前列腺癌基因治疗进展
作者：林涛 李虹
单位：华西医科大学附属第一医院泌尿外科(成都 610041)
关键词：
华西医学990391 [中图分类号]R737.25；R459.9 [文献标识码]D
目前，只有局限于包膜内的早期前列腺癌能得到根治。对转移性前列腺癌，虽然内分泌等治疗可使70%～80%的患者症状缓解，但病人往往几个月或几年内死于肿瘤的扩散〔1〕。基因治疗是治疗前列腺癌的希望。有效的基因治疗需要两个条件：一是要有适当的基因导入系统，以保障转染的安全、高效和导入基因的特异性表达，二是要有高效抗肿瘤的基因。基因导入方法有物理化学方法(包括磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、微粒轰击、电穿孔法及显微注射等)和病毒载体介导的基因导入方法，近几年用于前列腺癌基因治疗的几乎都是后者，它的转染率明显高于非病毒系统〔2〕。
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1 载体的选择及前列腺特异性表达载体的构建
已用于前列腺癌基因治疗的病毒载体有逆转录病毒载体、痘苗载毒(vaccinia virus)载体、金丝雀痘病毒(ALVAC)载体和腺病毒载体(ADVs)等，重组有前列腺特异性抗原启动子(PSA—P)和前列腺特异性增强子(PSE)的病毒载体可使导入基因在前列腺癌组织中特异性的高效表达。
逆转录病毒载体在前列腺癌的基因治疗尤其是体内基因治疗中效果不佳，主要原因如下〔3，4〕：①逆转录病毒不能转染非分裂期细胞；②整合入宿主基因组有可能激活癌基因；③逆转录病毒与多种肿瘤有关。痘苗病毒感染宿主范围广泛，感染速度快，外源基因表达良好〔5〕。携带编码IL-1，IL-2，IL-12以及共刺激分子B7—1，B—2基因的重组痘苗病毒的抗肿瘤作用已得到证实。但在以往的人类水痘疫苗接种中，进展性水痘，湿疹及脑炎等严重并发症时有发生。金丝雀痘病毒(ALVAC)能感染哺乳动物并能使插入基因良好表达，且仅能在鸟类细胞中完全复制，它已在包括前列腺癌等多种疾病的动物实验基因治疗中应用〔6，7〕，未见显著的局部或全身反应，腺病毒载体(ADVs)似乎较为理想，它能转染分裂和非分裂细胞且转染率高，人们已将它成功应用于人类多种疾病的基因治疗，证实其安全性较有保障。但腺病毒不能整合到宿主细胞染色体，其携带的外源基因表达时间约为14～35天〔8〕。目前，腺病毒载体仍是前列腺癌的基因治疗中应用最广泛的载体。
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上述载体在体外实验和动物模型都取得了较好效果，但要使基因治疗用于临床，尚需在增加表达特异性及表达效率等方面对载体进行改进，构建一个高效的前列腺组织特异性的载体成为前列腺癌基因治疗中最关键的问题。给插入p53基因的重组腺病毒载体加上巨细胞病毒启动子〔4〕，虽可使p53表达增加，但仍未解决特异性问题。前列腺特异性抗原(PSA)因其在前列腺细胞中的特异性表达而成为构建特异性表达载体的极佳选择。Pang等〔9〕从一个进展期前列腺癌病人克隆出PSA启动子，并与虫荧光素酶报告基因(reporter gene)一起用于体外转基因实验，发现仅在前列腺癌LNCaP细胞系有表达，证实了其特异性。他们还将PSA-P和CMV启动子分别插入Lux基因上游并与腺病毒重组，从静脉和肿瘤内两个途径注入种植了人前列腺癌的裸鼠，结果显示PCPSA-Lux Adv仅有种植的种瘤组织中表达，而CMV-Lux Adv在肝脏、脾脏及肿瘤内均有高表达，表明PCPSA特异性在体内不受影响。单纯以PSA-P作启动子的转基因实验中PSA表达相当低，这与前列腺细胞PSA的高表达相矛盾，表明这种启动子不完整或需要加上调控序列。Pang等〔10〕又从PSA-P上游克隆出822bp的前列腺特异性增强子(PSE)，它可使PSA-P转录活性增加1000倍而不影响其特异性。进一步的研究表明PSE只在LNCaP细胞系有活性，提示其只作用于PSA阳性细胞。但超过95%的前列腺癌均为PSA阳性〔11〕，故基于PSE及PSA-P的载体在前列腺癌的基因治疗中前景光明。
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2 导入基因
2.1 自杀基因
目前用于前列腺癌基因治疗的自杀基因主要是单纯疱疹病毒胸腺核苷激酶(HSV-TK)基因，它能与无毒性的羟基无环鸟苷(GCV)生成磷酸化复合物，终止DNA和RNA链的合成，从而杀伤分裂期肿瘤细胞，此外还可因旁观者效应(by stander effect)引起周围没有导入该基因的肿瘤细胞死亡。Eastham等〔12〕将此疗法用于非转移性的小鼠前列腺癌模型，发现肿瘤细胞被大量杀伤，两周后肿瘤体积为对照的16%，小鼠存活时间延长。Simon等〔13〕向大鼠前列腺直接注射RM-1前列腺癌细胞，接种一周后原位注入带有HSV-tk基因的重组腺病毒并以GCV治疗，发现远处转移率为12.5%(2/16)，而对照组为71.4%(10/14)，(p=0.0032)，证实该疗法还有抗转移作用。但HSV-tk+GCV只能杀伤分裂期肿瘤细胞，对静止期肿瘤细胞无效。于是，另一种自杀基因—白喉毒素亚单位A(DTA)基因受到重视，它能与延长因子结合抑制蛋白质的生物合成，且能杀伤分裂期和静止期肿瘤细胞。其主要限制在于细胞毒性大，如何正确应用尚需进一步研究。
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2.2 细胞因子基因
细胞因子的作用机制还不完全清楚，可能是提高机体的抗肿瘤免疫反应(即细胞因子基因的肿瘤疫苗作用)，亦可能是其本身对肿瘤细胞的杀伤作用，或二者皆有。Vieweg等〔14〕将IL-2，IFN-γ，GM-CSF基因导入R3327MAT-LYLU细胞，用射线照射后接种到CopMeEla荷瘤小鼠，发现IL-2，GM-CSF均有明显抗肿瘤作用，而单独作用IFN-γ，IL-4和IL-6效果较差。Kawakita M等〔6〕向小鼠RM-1前列腺癌细胞导入IL-2，IFN-γ，TNF-α及B7-1基因，确认其稳定表达后皮下注射到与RM-1同系的C57BL/6小鼠模型，结果显示单独表达IL-2，IFN-γ或B7-1均不能影响肿瘤的生长，单独表达TNF-α者肿瘤生长被明显抑制，而同时表达TNF-α和IL-2者效果最佳，肿瘤生长被抑制60%～100%。为了解TNF-α和IL-2联合作用的机制，Kawakita M等又向小鼠一侧背部皮下接种转染了TNF-α和IL-2基因并用射线照射的RM-1细胞，10天后在另一侧背部皮下注射RM-1细胞，发现多数小鼠肿瘤生长完全抑制，但特异性的免疫反应并未出现，表明这是一种非特异性的宿主介导的机制。
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2.3 矫正基因
肿瘤的发生与抑癌基因的缺失和突变有关，向靶细胞导入抑癌基因是基因治疗的重要策略。
①p53 作为“分子警察”的p53主要作用在于DNA损伤时激活G1期DNA的修复，若修复失败则诱导细胞发生凋亡。p53的突变与转移性前列腺癌尤其是激素拮抗的前列腺癌密切相关，p53蛋白已成为前列腺癌根治术后评价预后的独立指标〔15〕。现已知道，一种受p53调节的bax基因为凋亡所必需，且凋亡是否发生据推测是由bax与bcl-2的比例决定〔16〕。因此，导入高效表达的野生型p53基因不仅能矫正p53的缺陷，还可能加大bax与bcl-2的比例以促进凋亡发生。Asgari K等〔17〕将DU145细胞接种至裸鼠皮下，21天后注射重组的野生型p53腺病毒(AdWTp53)一次，发现与对照相比肿瘤生长被抑制70%～80%，更有意义的是，单次注射与多次注射结果并无区别。
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②Rb 视网膜母细胞瘤(Rb)基因的表达水平与前列腺癌的侵袭性密切相关。超过半数的前列腺癌患者有Rb的失活〔18〕。Rb是高效的抑癌基因，其在体外实验和动物模型中均能有效抑制癌细胞生长，甚至那些没有Rb突变的肿瘤细胞也能被外源性Rb基因所抑制。进一步的研究还证实，去掉氨基末端112个氨基酸的Rb蛋白抑癌效果显著增加。
3 结束语
可供选择的载体和基因虽然众多，临床效果并不很好，重要原因之一就是理想的导入基因仍未确定，基于PSE及PSA-A的载体虽在动物实验中取得满意结果，但临床疗效尚需进一步证实。由于 肿瘤常有不止一个基因异常，且各个基因的表达往往互相关联，联合基因治疗已成为基因治疗的新战略，就前列腺癌而言，细胞因子之间联合已取得较好效果，其他方式正在研究中。总的看来，虽然前列腺癌的基因治疗研究已在特异性载体、导入基因及动物实验等方面取得了较大进展，但要成为临床理想的治疗方式，尚需在分子生物学技术及前列腺癌生物学行为等方面进行大量的研究。
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4 参考文献
1 Steam Me et al.Lab lnvest，1992；67∶540-52.
2 Wilson J et al.N Engl J Med，1996；334∶1185-87.
3 Kleinerman Dl et al.Cancer Res，1995；55∶2831-36.
4 Srivastavs S et al.Urology，1995；46∶843-48.
5 Moss B et al.Science，1991；252∶1662-7.
6 Kawakita M et al.J Natl cancer lnst，1997；89(6)∶428-436.
, 百拇医药
7 Ratliff TL et al.Acta Urol Belg，1996；64(2)∶85.
8 Sikora K et al.Br J Urol，1997；79 Srppl 2∶64-68.
9 Pang S et al.Hum Gene Ther，1995；6∶1417-26.
10 Pang S et al.Cancer Res，1997；57∶495-499.
11 Deguchi T et al.Cancer Res，1993；53∶5350-54.
12 Eastham JA et al.Hum Gene Ther，1996；7(4)∶515-523.
13 Hall SJ et al.lnt J Cancer，1997；70(2)∶183-7.
, 百拇医药
14 Vieweg J et al.Cancer Res，1994；54∶1760-5.
15 Yang G et al.Clin Cancer Res，1996；2∶399-401.
16 Reed JC et al.J Cell Biol，1994；124∶1-6.
17 Asgari K et al.lnt J Cancer，1997；71(3)∶377-382.
18 Philips SM et al.Br J Cancer，1994；70∶1252-7.
(收稿日期：1999-01-11), 百拇医药
单位：华西医科大学附属第一医院泌尿外科(成都 610041)
关键词：
华西医学990391 [中图分类号]R737.25；R459.9 [文献标识码]D
目前，只有局限于包膜内的早期前列腺癌能得到根治。对转移性前列腺癌，虽然内分泌等治疗可使70%～80%的患者症状缓解，但病人往往几个月或几年内死于肿瘤的扩散〔1〕。基因治疗是治疗前列腺癌的希望。有效的基因治疗需要两个条件：一是要有适当的基因导入系统，以保障转染的安全、高效和导入基因的特异性表达，二是要有高效抗肿瘤的基因。基因导入方法有物理化学方法(包括磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、微粒轰击、电穿孔法及显微注射等)和病毒载体介导的基因导入方法，近几年用于前列腺癌基因治疗的几乎都是后者，它的转染率明显高于非病毒系统〔2〕。
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1 载体的选择及前列腺特异性表达载体的构建
已用于前列腺癌基因治疗的病毒载体有逆转录病毒载体、痘苗载毒(vaccinia virus)载体、金丝雀痘病毒(ALVAC)载体和腺病毒载体(ADVs)等，重组有前列腺特异性抗原启动子(PSA—P)和前列腺特异性增强子(PSE)的病毒载体可使导入基因在前列腺癌组织中特异性的高效表达。
逆转录病毒载体在前列腺癌的基因治疗尤其是体内基因治疗中效果不佳，主要原因如下〔3，4〕：①逆转录病毒不能转染非分裂期细胞；②整合入宿主基因组有可能激活癌基因；③逆转录病毒与多种肿瘤有关。痘苗病毒感染宿主范围广泛，感染速度快，外源基因表达良好〔5〕。携带编码IL-1，IL-2，IL-12以及共刺激分子B7—1，B—2基因的重组痘苗病毒的抗肿瘤作用已得到证实。但在以往的人类水痘疫苗接种中，进展性水痘，湿疹及脑炎等严重并发症时有发生。金丝雀痘病毒(ALVAC)能感染哺乳动物并能使插入基因良好表达，且仅能在鸟类细胞中完全复制，它已在包括前列腺癌等多种疾病的动物实验基因治疗中应用〔6，7〕，未见显著的局部或全身反应，腺病毒载体(ADVs)似乎较为理想，它能转染分裂和非分裂细胞且转染率高，人们已将它成功应用于人类多种疾病的基因治疗，证实其安全性较有保障。但腺病毒不能整合到宿主细胞染色体，其携带的外源基因表达时间约为14～35天〔8〕。目前，腺病毒载体仍是前列腺癌的基因治疗中应用最广泛的载体。
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上述载体在体外实验和动物模型都取得了较好效果，但要使基因治疗用于临床，尚需在增加表达特异性及表达效率等方面对载体进行改进，构建一个高效的前列腺组织特异性的载体成为前列腺癌基因治疗中最关键的问题。给插入p53基因的重组腺病毒载体加上巨细胞病毒启动子〔4〕，虽可使p53表达增加，但仍未解决特异性问题。前列腺特异性抗原(PSA)因其在前列腺细胞中的特异性表达而成为构建特异性表达载体的极佳选择。Pang等〔9〕从一个进展期前列腺癌病人克隆出PSA启动子，并与虫荧光素酶报告基因(reporter gene)一起用于体外转基因实验，发现仅在前列腺癌LNCaP细胞系有表达，证实了其特异性。他们还将PSA-P和CMV启动子分别插入Lux基因上游并与腺病毒重组，从静脉和肿瘤内两个途径注入种植了人前列腺癌的裸鼠，结果显示PCPSA-Lux Adv仅有种植的种瘤组织中表达，而CMV-Lux Adv在肝脏、脾脏及肿瘤内均有高表达，表明PCPSA特异性在体内不受影响。单纯以PSA-P作启动子的转基因实验中PSA表达相当低，这与前列腺细胞PSA的高表达相矛盾，表明这种启动子不完整或需要加上调控序列。Pang等〔10〕又从PSA-P上游克隆出822bp的前列腺特异性增强子(PSE)，它可使PSA-P转录活性增加1000倍而不影响其特异性。进一步的研究表明PSE只在LNCaP细胞系有活性，提示其只作用于PSA阳性细胞。但超过95%的前列腺癌均为PSA阳性〔11〕，故基于PSE及PSA-P的载体在前列腺癌的基因治疗中前景光明。
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2 导入基因
2.1 自杀基因
目前用于前列腺癌基因治疗的自杀基因主要是单纯疱疹病毒胸腺核苷激酶(HSV-TK)基因，它能与无毒性的羟基无环鸟苷(GCV)生成磷酸化复合物，终止DNA和RNA链的合成，从而杀伤分裂期肿瘤细胞，此外还可因旁观者效应(by stander effect)引起周围没有导入该基因的肿瘤细胞死亡。Eastham等〔12〕将此疗法用于非转移性的小鼠前列腺癌模型，发现肿瘤细胞被大量杀伤，两周后肿瘤体积为对照的16%，小鼠存活时间延长。Simon等〔13〕向大鼠前列腺直接注射RM-1前列腺癌细胞，接种一周后原位注入带有HSV-tk基因的重组腺病毒并以GCV治疗，发现远处转移率为12.5%(2/16)，而对照组为71.4%(10/14)，(p=0.0032)，证实该疗法还有抗转移作用。但HSV-tk+GCV只能杀伤分裂期肿瘤细胞，对静止期肿瘤细胞无效。于是，另一种自杀基因—白喉毒素亚单位A(DTA)基因受到重视，它能与延长因子结合抑制蛋白质的生物合成，且能杀伤分裂期和静止期肿瘤细胞。其主要限制在于细胞毒性大，如何正确应用尚需进一步研究。
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2.2 细胞因子基因
细胞因子的作用机制还不完全清楚，可能是提高机体的抗肿瘤免疫反应(即细胞因子基因的肿瘤疫苗作用)，亦可能是其本身对肿瘤细胞的杀伤作用，或二者皆有。Vieweg等〔14〕将IL-2，IFN-γ，GM-CSF基因导入R3327MAT-LYLU细胞，用射线照射后接种到CopMeEla荷瘤小鼠，发现IL-2，GM-CSF均有明显抗肿瘤作用，而单独作用IFN-γ，IL-4和IL-6效果较差。Kawakita M等〔6〕向小鼠RM-1前列腺癌细胞导入IL-2，IFN-γ，TNF-α及B7-1基因，确认其稳定表达后皮下注射到与RM-1同系的C57BL/6小鼠模型，结果显示单独表达IL-2，IFN-γ或B7-1均不能影响肿瘤的生长，单独表达TNF-α者肿瘤生长被明显抑制，而同时表达TNF-α和IL-2者效果最佳，肿瘤生长被抑制60%～100%。为了解TNF-α和IL-2联合作用的机制，Kawakita M等又向小鼠一侧背部皮下接种转染了TNF-α和IL-2基因并用射线照射的RM-1细胞，10天后在另一侧背部皮下注射RM-1细胞，发现多数小鼠肿瘤生长完全抑制，但特异性的免疫反应并未出现，表明这是一种非特异性的宿主介导的机制。
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2.3 矫正基因
肿瘤的发生与抑癌基因的缺失和突变有关，向靶细胞导入抑癌基因是基因治疗的重要策略。
①p53 作为“分子警察”的p53主要作用在于DNA损伤时激活G1期DNA的修复，若修复失败则诱导细胞发生凋亡。p53的突变与转移性前列腺癌尤其是激素拮抗的前列腺癌密切相关，p53蛋白已成为前列腺癌根治术后评价预后的独立指标〔15〕。现已知道，一种受p53调节的bax基因为凋亡所必需，且凋亡是否发生据推测是由bax与bcl-2的比例决定〔16〕。因此，导入高效表达的野生型p53基因不仅能矫正p53的缺陷，还可能加大bax与bcl-2的比例以促进凋亡发生。Asgari K等〔17〕将DU145细胞接种至裸鼠皮下，21天后注射重组的野生型p53腺病毒(AdWTp53)一次，发现与对照相比肿瘤生长被抑制70%～80%，更有意义的是，单次注射与多次注射结果并无区别。
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②Rb 视网膜母细胞瘤(Rb)基因的表达水平与前列腺癌的侵袭性密切相关。超过半数的前列腺癌患者有Rb的失活〔18〕。Rb是高效的抑癌基因，其在体外实验和动物模型中均能有效抑制癌细胞生长，甚至那些没有Rb突变的肿瘤细胞也能被外源性Rb基因所抑制。进一步的研究还证实，去掉氨基末端112个氨基酸的Rb蛋白抑癌效果显著增加。
3 结束语
可供选择的载体和基因虽然众多，临床效果并不很好，重要原因之一就是理想的导入基因仍未确定，基于PSE及PSA-A的载体虽在动物实验中取得满意结果，但临床疗效尚需进一步证实。由于 肿瘤常有不止一个基因异常，且各个基因的表达往往互相关联，联合基因治疗已成为基因治疗的新战略，就前列腺癌而言，细胞因子之间联合已取得较好效果，其他方式正在研究中。总的看来，虽然前列腺癌的基因治疗研究已在特异性载体、导入基因及动物实验等方面取得了较大进展，但要成为临床理想的治疗方式，尚需在分子生物学技术及前列腺癌生物学行为等方面进行大量的研究。
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4 参考文献
1 Steam Me et al.Lab lnvest，1992；67∶540-52.
2 Wilson J et al.N Engl J Med，1996；334∶1185-87.
3 Kleinerman Dl et al.Cancer Res，1995；55∶2831-36.
4 Srivastavs S et al.Urology，1995；46∶843-48.
5 Moss B et al.Science，1991；252∶1662-7.
6 Kawakita M et al.J Natl cancer lnst，1997；89(6)∶428-436.
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7 Ratliff TL et al.Acta Urol Belg，1996；64(2)∶85.
8 Sikora K et al.Br J Urol，1997；79 Srppl 2∶64-68.
9 Pang S et al.Hum Gene Ther，1995；6∶1417-26.
10 Pang S et al.Cancer Res，1997；57∶495-499.
11 Deguchi T et al.Cancer Res，1993；53∶5350-54.
12 Eastham JA et al.Hum Gene Ther，1996；7(4)∶515-523.
13 Hall SJ et al.lnt J Cancer，1997；70(2)∶183-7.
, 百拇医药
14 Vieweg J et al.Cancer Res，1994；54∶1760-5.
15 Yang G et al.Clin Cancer Res，1996；2∶399-401.
16 Reed JC et al.J Cell Biol，1994；124∶1-6.
17 Asgari K et al.lnt J Cancer，1997；71(3)∶377-382.
18 Philips SM et al.Br J Cancer，1994；70∶1252-7.
(收稿日期：1999-01-11), 百拇医药