转化生长因子β1的表达与肺放射性损伤关系研究
作者：孙苏平 金冶宁 魏怡 兰莉 董昭 余友渔
单位：200433 上海，中国人民解放军第二军医大学长海医院放射治疗科
关键词：转化生长因子β1；放射损伤；肺
中华放射肿瘤学杂志990309 【摘要】 目的 研究转化生长因子β1(TGF-β1) 在正常肺组织放射损伤中的作用。方法 采用免疫酶联法(ELISAs)、免疫组化、苏木素-伊红(HE)染色和维多利亚蓝(VB)染色等方法观察血清和组织中TGF-β1的表达与放射损伤的关系。结果 照射后血清中TGF-β1平均水平高于照射前，差异有显著意义(P<0.05);不同剂量组血清TGF-β1平均水平亦高于照射前，差异有显著意义(P<0.05)。HE染色各组照射区域均有急性炎症改变,20Gy组最明显；免疫组化TGF-β1蛋白的表达和VB染色胶原纤维和弹力纤维的改变高剂量组和观察期长者明显。结论 TGF-β1在正常肺组织放射性损伤中有非常重要的作用。
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Relation between transforming growth factor-β1 expression
and radiation injury of lung
SUN Suping,JIN Yening,WEI Yi,et al. Department of Radiation Oncology, Changhai Hospital,Secondary Medical University,PLA,Shanghai 200433
【Abstract】 Objective To investigate the effect of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) in radiation-induced injury of lung. Methods ELISAs,immuno-histochemical, HE ,anti-TGF-β1 and VB stains were used to observe the relation between TGF-β1 expression and radiation-induced injury of lung. Results The average serum TGF-β1 level after radiation was higher than before radiation(P<0.05). The average serum TGF-β1 level in different dose groups was also higher than before radiation (P<0.05). Acute inflammatory changes were more often seen in the HE group with the highest at 20Gy.Immuno-histochemical TGF-β1 expression and changes in VB collagenous and elastic fibers were predominantly observed in the high dose groups and long survivors. Conclusions Transforming growth factor-β1(TGF-β1),a biologic factor,plays a very important role in radiation induced injury of the normal lung.
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【Key words】 Transforming growth factor-β1;Radiation injury;Lung
转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)具有多种生物学功能,包括对正常组织的调节，对免疫系统的抑制及对肿瘤细胞生长的促进或抑制作用。本研究通过动物实验探讨TGF-β1在血清及组织中的表达与正常兔肺组织放射损伤的关系,从生物学角度研究放射损伤的原因,以期指导放射治疗方案的制定及并发症的预防。
1 材料与方法
1.1 动物：纯种新西兰白兔33只,体重3kg左右,由第二军医大学动物实验中心提供,标准颗粒饲料喂养。
1.2 分组：将33只实验兔随机分为4个组,前3个组为照射组,每组9只,分别单次照射10，20，30Gy;第4组6只为空白对照组。
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1.3 照射：用体积分数为0.3的氨基甲酸乙醇按750～1000mg/kg体重做腹腔麻醉。将麻醉好的实验兔前肢展开固定于塑料泡沫板的凹槽中,选取1只行胸部CT平扫,层厚为8mm,在治疗计划系统(TPS)下做计划,使照射区域在90%剂量曲线内。模拟机下定位,照射野3cm×3cm,中心位于气管分叉上1cm,包括上肺、气管、食管、脊髓和部分心脏及大血管。采用加速器10MV-X线,水平等中心照射,剂量比1∶1。
1.4 观察与处死：照射后观察肺、食管、脊髓损伤的临床表现。照射后4周和12周各剂量组分别随机抽取1只实验兔行胸部CT扫描,观察胸部照射区表现。照射组于4周开始每隔4周每组各处死2只实验兔,最后3只在18周时处死,观察大体标本肉眼改变及取材制片。对照组不做处理,同等条件饲养,18周处死, 取材制片。
1.5 血清标本的采集与测定
(1)采集：照射组每组6只共18只实验兔在照射前、后1周分别采血2mL,全部实验兔共27只均在照射后2，4周分别于耳廓前或后静脉穿刺抽血2mL,室温下静置3～4小时,2000～2500r/min离心20分钟,取血清0.5mL置于1.5mL聚丙二醇脂试管内,-20℃冰箱内保存待测。
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(2)测定：免疫酶联法检测(ELISAs)。TGF-β1小鼠单抗试剂盒为Genzyme公司产品,保存温度为2～8℃,测定前试剂盒内所有试剂均需达到室温(18～20℃),操作按说明书进行。
1.6 取材固定与制片
(1)取材固定：将实验兔固定于取材板上,股动脉放血，胸正中切口,分离皮肤至肋侧,沿胸骨两侧剪断肋骨,切除胸骨，暴露胸腔,将心脏、肺、气管、食管整体取出,截取胸段脊髓,切取心脏、肺、气管、食管、脊髓照射区域组织块,固定于10%福尔马林中48小时。
(2)制片：石蜡包埋连续切片,片厚5μm，苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察其形态学改变;免疫组织化学检测:抗TGF-β1小鼠单抗和羊抗鼠二抗为DAKO公司产品，操作按说明书加以改进,观察TGF-β1的表达,棕黄色颗粒为阳性结果;维多利亚蓝(VB)染色,光镜下观察胶原纤维和弹力纤维的改变, 胶原纤维呈红色, 弹力纤维呈蓝绿色。
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1.7 统计学方法：照射前、后血清TGF-β1平均水平用±s表示，两样本均数用t检验,多个样本均数比较用F检验和SNK方法,统计处理采用SAS软件包。
2 结果
2.1 大体观察
(1)体重：照射前3个组平均体重3.0kg,照射后均有不同程度消瘦、体重下降,最少者减少0.4kg,最多者减少1.2kg,平均0.5kg。
(2)放射损伤临床表现：食管损伤症状主要表现为进食减少、明显消瘦;肺损伤症状主要表现为呼吸急促、活动受限;脊髓损伤症状主要表现为步态不稳、双后肢肌力减退,出现时间从1周到6周不等。放射损伤的程度与照射剂量成正比,即照射量大者症状出现早,损伤表现明显。30Gy组照射1周后即进食减少、消瘦,2周后陆续出现脊髓损伤表现;10Gy组则在6周后才出现各种损伤症状。照射后4周胸部CT扫描20Gy组2个肺尖和左上肺呈炎症改变,其它2个组未见明显异常表现,而12周时胸部CT各组均见不同程度炎症表现。
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(3)开胸所见：照射后4周处死10Gy组肉眼观察无明显改变,8周处死20Gy组5只实验兔可见1.5～4.0mL淡黄色心包积液,3只可见1～2mL淡黄色清亮胸腔积液;30Gy组3只实验兔可见2.0～4.5mL淡黄色心包积液;部分实验兔特别是12周处死者可见有纵膈纤维结缔组织粘连。
2.2 血清标本测定结果
(1)照射前、后及不同时间的血清TGF-β1水平比较：照射前血清TGF-β1最高达9.88 μg/L,最低达1.58 μg/L,平均为3.12±2.35 μg/L；照射后血清TGF-β1最高达16.23 μg/L,最低达1.30μg/L,平均为4.79±3.10μg/L，二者比较差异有极显著意义(t=4.51,P<0.01)。照射后1，2，4周的血清TGF-β1平均水平分别为5.47±2.01μg/L，4.27±2.87μg/L，5.66±3.73μg/L,均高于照射前，照射前、后组间差异有显著意义(F=3.33,P<0.05)。照射后第2周比第1周降低,第4周又升高,但照射3个组之间比较差异无显著意义(F=0.97, P>0.05)。
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(2)不同剂量组血清TGF-β1水平比较：10Gy组血清TGF-β1最高达10.33μg/L,最低达1.34μg/L,平均为5.13±2.62μg/L; 20Gy组血清TGF-β1最高达11.25μg/L,最低达2.05μg/L,平均为4.48±2.59 μg/L;30Gy组血清TGF-β1最高达16.23μg/L,最低达1.30μg/L,平均为5.65±3.84μg/L。与照射前比较,3个组均明显升高,差异有显著意义(F=2.79,P<0.05);3个组之间比较,差异无显著意义(F=0.90,P>0.05)。
2.3 组织标本结果
(1)HE染色：各剂量组照射后4周均见照射区域充血水肿,炎性细胞浸润及成纤维细胞增生,炎性细胞浸润的部位主要在肺周边的肺泡腔内和细支气管、小血管周围及终末支气管、微血管腔内;细支气管和终末支气管内粘膜坏死脱落,巨噬细胞、中性粒细胞浸润;小血管内瘀血,小动脉平滑肌变性、空泡样改变。炎症改变以8周后明显,特别是20Gy组,肺组织内观察到大量巨噬细胞、中性粒细胞浸润和泡沫细胞(图1)。各剂量组照射后12周均有部分肺组织结构紊乱,肺泡腔变小,纤维化改变。
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图1 20Gy组8周，肺组织中大量炎性细胞浸润(HE染色×66)
(2)免疫组化染色：空白对照组肺组织未见TGF-β1阳性染色,各照射组照射后4周即观察到TGF-β1阳性染色,12周后染色加深,20Gy组和30Gy组更加明显,18周时仍可观察到较明显的TGF-β1阳性染色颗粒。染色颗粒主要出现在：①肺泡间隔中和肺泡壁上；②小血管、细支气管、终末支气管周围和内膜上；③巨噬细胞和泡沫细胞内，与HE染色炎性细胞出现的部位相同(图2)。
图 230Gy组8周，TGF-β1阳性染色(免疫组化×132)
(3)VB染色：与对照组相比,各照射组均观察到照射区域内胶原纤维明显增加,染色异常。染色异常的部位与HE染色、免疫组化观察相符,主要在肺泡间隔中和肺泡壁上及小血管、细支气管、终末支气管周围,并向邻近肺泡内长入。胶原纤维增加的程度与剂量相关,高剂量组比低剂量组明显。同时,照射后8周在20Gy组还观察到小动脉周围弹力纤维染色异常(图3，4)。33
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图320Gy组8周，小动脉周围胶原纤维异常染色(VB染色×33)
图4Gy组8周，细支气管周围胶原纤维异常染色(VB染色×33)
3 讨论
肺组织放射性损伤是肿瘤放射治疗中的严重并发症，由放射性肺炎和放射性纤维化两部分组成。肺纤维化可以伴随放射性肺炎发生，也可能单独发生，特别是放射治疗合并化疗时其发生的可能性更大。Emami等[1]认为照射体积与剂量是产生放射性肺损伤的最主要因素，但未能解释为什么有些人发生放射性肺炎或肺纤维化而有些人不发生，因此在很大程度上限制了许多肿瘤的放射治疗。近年来，许多学者从生物学角度研究了产生放射性肺损伤的机制。Adamson等[2]认为肺内存在着表皮—成纤维细胞调控系统,调节成纤维细胞的代谢，使其参与组织修复而又不过度增长导致肺的纤维化。放射治疗时，放射损伤的靶细胞肺泡Ⅱ型细胞受到损伤，分泌功能丧失，使成纤维细胞异常增生，产生肺纤维化。Rubin等[3]提出肺组织对放射性损伤的反应是一个多种细胞相互作用的复杂过程，有些细胞受到放射损伤后对成纤维细胞有直接刺激作用，也有巨噬细胞分泌TGF-β1蛋白对成纤维细胞的间接作用，而后者在肺纤维化中起着非常重要的作用。动物实验和临床研究表明在正常组织放射损伤中，生物学因素—TGF-β1可能起了关键性的作用[4-6]。
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本研究采用检测血清TGF-β1的变化与组织中TGF-β1蛋白表达相比较,方法较文献报道的更接近临床应用。照射后血清TGF-β1表达均高于照射前,差异有显著意义,提示肺组织放射损伤后分泌TGF-β1进入血液循环，血清中TGF-β1升高可间接反映肺组织损伤的可能性。照射后2周血清TGF-β1较第1周降低,4周后再度升高,可能与肺组织中放射敏感靶细胞如巨噬细胞受照射后损伤的修复过程有关。不同剂量组中血清TGF-β1表达以30Gy组最高,与文献报道相符[7]。各剂量组之间比较，差异无显著意义，说明血清TGF-β1的变化与照射剂量及个体差异之间的关系尚有待于进一步研究。肺组织的急性放射损伤以20Gy组最为明显。在各剂量组、各时间段均可观察到胶原纤维在肺组织的异常增生,高剂量组和观察期长者更加明显，提示TGF-β1的表达与正常肺组织的放射损伤，特别是晚期损伤肺纤维化密切相关。上述结果与本研究的早期结果(见文献[8])和国外文献报道一致[3，9，10]。它进一步说明肺的放射性损伤是一个非常复杂的过程,不能仅仅用照射剂量和体积等因素来解释,还需要从生物学角度来探讨其内在原因。本研究希望能通过在区别个体差异的基础上为放射治疗计划个体化和并发症预防提供新的思路。
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参考文献
1 Emami B,Lyman J,Brown A,et al.Tolerance of normal tissues to therapeutic irradiation.Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1991，21(1):109-122.
2 Adamson YR,Hedgecock C,Bowden DH.Epithelial cell-fibroblast interactions in lung injury and repair. AM J Pathol,1990， 137(2):385-392.
3 Rubin P,Finkelstein J,Shapiro D.Molecular biology mechanisms in the radiation induction of pulmonary injury syndromes: interrelationship between the alveolar macrophage and the septal fibroblast.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1992，24(1):93-101.
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4 Anscher MS,Crocker IR,Jirtle RL.Transforming growth factor-β1 expression in irradiation liver.Radiat Res,1990，122(1): 77-85.
5 Anscher MS,Murase T,Prescott DM,et al.Changes in plasma TGF-β1 levels during pulmonary radiotherapy as a predictor of the risk of developing radiation pneumonitis.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1994，30(3):671-676.
6 Anscher MS,Kong FM,Marks LB,et al. Changes in plasma Trans- forming growth factor beta during pulmonary radiotherapy and the risk of symptomatic radiation-induced pneumonitis.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1997，37(2):253-258.
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7 姚伟强.放射肿瘤学中的分子学进展.中华放射肿瘤学杂志,1998，7(1):59-60.
8 孙苏平，金冶宁，魏怡，等.转化生长因子β1的表达与肺放射性损伤关系初步研究.上海医学，1998，21(10):564-566.
9 Yi ES,Bedoya A,Lee H, et al.Radiation-induced lung injury in vivo:expressionof Transforming growth factor beta precedes fibrosis.Inflammation,1996，20(4):339-352.
10 Bai YH, Wang DW,Cui XM,et al. Expression of transforming growth factor beta in radiation interstitial pneumonitis.J Environ Pathol Toxicol Oncol,1997，16(1):15-20.
收稿：1998-11-08
修回：1999-05-25, 百拇医药
单位：200433 上海，中国人民解放军第二军医大学长海医院放射治疗科
关键词：转化生长因子β1；放射损伤；肺
中华放射肿瘤学杂志990309 【摘要】 目的 研究转化生长因子β1(TGF-β1) 在正常肺组织放射损伤中的作用。方法 采用免疫酶联法(ELISAs)、免疫组化、苏木素-伊红(HE)染色和维多利亚蓝(VB)染色等方法观察血清和组织中TGF-β1的表达与放射损伤的关系。结果 照射后血清中TGF-β1平均水平高于照射前，差异有显著意义(P<0.05);不同剂量组血清TGF-β1平均水平亦高于照射前，差异有显著意义(P<0.05)。HE染色各组照射区域均有急性炎症改变,20Gy组最明显；免疫组化TGF-β1蛋白的表达和VB染色胶原纤维和弹力纤维的改变高剂量组和观察期长者明显。结论 TGF-β1在正常肺组织放射性损伤中有非常重要的作用。
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Relation between transforming growth factor-β1 expression
and radiation injury of lung
SUN Suping,JIN Yening,WEI Yi,et al. Department of Radiation Oncology, Changhai Hospital,Secondary Medical University,PLA,Shanghai 200433
【Abstract】 Objective To investigate the effect of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) in radiation-induced injury of lung. Methods ELISAs,immuno-histochemical, HE ,anti-TGF-β1 and VB stains were used to observe the relation between TGF-β1 expression and radiation-induced injury of lung. Results The average serum TGF-β1 level after radiation was higher than before radiation(P<0.05). The average serum TGF-β1 level in different dose groups was also higher than before radiation (P<0.05). Acute inflammatory changes were more often seen in the HE group with the highest at 20Gy.Immuno-histochemical TGF-β1 expression and changes in VB collagenous and elastic fibers were predominantly observed in the high dose groups and long survivors. Conclusions Transforming growth factor-β1(TGF-β1),a biologic factor,plays a very important role in radiation induced injury of the normal lung.
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【Key words】 Transforming growth factor-β1;Radiation injury;Lung
转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)具有多种生物学功能,包括对正常组织的调节，对免疫系统的抑制及对肿瘤细胞生长的促进或抑制作用。本研究通过动物实验探讨TGF-β1在血清及组织中的表达与正常兔肺组织放射损伤的关系,从生物学角度研究放射损伤的原因,以期指导放射治疗方案的制定及并发症的预防。
1 材料与方法
1.1 动物：纯种新西兰白兔33只,体重3kg左右,由第二军医大学动物实验中心提供,标准颗粒饲料喂养。
1.2 分组：将33只实验兔随机分为4个组,前3个组为照射组,每组9只,分别单次照射10，20，30Gy;第4组6只为空白对照组。
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1.3 照射：用体积分数为0.3的氨基甲酸乙醇按750～1000mg/kg体重做腹腔麻醉。将麻醉好的实验兔前肢展开固定于塑料泡沫板的凹槽中,选取1只行胸部CT平扫,层厚为8mm,在治疗计划系统(TPS)下做计划,使照射区域在90%剂量曲线内。模拟机下定位,照射野3cm×3cm,中心位于气管分叉上1cm,包括上肺、气管、食管、脊髓和部分心脏及大血管。采用加速器10MV-X线,水平等中心照射,剂量比1∶1。
1.4 观察与处死：照射后观察肺、食管、脊髓损伤的临床表现。照射后4周和12周各剂量组分别随机抽取1只实验兔行胸部CT扫描,观察胸部照射区表现。照射组于4周开始每隔4周每组各处死2只实验兔,最后3只在18周时处死,观察大体标本肉眼改变及取材制片。对照组不做处理,同等条件饲养,18周处死, 取材制片。
1.5 血清标本的采集与测定
(1)采集：照射组每组6只共18只实验兔在照射前、后1周分别采血2mL,全部实验兔共27只均在照射后2，4周分别于耳廓前或后静脉穿刺抽血2mL,室温下静置3～4小时,2000～2500r/min离心20分钟,取血清0.5mL置于1.5mL聚丙二醇脂试管内,-20℃冰箱内保存待测。
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(2)测定：免疫酶联法检测(ELISAs)。TGF-β1小鼠单抗试剂盒为Genzyme公司产品,保存温度为2～8℃,测定前试剂盒内所有试剂均需达到室温(18～20℃),操作按说明书进行。
1.6 取材固定与制片
(1)取材固定：将实验兔固定于取材板上,股动脉放血，胸正中切口,分离皮肤至肋侧,沿胸骨两侧剪断肋骨,切除胸骨，暴露胸腔,将心脏、肺、气管、食管整体取出,截取胸段脊髓,切取心脏、肺、气管、食管、脊髓照射区域组织块,固定于10%福尔马林中48小时。
(2)制片：石蜡包埋连续切片,片厚5μm，苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察其形态学改变;免疫组织化学检测:抗TGF-β1小鼠单抗和羊抗鼠二抗为DAKO公司产品，操作按说明书加以改进,观察TGF-β1的表达,棕黄色颗粒为阳性结果;维多利亚蓝(VB)染色,光镜下观察胶原纤维和弹力纤维的改变, 胶原纤维呈红色, 弹力纤维呈蓝绿色。
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1.7 统计学方法：照射前、后血清TGF-β1平均水平用±s表示，两样本均数用t检验,多个样本均数比较用F检验和SNK方法,统计处理采用SAS软件包。
2 结果
2.1 大体观察
(1)体重：照射前3个组平均体重3.0kg,照射后均有不同程度消瘦、体重下降,最少者减少0.4kg,最多者减少1.2kg,平均0.5kg。
(2)放射损伤临床表现：食管损伤症状主要表现为进食减少、明显消瘦;肺损伤症状主要表现为呼吸急促、活动受限;脊髓损伤症状主要表现为步态不稳、双后肢肌力减退,出现时间从1周到6周不等。放射损伤的程度与照射剂量成正比,即照射量大者症状出现早,损伤表现明显。30Gy组照射1周后即进食减少、消瘦,2周后陆续出现脊髓损伤表现;10Gy组则在6周后才出现各种损伤症状。照射后4周胸部CT扫描20Gy组2个肺尖和左上肺呈炎症改变,其它2个组未见明显异常表现,而12周时胸部CT各组均见不同程度炎症表现。
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(3)开胸所见：照射后4周处死10Gy组肉眼观察无明显改变,8周处死20Gy组5只实验兔可见1.5～4.0mL淡黄色心包积液,3只可见1～2mL淡黄色清亮胸腔积液;30Gy组3只实验兔可见2.0～4.5mL淡黄色心包积液;部分实验兔特别是12周处死者可见有纵膈纤维结缔组织粘连。
2.2 血清标本测定结果
(1)照射前、后及不同时间的血清TGF-β1水平比较：照射前血清TGF-β1最高达9.88 μg/L,最低达1.58 μg/L,平均为3.12±2.35 μg/L；照射后血清TGF-β1最高达16.23 μg/L,最低达1.30μg/L,平均为4.79±3.10μg/L，二者比较差异有极显著意义(t=4.51,P<0.01)。照射后1，2，4周的血清TGF-β1平均水平分别为5.47±2.01μg/L，4.27±2.87μg/L，5.66±3.73μg/L,均高于照射前，照射前、后组间差异有显著意义(F=3.33,P<0.05)。照射后第2周比第1周降低,第4周又升高,但照射3个组之间比较差异无显著意义(F=0.97, P>0.05)。
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(2)不同剂量组血清TGF-β1水平比较：10Gy组血清TGF-β1最高达10.33μg/L,最低达1.34μg/L,平均为5.13±2.62μg/L; 20Gy组血清TGF-β1最高达11.25μg/L,最低达2.05μg/L,平均为4.48±2.59 μg/L;30Gy组血清TGF-β1最高达16.23μg/L,最低达1.30μg/L,平均为5.65±3.84μg/L。与照射前比较,3个组均明显升高,差异有显著意义(F=2.79,P<0.05);3个组之间比较,差异无显著意义(F=0.90,P>0.05)。
2.3 组织标本结果
(1)HE染色：各剂量组照射后4周均见照射区域充血水肿,炎性细胞浸润及成纤维细胞增生,炎性细胞浸润的部位主要在肺周边的肺泡腔内和细支气管、小血管周围及终末支气管、微血管腔内;细支气管和终末支气管内粘膜坏死脱落,巨噬细胞、中性粒细胞浸润;小血管内瘀血,小动脉平滑肌变性、空泡样改变。炎症改变以8周后明显,特别是20Gy组,肺组织内观察到大量巨噬细胞、中性粒细胞浸润和泡沫细胞(图1)。各剂量组照射后12周均有部分肺组织结构紊乱,肺泡腔变小,纤维化改变。
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图1 20Gy组8周，肺组织中大量炎性细胞浸润(HE染色×66)
(2)免疫组化染色：空白对照组肺组织未见TGF-β1阳性染色,各照射组照射后4周即观察到TGF-β1阳性染色,12周后染色加深,20Gy组和30Gy组更加明显,18周时仍可观察到较明显的TGF-β1阳性染色颗粒。染色颗粒主要出现在：①肺泡间隔中和肺泡壁上；②小血管、细支气管、终末支气管周围和内膜上；③巨噬细胞和泡沫细胞内，与HE染色炎性细胞出现的部位相同(图2)。
图 230Gy组8周，TGF-β1阳性染色(免疫组化×132)
(3)VB染色：与对照组相比,各照射组均观察到照射区域内胶原纤维明显增加,染色异常。染色异常的部位与HE染色、免疫组化观察相符,主要在肺泡间隔中和肺泡壁上及小血管、细支气管、终末支气管周围,并向邻近肺泡内长入。胶原纤维增加的程度与剂量相关,高剂量组比低剂量组明显。同时,照射后8周在20Gy组还观察到小动脉周围弹力纤维染色异常(图3，4)。33
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图320Gy组8周，小动脉周围胶原纤维异常染色(VB染色×33)
图4Gy组8周，细支气管周围胶原纤维异常染色(VB染色×33)
3 讨论
肺组织放射性损伤是肿瘤放射治疗中的严重并发症，由放射性肺炎和放射性纤维化两部分组成。肺纤维化可以伴随放射性肺炎发生，也可能单独发生，特别是放射治疗合并化疗时其发生的可能性更大。Emami等[1]认为照射体积与剂量是产生放射性肺损伤的最主要因素，但未能解释为什么有些人发生放射性肺炎或肺纤维化而有些人不发生，因此在很大程度上限制了许多肿瘤的放射治疗。近年来，许多学者从生物学角度研究了产生放射性肺损伤的机制。Adamson等[2]认为肺内存在着表皮—成纤维细胞调控系统,调节成纤维细胞的代谢，使其参与组织修复而又不过度增长导致肺的纤维化。放射治疗时，放射损伤的靶细胞肺泡Ⅱ型细胞受到损伤，分泌功能丧失，使成纤维细胞异常增生，产生肺纤维化。Rubin等[3]提出肺组织对放射性损伤的反应是一个多种细胞相互作用的复杂过程，有些细胞受到放射损伤后对成纤维细胞有直接刺激作用，也有巨噬细胞分泌TGF-β1蛋白对成纤维细胞的间接作用，而后者在肺纤维化中起着非常重要的作用。动物实验和临床研究表明在正常组织放射损伤中，生物学因素—TGF-β1可能起了关键性的作用[4-6]。
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本研究采用检测血清TGF-β1的变化与组织中TGF-β1蛋白表达相比较,方法较文献报道的更接近临床应用。照射后血清TGF-β1表达均高于照射前,差异有显著意义,提示肺组织放射损伤后分泌TGF-β1进入血液循环，血清中TGF-β1升高可间接反映肺组织损伤的可能性。照射后2周血清TGF-β1较第1周降低,4周后再度升高,可能与肺组织中放射敏感靶细胞如巨噬细胞受照射后损伤的修复过程有关。不同剂量组中血清TGF-β1表达以30Gy组最高,与文献报道相符[7]。各剂量组之间比较，差异无显著意义，说明血清TGF-β1的变化与照射剂量及个体差异之间的关系尚有待于进一步研究。肺组织的急性放射损伤以20Gy组最为明显。在各剂量组、各时间段均可观察到胶原纤维在肺组织的异常增生,高剂量组和观察期长者更加明显，提示TGF-β1的表达与正常肺组织的放射损伤，特别是晚期损伤肺纤维化密切相关。上述结果与本研究的早期结果(见文献[8])和国外文献报道一致[3，9，10]。它进一步说明肺的放射性损伤是一个非常复杂的过程,不能仅仅用照射剂量和体积等因素来解释,还需要从生物学角度来探讨其内在原因。本研究希望能通过在区别个体差异的基础上为放射治疗计划个体化和并发症预防提供新的思路。
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参考文献
1 Emami B,Lyman J,Brown A,et al.Tolerance of normal tissues to therapeutic irradiation.Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1991，21(1):109-122.
2 Adamson YR,Hedgecock C,Bowden DH.Epithelial cell-fibroblast interactions in lung injury and repair. AM J Pathol,1990， 137(2):385-392.
3 Rubin P,Finkelstein J,Shapiro D.Molecular biology mechanisms in the radiation induction of pulmonary injury syndromes: interrelationship between the alveolar macrophage and the septal fibroblast.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1992，24(1):93-101.
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4 Anscher MS,Crocker IR,Jirtle RL.Transforming growth factor-β1 expression in irradiation liver.Radiat Res,1990，122(1): 77-85.
5 Anscher MS,Murase T,Prescott DM,et al.Changes in plasma TGF-β1 levels during pulmonary radiotherapy as a predictor of the risk of developing radiation pneumonitis.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1994，30(3):671-676.
6 Anscher MS,Kong FM,Marks LB,et al. Changes in plasma Trans- forming growth factor beta during pulmonary radiotherapy and the risk of symptomatic radiation-induced pneumonitis.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1997，37(2):253-258.
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7 姚伟强.放射肿瘤学中的分子学进展.中华放射肿瘤学杂志,1998，7(1):59-60.
8 孙苏平，金冶宁，魏怡，等.转化生长因子β1的表达与肺放射性损伤关系初步研究.上海医学，1998，21(10):564-566.
9 Yi ES,Bedoya A,Lee H, et al.Radiation-induced lung injury in vivo:expressionof Transforming growth factor beta precedes fibrosis.Inflammation,1996，20(4):339-352.
10 Bai YH, Wang DW,Cui XM,et al. Expression of transforming growth factor beta in radiation interstitial pneumonitis.J Environ Pathol Toxicol Oncol,1997，16(1):15-20.
收稿：1998-11-08
修回：1999-05-25, 百拇医药