LdMNPV中增效蛋白的来源便是一个很有趣的问题。我们从现有的资料推测，LdMNPV的增效蛋白基因很可能来自GV，是MNPV与GV在自然状态下基因重组的产物。其原因是：第一，迄今所知，杆状病毒增效蛋白在GV中存在较MNPV中普遍，无疑GV的基因组是增效蛋白的天然基因库；第二，LdMNPV增效蛋白基因结构与GV增效蛋白基因结构极其相似，没有MNPV中已知基因的特征结构；第三，LdMNPV增效蛋白与GV增效蛋白有较大的同源性，有共同的酶活性中心，而与已知的其它蛋白间没有任何同源性[10]，推测它不是MNPV中普遍存在的成分。
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3 增效蛋白在害虫防治上应用的展望
增效蛋白因能增加多种NPV对昆虫的感染力而倍受关注，纯化的TnGV增效蛋白与AcMNPV一同饲喂T.ni幼虫时，能使AcMNPV对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)感染力提高12倍[21]；与Bt混合使用，能使Bt毒力提高2～7倍[10]。因此，增效蛋白在提高杆状病毒杀虫效率和拓宽害虫综合防治的领域显示出诱人的前景。上面所述两种增效机理，对MNPV的增效作用二者兼有，对Bt等其它杀虫剂的增效作用可能主要以第一种方式起作用。这就使增效蛋白的增效作用扩展到杆状病毒以外，使其应用范围更加广阔。Bichoff[8]等人通过缺失突变LdMNPV增效蛋白基因证明，增效蛋白只增加MNPV的感染力，并不增加杀虫速度。增效蛋白的双重作用机制，在实践上有极大的应用价值。
首先，可以将增效蛋白基因重组在AcMNPV等广谱MNPV中，生产广谱高效的重组病毒。LdMNPV增效蛋白基因的发现，使这一可能性变为现实，说明将增效蛋白基因重组到MNPV中表达生效是可行的、有效的。我们认为，MNPV的P10基因位点是理想的插入位点[22～24]，这是因为：第一，P10基因是病毒复制非必需的最晚期表达基因；第二，P10启动子是非常强大的最晚期启动子之一；第三，P10蛋白缺失，并不影响多角体的形成，还能增加AcMNPV的感染力[20]，使NPV的多角体蛋白更易被降解。这就能使昆虫在降解多角体的同时释放增效蛋白，使二者同步发生作用，减小病毒的使用量，增加感染率，缩短杀虫时间。
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其次，可以解决昆虫对转基因植物的抗性问题。业已证明增效蛋白对Bt有增效作用，若在转入Bt伴孢晶体蛋白基因等毒素基因的同时转入增效蛋白基因，既可增强转基因植物的抗虫能力，又能防止昆虫对单一有效成分产生抗性，这是一条经济有效的途径之一。
再次，将增效蛋白基因导入Bt等细菌或其它真菌杀虫微生物中，生产重组Bt等杀虫微生物，这样一方面解决了病毒制剂难于大量生产和容易失活的难题，又提高了Bt等药效，缩短杀虫时间。更重要的是，Bt等杀虫微生物可大批量发酵生产、成本低，生产技术成熟、杀虫谱广，有广阔的应用前景。
总之，研制和开发无公害的高效生物杀虫剂以逐步减少化学农药用量，是今后农林害虫综合防治的发展趋势，杆状病毒增效蛋白的作用特点，在这方面显示出极大的应用潜力。增效蛋白在生物农药中的实际应用，是生物农药改良的重要途径之一。
参考文献
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1 增效蛋白的性质
增效蛋白是由病毒基因编码的一种磷脂蛋白，分子量大小在89～110kD，它不但能增强多种核型多角体病毒(NPV)对昆虫幼虫的感染力，也能增强NPV对体外培养细胞的感染力，而且还能提高Bt等其它生物杀虫剂的功效[10]。在GV中，增效蛋白存在于包涵体包膜蛋白中[11]，约占GV蛋白质的5%。在LdMNPV中，它存在于多角体蛋白中。现已证明，增效蛋白具有金属蛋白酶活性[12]，能降解昆虫中肠围食膜，PuGV的增效蛋白还具有酯酶活性[13]。就目前所知，增效蛋白以两种模式起增效作用：第一种是发挥金属蛋白酶活性，降解昆虫中肠的围食膜，破坏中肠粘膜的物理屏障，使病毒粒子更容易进入细胞，增加病毒的相对感染量；另一种是直接作用于质膜和病毒包涵体膜上的增效蛋白受体位点，促进病毒粒子与质膜的融合[14～18]，增加NPV的感染力。
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2 LdMNPV的增效蛋白及其基因
LdMNPV的基因组大小为162kb，虽然它的基因组未全部被测序，但与AcMNPV共有的几个基因已被测定。与AcMNPV相比，LdMNPV DNA中额外存在29kb的碱基对，它提示该病毒可能带有几个AcMNPV中不存在的基因，现已证明有两个基因：宿主范围因子-1(hrf-1)基因和G22基因是LdMNPV所特有的，此外，还发现了LdMNPV的增效蛋白基因也是AcMNPV所没有的。
2.1 LdMNPV增效蛋白基因
LdMNPV增效蛋白基因位于25kD FP(few polyhedron)基因和hrf-1基因之间，整个ORF位于SstⅡ片段内，大小约4.2kb。有一个2346bp的ORF，编码分子量为89kD、氨基酸残基数为782的蛋白质，它与3种GV的增效蛋白比较见表1。
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表1 4种病毒增效蛋白及基因比较
Table 1 Comparison of the four enhancins and its genes 病毒
ORF
氨基酸数
所在酶切片段及大小
分子量
LdMNPV
2346bp
782
SstⅡ, 4.2kb
89kD
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TnGV
2703bp
901
HindⅢ-M, 3.5kb
104kD
PuGV
2703bp
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HindⅢ-M, 3.5kb
104kD
HaGV
2706bp
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BamHI, 5.2kb
110kD
LdMNPV增效蛋白的ORF开始于+49，止于+2395位核苷酸，在ORF上游+36处有一可能是杆状病毒晚期启动子的序列TTAAG，与三种GV的增效蛋白基因结构很相似。晚期启动子序列在TnGV中，是ATAAG[5]，在PuGV和HaGV中分别是ATAAG[6]和TTAAG[6]，这说明LdMNPV与GV的增效蛋白可能有相同的启动机理，也暗示它们有相似的起源。另外，在TnGV的ATAAG上游有3个重复的TTACAAGA序列，而在LdMNPV和PuGV\,HaGV的增效蛋白基因中却没有发现，说明它们的基因组结构又有变化。
LdMNPV增效蛋白基因下游与hrf-1基因之间没有Poly(A)信号序列，这一点也与3种GV的增效蛋白基因相似。进一步比较发现，尽管LdMNPV与GV的增效蛋白基因下游结构相似，但LdMNPV的hrf-1与GV的ORF2之间没有任何同源性。
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2.2 LdMNPV增效蛋白的氨基酸序列分析
LdMNPV增效蛋白基因编码的蛋白质分子较GV的小，具体区别见表1。将已知的4种增效蛋白的氨基酸序列进行比较，发现在N-末端有同源性，而C-末端的同源性很小。LdMNPV增效蛋白序列与每种GV增效蛋白氨基酸之间有31%的同源性(与TnGV为32.1%，与PuGV为32.2%，与HaGV为31.4%)，有55%的相似性(与TnGV为54.7%，与PuGV为55.2%，与HaGV为55.6%)，而GV增效蛋白之间氨基酸的同源性达81%～98%，相似性达90%，说明MNPV与GV的增效蛋白基因已发生了分化。
增效蛋白的一个显著特点是在氨基酸序列中有一个典型的金属蛋白酶锌结合保守区氨基酸序列HEXXH，在LdMNPV中于241～246位之间，在3种GV的增效蛋白中于244～248位之间，因此，这4种增效蛋白都是金属蛋白酶超家族成员[19]。在这类酶中，Zn2+与HEXXH序列中的两个H残基络合，然后再与该序列下游20～120氨基酸间的D、H、C、E中的任一氨基酸残基络合。比较4种增效蛋白的氨基酸序列发现，在HEXXH下游20～120位之间有两个E残基和两个D残基非常保守，其中任何一个氨基酸残基都可与Zn2+结合。在金属蛋白酶HEXXH序列中，E残基作为催化基团，使一个水分子极性化亲核攻击肽链上的肽键并使之断裂。1996年，Lepore等[20]证明TnGV的增效蛋白是一个金属蛋白酶，能降解昆虫中肠(围食膜)的粘蛋白。由此推测，其它两种GV和LdMNPV的增效蛋白可能主要是以金属蛋白酶形式起增效作用的。这也就很容易解释为什么TnGV增效蛋白对Bt伴孢晶体和β-外毒素等也有增效作用。
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增效蛋白的另一个显著特点是有丰富的可能的糖基化序列——NXS/T。LdMNPV有9个，TnGV有12个，PuGV有11个，HaGV有7个。这些可能的糖基化位点在GV增效蛋白序列中表现出极大的位置保守性，而TnGV、PuGV中的保守性更大(见表2)，说明这些可能的糖基化位点对增效蛋白的活性是不可缺少的。LdMNPV增效蛋白可能的糖基化位点与GV的不同。但有两个可能的糖基化位点距HEXXH下游的相对位置极相似，由此推断，这两个位点的糖基化可能对增效蛋白的功能是很重要的。表2 4种增效蛋白中可能的糖基化位点比较
Table 2 The potential glycosylation sites in the peptides of the four enhancins
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注：距HEXXH上游的相对位置用负号表示，下游的相对位置用正号表示。
增效蛋白的第三个显著特点是含有丰富的酸性氨基酸，4种增效蛋白中酸性氨基酸占总氨基酸百分数分别为：LdMNPV 19.56%、TnGV 20.60%、PuGV 21.42%、HaGV 22.28%，平均为20.97%。而碱性氨基酸所占的百分数较低，依次为11.25%、11.43%、5.43%和12.41%，平均为10.13%。增效蛋白的氨基酸组成也很相似，推测它可能由同一个共同的基因进化而来。
综上所述，无论从基因结构还是氨基酸序列，LdMNPV与GV的增效蛋白都极其相似，那么，LdMNPV中增效蛋白的来源便是一个很有趣的问题。我们从现有的资料推测，LdMNPV的增效蛋白基因很可能来自GV，是MNPV与GV在自然状态下基因重组的产物。其原因是：第一，迄今所知，杆状病毒增效蛋白在GV中存在较MNPV中普遍，无疑GV的基因组是增效蛋白的天然基因库；第二，LdMNPV增效蛋白基因结构与GV增效蛋白基因结构极其相似，没有MNPV中已知基因的特征结构；第三，LdMNPV增效蛋白与GV增效蛋白有较大的同源性，有共同的酶活性中心，而与已知的其它蛋白间没有任何同源性[10]，推测它不是MNPV中普遍存在的成分。
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3 增效蛋白在害虫防治上应用的展望
增效蛋白因能增加多种NPV对昆虫的感染力而倍受关注，纯化的TnGV增效蛋白与AcMNPV一同饲喂T.ni幼虫时，能使AcMNPV对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)感染力提高12倍[21]；与Bt混合使用，能使Bt毒力提高2～7倍[10]。因此，增效蛋白在提高杆状病毒杀虫效率和拓宽害虫综合防治的领域显示出诱人的前景。上面所述两种增效机理，对MNPV的增效作用二者兼有，对Bt等其它杀虫剂的增效作用可能主要以第一种方式起作用。这就使增效蛋白的增效作用扩展到杆状病毒以外，使其应用范围更加广阔。Bichoff[8]等人通过缺失突变LdMNPV增效蛋白基因证明，增效蛋白只增加MNPV的感染力，并不增加杀虫速度。增效蛋白的双重作用机制，在实践上有极大的应用价值。
首先，可以将增效蛋白基因重组在AcMNPV等广谱MNPV中，生产广谱高效的重组病毒。LdMNPV增效蛋白基因的发现，使这一可能性变为现实，说明将增效蛋白基因重组到MNPV中表达生效是可行的、有效的。我们认为，MNPV的P10基因位点是理想的插入位点[22～24]，这是因为：第一，P10基因是病毒复制非必需的最晚期表达基因；第二，P10启动子是非常强大的最晚期启动子之一；第三，P10蛋白缺失，并不影响多角体的形成，还能增加AcMNPV的感染力[20]，使NPV的多角体蛋白更易被降解。这就能使昆虫在降解多角体的同时释放增效蛋白，使二者同步发生作用，减小病毒的使用量，增加感染率，缩短杀虫时间。
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其次，可以解决昆虫对转基因植物的抗性问题。业已证明增效蛋白对Bt有增效作用，若在转入Bt伴孢晶体蛋白基因等毒素基因的同时转入增效蛋白基因，既可增强转基因植物的抗虫能力，又能防止昆虫对单一有效成分产生抗性，这是一条经济有效的途径之一。
再次，将增效蛋白基因导入Bt等细菌或其它真菌杀虫微生物中，生产重组Bt等杀虫微生物，这样一方面解决了病毒制剂难于大量生产和容易失活的难题，又提高了Bt等药效，缩短杀虫时间。更重要的是，Bt等杀虫微生物可大批量发酵生产、成本低，生产技术成熟、杀虫谱广，有广阔的应用前景。
总之，研制和开发无公害的高效生物杀虫剂以逐步减少化学农药用量，是今后农林害虫综合防治的发展趋势，杆状病毒增效蛋白的作用特点，在这方面显示出极大的应用潜力。增效蛋白在生物农药中的实际应用，是生物农药改良的重要途径之一。
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