自身稳定性反义寡核苷酸抗核酸酶降解作用的研究
作者：黄爱琼 姚志强 周永兴
单位：黄爱琼 350002 福州，解放军第476医院；姚志强、周永兴 第四军医大学唐都医院
关键词：
中华传染病杂志990314
反义寡核苷酸(asON)抗肿瘤，抗病毒基因调控、复制与表达的研究国内外已有报道[1-3]。研究表明asON能有效地抑制培养细胞中乙型肝炎病毒基因表达[4-5]，是值得研究的新型抗病毒药，但其应用于体内的主要障碍之一是易被血清中各种核酸酶降解。我们在设计抗丙型肝炎病毒asON时，在其3′端增加10个自身互补碱基，实验前加热复性可形成发夹茎环结构，以抵抗3′端核酸酶外切降解，增加自身稳定性。
材料与方法
, http://www.100md.com
一、试剂
DNA多聚酶Ⅰ(polⅠ, Klenow片段)购自美国Promega公司，丙烯酰胺，N，N′-亚甲双丙烯酰胺、过硫酸胺、溴化乙锭均购自华美生物工程公司，TEMED购自美国Serva公司。
二、仪器
391聚合酶链反应mateDNA合成仪、电热恒温水浴箱、TGL-16G高速台式离心机、岛津UV-265分光光度仪、LKB电泳仪、Bio-Rad电泳槽。
三、方法
(一) asON的设计与合成 在美国ABI公司生产的DNA合成仪上合成互补于HCV-C基因起始区(含ATG起始码)的18聚线性硫代磷酸asON(linear asON, L-asON);自身稳定性asON(self-stabilized asON,SS-asON)的设计是在L-asONA的3′端增加10个自身互补碱基，实验前将其在97℃恒温中加热10分钟后自然冷却至室温，形成3′端发夹茎结构。两段asON序列见表1。
, http://www.100md.com
表1 asON碱基序列 名 称
碱 基 序 列
L-asON
5′
TTT
AGG
ATT
CGT
GCT
CAT
3′
SS-asON
5′
, http://www.100md.com
TTT
AGG
ATT
CGT
GCT
CAT
GAT
GC
3′
CTA
CA
(二) polⅠ对asON的降解率测定 将10μl(100u) polⅠ加入3ml缓冲液(50mmol/L Tris, pH 7.2,10mmol MgSO4，0.1mmol/L DTT,0.5mg/ml BSA),混匀，测定其A260值，分别加入10μl(100μg)L-asON或SS-asON，混匀，测0时刻A260值，37℃温育，每间隔30分钟，取出混匀，测定A260值。
, http://www.100md.com
(三) polⅠ外切降解asON 将L-asON或SS-asON(1000pmol)加入20μl缓冲液，再加入polⅠ 0.5μl(5u),混匀，37℃温育，分别于0、30、60、120、240分钟取出，20% PAGE电泳，用溴化乙锭染色。
结果
一、polⅠ对asON降解率
L-asON可被polⅠ降解，见表2。L-asON降解t1/2约为120分钟，SS-asON不被降解，A260值恒定。
表2 polⅠ对asON降解率测定
时 间(分)
0
30
, 百拇医药
60
90
120
150
180
210
240
SS-asON A260值
1.203
1.020
1.190
1.098
1.104
, http://www.100md.com
1.070
1.906
1.087
1.133
L-asON A260值
1.210
1.031
0.970
0.832
0.713
0.564
0.463
, http://www.100md.com
0.378
0.190
二、polⅠ对asON降解外切
polⅠ降解外切L-asON的3′端，20% PAGE电泳可见不同长度片段的降解电泳带，240分钟时L-asON被完全降解，SS-asON不被降解，为单一片段电泳带。
讨论
asON抗病毒研究中的一个重要问题是其稳定性，asON作为药物用于体内主要被3′端核酸外切酶从3′端外切降解。硫代磷酸化修饰的asON比未修饰的反义寡核苷酸酶抵抗性增强，但最终还是被降解[6-9]。为增强核酸酶抗性，3′端修饰包括：3′端环化、3′端掺入抗核酸酶的核苷酸连结键及3′端甲基化等。
本研究设计18聚线性硫代磷酸寡核苷酸，为增强其核酸酶抗性，在3′端增加10个自身互补碱基，加热后复性。形成3′端发夹茎环结构抵抗3′端核酸外切酶的外切作用，增加自身稳定性。有人证明未修饰或硫代磷酸化修饰的asON主要是被血清中3′端外切酶从3′端逐渐外切降解。为证实3′端外切作用，对比研究polⅠ对L-asON或SS-asON 3′端外切作用，L-asON被逐渐外切降解，而SS-asON不降解。说明polⅠ对L-asON有3′端外切作用，而SS-asON 3′端形成发夹茎环结构能抵抗3′端核酸外切酶的外切作用，增强自身稳定性，为asON成药性修饰提供参考。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学基金资助(编号：39200116)
参考文献
1 Stein CA, Cheng YC. Antisense oligonucleotides as therapeutic agents-Is the bullet really magical? Science, 1993,261:1004-1012.
2 Agrawal S. Antisense oligonucleotides as antiviral agents. Trends Biotechnol, 1992,10:152-158.
3 Rapaport E, Misiura K, Agrawal S, et al. Antimalarial activities of oligodeo-xynucleotide phosphorothioates in chloroquine resistant plasmodium falciparum. Proc Natl Acad Sci USA, 1992,89:8577-8580.
, 百拇医药
4 Goodarzi G, Gross S C, Tewari A, et al. Antisense oligodeoxyribonucleotides inhibit the expression of the gene for he-patitis B virus surface antigen. J Gen Virol.1990,71:3021-3025.
5 姚志强，周永兴，王爱莲，等.反义寡核苷酸对乙型肝炎病毒的体外抗病毒作用.中华医学杂志，1994，72：74-76.
6 Agrawal S, Temsamani J, Tang JY. Pharmacokinetics, biodistribution and stability of oligodeoxynucleotide phosphorothioates in mice. Proc Natl Acad Sci USA, 1991,88:7595-7599.
, 百拇医药
7 Zhang R, Diasio RB, Lu Z, et al. Pharmacokinetics and tissue distribution in rats of an oligodeoxynucleotide phosphorothioate (GEM 91) developed as a therapeutic agent for human immunodeficiency virus type 1. Biochem Pharmacol, 1995,49:929-939.
8 Sands H, Gorey-Feret LY, Cocuzza AJ, et al. Biodistribution and metabolism of internally 3H labeled oligonucleotides I. Comparison of a phosphodiester and a phosphorothioate. Mol Pharmacol,1994,45:932-943.
9 Iversen P, Mata J, Tracewell WG, et al. Pharmacokinetics of an antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide against rev from human immunodeficiency virus type 1 in the adult male rat following single injection and continuous infusion. Antisense Res Dev, 1994,4:43-52.
(收稿：1998-05-22 修回：1998-07-13), http://www.100md.com
单位：黄爱琼 350002 福州，解放军第476医院；姚志强、周永兴 第四军医大学唐都医院
关键词：
中华传染病杂志990314
反义寡核苷酸(asON)抗肿瘤，抗病毒基因调控、复制与表达的研究国内外已有报道[1-3]。研究表明asON能有效地抑制培养细胞中乙型肝炎病毒基因表达[4-5]，是值得研究的新型抗病毒药，但其应用于体内的主要障碍之一是易被血清中各种核酸酶降解。我们在设计抗丙型肝炎病毒asON时，在其3′端增加10个自身互补碱基，实验前加热复性可形成发夹茎环结构，以抵抗3′端核酸酶外切降解，增加自身稳定性。
材料与方法
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一、试剂
DNA多聚酶Ⅰ(polⅠ, Klenow片段)购自美国Promega公司，丙烯酰胺，N，N′-亚甲双丙烯酰胺、过硫酸胺、溴化乙锭均购自华美生物工程公司，TEMED购自美国Serva公司。
二、仪器
391聚合酶链反应mateDNA合成仪、电热恒温水浴箱、TGL-16G高速台式离心机、岛津UV-265分光光度仪、LKB电泳仪、Bio-Rad电泳槽。
三、方法
(一) asON的设计与合成 在美国ABI公司生产的DNA合成仪上合成互补于HCV-C基因起始区(含ATG起始码)的18聚线性硫代磷酸asON(linear asON, L-asON);自身稳定性asON(self-stabilized asON,SS-asON)的设计是在L-asONA的3′端增加10个自身互补碱基，实验前将其在97℃恒温中加热10分钟后自然冷却至室温，形成3′端发夹茎结构。两段asON序列见表1。
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表1 asON碱基序列 名 称
碱 基 序 列
L-asON
5′
TTT
AGG
ATT
CGT
GCT
CAT
3′
SS-asON
5′
, http://www.100md.com
TTT
AGG
ATT
CGT
GCT
CAT
GAT
GC
3′
CTA
CA
(二) polⅠ对asON的降解率测定 将10μl(100u) polⅠ加入3ml缓冲液(50mmol/L Tris, pH 7.2,10mmol MgSO4，0.1mmol/L DTT,0.5mg/ml BSA),混匀，测定其A260值，分别加入10μl(100μg)L-asON或SS-asON，混匀，测0时刻A260值，37℃温育，每间隔30分钟，取出混匀，测定A260值。
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(三) polⅠ外切降解asON 将L-asON或SS-asON(1000pmol)加入20μl缓冲液，再加入polⅠ 0.5μl(5u),混匀，37℃温育，分别于0、30、60、120、240分钟取出，20% PAGE电泳，用溴化乙锭染色。
结果
一、polⅠ对asON降解率
L-asON可被polⅠ降解，见表2。L-asON降解t1/2约为120分钟，SS-asON不被降解，A260值恒定。
表2 polⅠ对asON降解率测定
时 间(分)
0
30
, 百拇医药
60
90
120
150
180
210
240
SS-asON A260值
1.203
1.020
1.190
1.098
1.104
, http://www.100md.com
1.070
1.906
1.087
1.133
L-asON A260值
1.210
1.031
0.970
0.832
0.713
0.564
0.463
, http://www.100md.com
0.378
0.190
二、polⅠ对asON降解外切
polⅠ降解外切L-asON的3′端，20% PAGE电泳可见不同长度片段的降解电泳带，240分钟时L-asON被完全降解，SS-asON不被降解，为单一片段电泳带。
讨论
asON抗病毒研究中的一个重要问题是其稳定性，asON作为药物用于体内主要被3′端核酸外切酶从3′端外切降解。硫代磷酸化修饰的asON比未修饰的反义寡核苷酸酶抵抗性增强，但最终还是被降解[6-9]。为增强核酸酶抗性，3′端修饰包括：3′端环化、3′端掺入抗核酸酶的核苷酸连结键及3′端甲基化等。
本研究设计18聚线性硫代磷酸寡核苷酸，为增强其核酸酶抗性，在3′端增加10个自身互补碱基，加热后复性。形成3′端发夹茎环结构抵抗3′端核酸外切酶的外切作用，增加自身稳定性。有人证明未修饰或硫代磷酸化修饰的asON主要是被血清中3′端外切酶从3′端逐渐外切降解。为证实3′端外切作用，对比研究polⅠ对L-asON或SS-asON 3′端外切作用，L-asON被逐渐外切降解，而SS-asON不降解。说明polⅠ对L-asON有3′端外切作用，而SS-asON 3′端形成发夹茎环结构能抵抗3′端核酸外切酶的外切作用，增强自身稳定性，为asON成药性修饰提供参考。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学基金资助(编号：39200116)
参考文献
1 Stein CA, Cheng YC. Antisense oligonucleotides as therapeutic agents-Is the bullet really magical? Science, 1993,261:1004-1012.
2 Agrawal S. Antisense oligonucleotides as antiviral agents. Trends Biotechnol, 1992,10:152-158.
3 Rapaport E, Misiura K, Agrawal S, et al. Antimalarial activities of oligodeo-xynucleotide phosphorothioates in chloroquine resistant plasmodium falciparum. Proc Natl Acad Sci USA, 1992,89:8577-8580.
, 百拇医药
4 Goodarzi G, Gross S C, Tewari A, et al. Antisense oligodeoxyribonucleotides inhibit the expression of the gene for he-patitis B virus surface antigen. J Gen Virol.1990,71:3021-3025.
5 姚志强，周永兴，王爱莲，等.反义寡核苷酸对乙型肝炎病毒的体外抗病毒作用.中华医学杂志，1994，72：74-76.
6 Agrawal S, Temsamani J, Tang JY. Pharmacokinetics, biodistribution and stability of oligodeoxynucleotide phosphorothioates in mice. Proc Natl Acad Sci USA, 1991,88:7595-7599.
, 百拇医药
7 Zhang R, Diasio RB, Lu Z, et al. Pharmacokinetics and tissue distribution in rats of an oligodeoxynucleotide phosphorothioate (GEM 91) developed as a therapeutic agent for human immunodeficiency virus type 1. Biochem Pharmacol, 1995,49:929-939.
8 Sands H, Gorey-Feret LY, Cocuzza AJ, et al. Biodistribution and metabolism of internally 3H labeled oligonucleotides I. Comparison of a phosphodiester and a phosphorothioate. Mol Pharmacol,1994,45:932-943.
9 Iversen P, Mata J, Tracewell WG, et al. Pharmacokinetics of an antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide against rev from human immunodeficiency virus type 1 in the adult male rat following single injection and continuous infusion. Antisense Res Dev, 1994,4:43-52.
(收稿：1998-05-22 修回：1998-07-13), http://www.100md.com