乙型肝炎患者外周血单个核细胞对HBV不同区抗原的增殖反应
作者：姚鹏 陈乃玲 张晓红
单位：100700 北京，解放军肝病研究所
关键词：肝炎，乙型；细胞免疫；外周血单个核细胞
中华传染病杂志990311 【摘要】 目的 进一步明确外周血细胞免疫在HBV感染过程中的作用。方法 对20例急性乙型肝炎(乙肝)患者、23例慢性乙肝患者、20例正常献血员进行了研究，用氮蓝四唑实验(MTT)测定乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC)对HBV不同区抗原的增殖反应。结果 在急性乙肝患者PBMC对抗原的增殖反应大于慢性乙肝患者及正常对照，PBMC对HBcAg的增殖反应最高，HBeAg次之，而对HBsAg的反应均较弱。另外，无论在急性、慢性患者，其PBMC对抗原的增殖反应水平与血清丙氨酸转氨酶(ALT)的变化无明显相关性。血清HBV DNA阴性、HBeAg阴性的慢性肝炎或慢性肝炎急性发作患者，其PBMC对HBV抗原的增殖反应较弱，在血清HBV DNA或HBeAg阳性患者，增殖反应较强，而当血清HBV DNA、HBeAg均阳性时，增殖反应最强，表明外周细胞免疫与HBV的复制及清除相关。结论 HBV感染后，外周血中存在对HBV抗原的细胞免疫，这种细胞免疫可能与乙肝的发病及HBV的清除有关。
, 百拇医药
Proliferative responses of peripheral blood mononuclear cell to various HBV antigen in the patients with hepatitis B
YAO Peng,CHEN Nailing,ZHANG Xiaohong.
Institute of Liver Disease,PLA,Beijing 100700
【Abstract】 Objective To investigate the role of cell mediated immunity in HBV infection.Methods Using the method of MTT(3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide),the prolifera-tive responses of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) to hepatitis B virus antigen HBcAg,HBeAg and HBsAg were studied in 20 patients with acute hepatitis B and 23 patients with chronic hepatitis B as well as 20 heath normal donrors.Results Patients with acute hepatitis B showed stronger proliferative responses of PBMC to HBV antigen than patients with chronic hepatitis B as well as normal donors.The responses to HBcAg and HBeAg were stronger than that to HBsAg in both acute and chronic group.It was also found that cellular prolifertive response,which showed no correlation with ALT level,was significantly increased in the patients with HBV DNA+or/and HBeAg +.Conclusion The results indicate that cellular immune responses to HBV antigens exist in peripheral blood of patients with hepatitis B and potentially play an essential role not only in eliminating virus but also in the pathogenesis of hepatitis B.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis B Cellular immune Peripheral blood mononuclear cell
目前认为，HBV对肝细胞的损害主要是由于HBV感染后所引起的免疫应答所致。HBV感染后，机体可激发针对HBV抗原的体液免疫和细胞免疫应答，并在HBV感染致病过程及HBV的清除中起一定作用。为更好的了解HBV清除的机制，肝细胞损伤的发展和HBV感染的慢性化评估，我们对HBV感染不同阶段的患者，其外周淋巴细胞对不同HBV编码抗原的反应进行分析研究。
对象与方法
一、病例选择
(一) 实验组 急性乙型肝炎(乙肝)患者26例，慢性乙肝患者28例，男30例，女24例，平均年龄38岁，均系我院住院患者，诊断均符合1995年(北京)第五次全国传染病与寄生虫病学术会议修订的诊断标准。
, http://www.100md.com
(二) 对照组 18例正常献血员来源于北京市中心血站，男10例，女8例，平均年龄33岁。
以上两组均排除其他免疫系统疾病，未用免疫制剂，近期无感染。
二、抗原
HBcAg本所提供；HBeAg系本所邬光惠教授赠送；HBsAg购自北京医科大学人民医院肝病研究所。
三、外周血单个核细胞(PBMC)分离
常规PBMC分离，参照文献[1]。
四、增殖实验
用MTT法测定[2]。分离PBMC后，实验组以每孔5×105个细胞置入96孔板，一式三份，分别加入各种HBV抗原10μl/孔及1∶300 PHA 20μl，对照组加等体积的RPMI 1640，37℃、5% CO2温箱中温育72小时，再加入MTT 10μl/孔，再37℃、6小时后，加入盐酸异丙醇100μl/孔，彻底混匀后，静置15分钟，测各孔A570值，按以下公式计算增殖指数。
, 百拇医药
增殖指数=实验组测得A值/对照组测得A值
五、HBV DNA测定
采用聚合酶链反应(PCR)法，试剂盒购自北京医科大学肝病研究所。
六、统计学处理
采用t检验、χ2检验、方差检验。
结 果
一、急慢性乙肝患者PBMC对HBV不同区抗原的免疫增殖反应
我们分别对20例急性乙肝患者，23例慢性乙肝患者以及20例正常对照者PBMC对HBV不同区抗原的增殖反应进行研究，发现在急性患者，对抗原的增殖反应大于慢性者及正常对照(见表1)。
, 百拇医药
表1 PBMC对HBV不同区抗原的免疫增殖反应(
) 组别
例数
Core
HBeAg
HBsAg
PHA
急性
20
2.051±0.368
1.668±0.220
, http://www.100md.com
1.532±0.193
2.098±0.474
慢性
23
1.678±0.301
1.462±0.176
1.413±0.173
2.080±0.290
正常
20
1.127±3.940
1.191±0.890
, 百拇医药
1.157±6.721
2.026±0.230
P值
<0.01
<0.01
<0.01
>0.05
注：表中急性组与正常组相比，PHA(植物血凝素)作为阳性对照
二、PBMC对HBV不同抗原的增殖反应
对急慢性乙肝患者PBMC对HBV抗原的增殖反应进行观察，发现在急性组PBMC对HBcAg的增殖反应最高，HBeAg次之，对HBsAg的增殖反应较弱。在慢性组中亦发现对HBcAg、HBeAg的明显增殖反应，而对HBsAg的反应均较弱(见图1)。
, 百拇医药
图1 PBMC对HBV不同抗原的增殖反应
三、ALT与PBMC增殖反应的关系
我们进一步观察了在急、慢性乙肝患者，不同时期ALT变化与PBMC对HBV抗原增殖反应的关系，结果显示不论在急性、慢性乙肝患者，其PBMC对抗原的增殖反应水平与ALT的变化无明显相关性。
四、HBV DNA、HBeAg与PBMC增殖反应的关系
在血清HBV DNA阴性、HBeAg阴性的慢性乙肝或慢性乙肝急性发作患者，其PBMC对HBV抗原的增殖反应较弱(1.22±0.39)，在血清HBV DNA阳性、HBeAg阴性或HBeAg阳性、HBV DNA阴性患者，其PBMC对HBV抗原的增殖反应较强(分别为1.56±0.19和1.58±0.17)，而当在血清HBV DNA、HBeAg均阳性时，PBMC对HBV抗原的增殖反应最强(1.96±0.37)，呈递增关系，但并无统计学差异(P>0.05)。
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讨 论
HBV感染后可激发机体对HBV抗原的体液免疫和细胞免疫应答，目前认为，这种免疫应答在肝细胞的损害过程及HBV的清除中起重要作用[3，4]。本研究中，我们用HBsAg、HBeAg、HBcAg等一系列特异性的HBV抗原进行实验，在体外分别刺激急、慢性HBV感染患者外周PBMC，观察其细胞免疫反应，并用健康者作对照，进行了较系统的研究。
我们分别对20例急性乙肝，23例慢性乙肝及20例正常对照者PBMC对HBV不同区抗原的增殖反应进行研究，发现在急性HBV感染患者，PBMC对HBV抗原的增殖反应均大于慢性患者及正常对照。进一步对急、慢性乙肝患者PBMC对HBV抗原的增殖反应进行对比研究，发现在急性患者PBMC对HBcAg的增殖反应最高，HBeAg次之，对HBsAg的增殖反应较弱。PBMC对HBcAg的增殖反应稍高于HBeAg，可能是由于核心抗原结构能被APC更有效地识别所致。在慢性患者中亦发现对HBcAg、HBeAg的明显增殖反应，而两组对HBsAg的增殖反应均较弱。这表明在急、慢性HBV感染，对细胞免疫活性而言，HBV核壳抗原(包括HBcAg、HBeAg)比包膜抗原有更高的免疫原性。我们进一步研究了HBV感染不同时期血清ALT与淋巴细胞增殖的关系，发现不论在急性或慢性患者，其PBMC对抗原的增殖反应水平与ALT变化无明显相关性。有些患者甚至在ALT正常以后才出现明显的增殖反应。我们还研究了血清HBV DNA及HBeAg与PBMC对HBV核心抗原的增殖反应的关系，发现，在血清HBV DNA阴性、HBeAg阴性的慢性乙肝或慢性乙肝急性发作患者，其PMBC对HBV抗原的增殖反应较弱，在血清HBV DNA或HBeAg阳性患者，其PBMC对HBV抗原的增殖反应较强，而当在血清HBV DNA、HBeAg均阳性时，PBMC对HBV抗原的增殖反应最强，呈递增关系，但并无统计学差异(P>0.05)。这表明，在HBV感染者PBMC对HBV抗原的反应与HBV的复制及清除具有相关性[5]。
, 百拇医药
我们的实验表明，在HBV感染后，外周血中存在对HBV抗原的细胞免疫反应，这种细胞免疫反应可能与乙肝的发病及HBV的清除有关。而且，我们的结果阐明了HBV感染后细胞免疫的一些特点，这将对HBV感染后免疫致病机制的进一步研究提供更多依据。
参考文献
1 Hanns FL,Wolfgang W,Jorg S,et al.Proliferative response of CD4+T cells and hepatitis B virus clearance in chronic hepatitis with or without hepatitis B e-minus hepatitis B virus mutants.Hepatology,1995,22:61-68.
2 姚鹏，张春英，李静.慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞对HCV不同区抗原的增殖反应.中华肝脏病杂志，1997，5：17-18.
, http://www.100md.com
3 Jung MC,Spengler U,Schraut W,et al.Hepatitis B virus antigen-specific T cell activation in patients with acute and chronic hepatitis B.J Hepatol,1991,13:310-317.
4 Reinhold S,Karl M,Thomas M,et al.Antibody and cytotoxic T cell response to soluble hepatitis B virus S antigen in mice:implication for the pathogenesis of HBV induced hepatitis.J Virol,1994,68:1418-1425.
5 Carlo F,Amalia P,Antonio B,et al.Cellular immune response to hepatitis B virus encoded antigens in acute and chronic hepatitis B virus infection.J Immunol,1990,145:3442-3449.
(收稿：1998-09-23 修回：1999-05-03), 百拇医药
单位：100700 北京，解放军肝病研究所
关键词：肝炎，乙型；细胞免疫；外周血单个核细胞
中华传染病杂志990311 【摘要】 目的 进一步明确外周血细胞免疫在HBV感染过程中的作用。方法 对20例急性乙型肝炎(乙肝)患者、23例慢性乙肝患者、20例正常献血员进行了研究，用氮蓝四唑实验(MTT)测定乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC)对HBV不同区抗原的增殖反应。结果 在急性乙肝患者PBMC对抗原的增殖反应大于慢性乙肝患者及正常对照，PBMC对HBcAg的增殖反应最高，HBeAg次之，而对HBsAg的反应均较弱。另外，无论在急性、慢性患者，其PBMC对抗原的增殖反应水平与血清丙氨酸转氨酶(ALT)的变化无明显相关性。血清HBV DNA阴性、HBeAg阴性的慢性肝炎或慢性肝炎急性发作患者，其PBMC对HBV抗原的增殖反应较弱，在血清HBV DNA或HBeAg阳性患者，增殖反应较强，而当血清HBV DNA、HBeAg均阳性时，增殖反应最强，表明外周细胞免疫与HBV的复制及清除相关。结论 HBV感染后，外周血中存在对HBV抗原的细胞免疫，这种细胞免疫可能与乙肝的发病及HBV的清除有关。
, 百拇医药
Proliferative responses of peripheral blood mononuclear cell to various HBV antigen in the patients with hepatitis B
YAO Peng,CHEN Nailing,ZHANG Xiaohong.
Institute of Liver Disease,PLA,Beijing 100700
【Abstract】 Objective To investigate the role of cell mediated immunity in HBV infection.Methods Using the method of MTT(3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide),the prolifera-tive responses of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) to hepatitis B virus antigen HBcAg,HBeAg and HBsAg were studied in 20 patients with acute hepatitis B and 23 patients with chronic hepatitis B as well as 20 heath normal donrors.Results Patients with acute hepatitis B showed stronger proliferative responses of PBMC to HBV antigen than patients with chronic hepatitis B as well as normal donors.The responses to HBcAg and HBeAg were stronger than that to HBsAg in both acute and chronic group.It was also found that cellular prolifertive response,which showed no correlation with ALT level,was significantly increased in the patients with HBV DNA+or/and HBeAg +.Conclusion The results indicate that cellular immune responses to HBV antigens exist in peripheral blood of patients with hepatitis B and potentially play an essential role not only in eliminating virus but also in the pathogenesis of hepatitis B.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis B Cellular immune Peripheral blood mononuclear cell
目前认为，HBV对肝细胞的损害主要是由于HBV感染后所引起的免疫应答所致。HBV感染后，机体可激发针对HBV抗原的体液免疫和细胞免疫应答，并在HBV感染致病过程及HBV的清除中起一定作用。为更好的了解HBV清除的机制，肝细胞损伤的发展和HBV感染的慢性化评估，我们对HBV感染不同阶段的患者，其外周淋巴细胞对不同HBV编码抗原的反应进行分析研究。
对象与方法
一、病例选择
(一) 实验组 急性乙型肝炎(乙肝)患者26例，慢性乙肝患者28例，男30例，女24例，平均年龄38岁，均系我院住院患者，诊断均符合1995年(北京)第五次全国传染病与寄生虫病学术会议修订的诊断标准。
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(二) 对照组 18例正常献血员来源于北京市中心血站，男10例，女8例，平均年龄33岁。
以上两组均排除其他免疫系统疾病，未用免疫制剂，近期无感染。
二、抗原
HBcAg本所提供；HBeAg系本所邬光惠教授赠送；HBsAg购自北京医科大学人民医院肝病研究所。
三、外周血单个核细胞(PBMC)分离
常规PBMC分离，参照文献[1]。
四、增殖实验
用MTT法测定[2]。分离PBMC后，实验组以每孔5×105个细胞置入96孔板，一式三份，分别加入各种HBV抗原10μl/孔及1∶300 PHA 20μl，对照组加等体积的RPMI 1640，37℃、5% CO2温箱中温育72小时，再加入MTT 10μl/孔，再37℃、6小时后，加入盐酸异丙醇100μl/孔，彻底混匀后，静置15分钟，测各孔A570值，按以下公式计算增殖指数。
, 百拇医药
增殖指数=实验组测得A值/对照组测得A值
五、HBV DNA测定
采用聚合酶链反应(PCR)法，试剂盒购自北京医科大学肝病研究所。
六、统计学处理
采用t检验、χ2检验、方差检验。
结 果
一、急慢性乙肝患者PBMC对HBV不同区抗原的免疫增殖反应
我们分别对20例急性乙肝患者，23例慢性乙肝患者以及20例正常对照者PBMC对HBV不同区抗原的增殖反应进行研究，发现在急性患者，对抗原的增殖反应大于慢性者及正常对照(见表1)。
, 百拇医药
表1 PBMC对HBV不同区抗原的免疫增殖反应(
) 组别例数
Core
HBeAg
HBsAg
PHA
急性
20
2.051±0.368
1.668±0.220
, http://www.100md.com
1.532±0.193
2.098±0.474
慢性
23
1.678±0.301
1.462±0.176
1.413±0.173
2.080±0.290
正常
20
1.127±3.940
1.191±0.890
, 百拇医药
1.157±6.721
2.026±0.230
P值
<0.01
<0.01
<0.01
>0.05
注：表中急性组与正常组相比，PHA(植物血凝素)作为阳性对照
二、PBMC对HBV不同抗原的增殖反应
对急慢性乙肝患者PBMC对HBV抗原的增殖反应进行观察，发现在急性组PBMC对HBcAg的增殖反应最高，HBeAg次之，对HBsAg的增殖反应较弱。在慢性组中亦发现对HBcAg、HBeAg的明显增殖反应，而对HBsAg的反应均较弱(见图1)。
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图1 PBMC对HBV不同抗原的增殖反应
三、ALT与PBMC增殖反应的关系
我们进一步观察了在急、慢性乙肝患者，不同时期ALT变化与PBMC对HBV抗原增殖反应的关系，结果显示不论在急性、慢性乙肝患者，其PBMC对抗原的增殖反应水平与ALT的变化无明显相关性。
四、HBV DNA、HBeAg与PBMC增殖反应的关系
在血清HBV DNA阴性、HBeAg阴性的慢性乙肝或慢性乙肝急性发作患者，其PBMC对HBV抗原的增殖反应较弱(1.22±0.39)，在血清HBV DNA阳性、HBeAg阴性或HBeAg阳性、HBV DNA阴性患者，其PBMC对HBV抗原的增殖反应较强(分别为1.56±0.19和1.58±0.17)，而当在血清HBV DNA、HBeAg均阳性时，PBMC对HBV抗原的增殖反应最强(1.96±0.37)，呈递增关系，但并无统计学差异(P>0.05)。
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讨 论
HBV感染后可激发机体对HBV抗原的体液免疫和细胞免疫应答，目前认为，这种免疫应答在肝细胞的损害过程及HBV的清除中起重要作用[3，4]。本研究中，我们用HBsAg、HBeAg、HBcAg等一系列特异性的HBV抗原进行实验，在体外分别刺激急、慢性HBV感染患者外周PBMC，观察其细胞免疫反应，并用健康者作对照，进行了较系统的研究。
我们分别对20例急性乙肝，23例慢性乙肝及20例正常对照者PBMC对HBV不同区抗原的增殖反应进行研究，发现在急性HBV感染患者，PBMC对HBV抗原的增殖反应均大于慢性患者及正常对照。进一步对急、慢性乙肝患者PBMC对HBV抗原的增殖反应进行对比研究，发现在急性患者PBMC对HBcAg的增殖反应最高，HBeAg次之，对HBsAg的增殖反应较弱。PBMC对HBcAg的增殖反应稍高于HBeAg，可能是由于核心抗原结构能被APC更有效地识别所致。在慢性患者中亦发现对HBcAg、HBeAg的明显增殖反应，而两组对HBsAg的增殖反应均较弱。这表明在急、慢性HBV感染，对细胞免疫活性而言，HBV核壳抗原(包括HBcAg、HBeAg)比包膜抗原有更高的免疫原性。我们进一步研究了HBV感染不同时期血清ALT与淋巴细胞增殖的关系，发现不论在急性或慢性患者，其PBMC对抗原的增殖反应水平与ALT变化无明显相关性。有些患者甚至在ALT正常以后才出现明显的增殖反应。我们还研究了血清HBV DNA及HBeAg与PBMC对HBV核心抗原的增殖反应的关系，发现，在血清HBV DNA阴性、HBeAg阴性的慢性乙肝或慢性乙肝急性发作患者，其PMBC对HBV抗原的增殖反应较弱，在血清HBV DNA或HBeAg阳性患者，其PBMC对HBV抗原的增殖反应较强，而当在血清HBV DNA、HBeAg均阳性时，PBMC对HBV抗原的增殖反应最强，呈递增关系，但并无统计学差异(P>0.05)。这表明，在HBV感染者PBMC对HBV抗原的反应与HBV的复制及清除具有相关性[5]。
, 百拇医药
我们的实验表明，在HBV感染后，外周血中存在对HBV抗原的细胞免疫反应，这种细胞免疫反应可能与乙肝的发病及HBV的清除有关。而且，我们的结果阐明了HBV感染后细胞免疫的一些特点，这将对HBV感染后免疫致病机制的进一步研究提供更多依据。
参考文献
1 Hanns FL,Wolfgang W,Jorg S,et al.Proliferative response of CD4+T cells and hepatitis B virus clearance in chronic hepatitis with or without hepatitis B e-minus hepatitis B virus mutants.Hepatology,1995,22:61-68.
2 姚鹏，张春英，李静.慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞对HCV不同区抗原的增殖反应.中华肝脏病杂志，1997，5：17-18.
, http://www.100md.com
3 Jung MC,Spengler U,Schraut W,et al.Hepatitis B virus antigen-specific T cell activation in patients with acute and chronic hepatitis B.J Hepatol,1991,13:310-317.
4 Reinhold S,Karl M,Thomas M,et al.Antibody and cytotoxic T cell response to soluble hepatitis B virus S antigen in mice:implication for the pathogenesis of HBV induced hepatitis.J Virol,1994,68:1418-1425.
5 Carlo F,Amalia P,Antonio B,et al.Cellular immune response to hepatitis B virus encoded antigens in acute and chronic hepatitis B virus infection.J Immunol,1990,145:3442-3449.
(收稿：1998-09-23 修回：1999-05-03), 百拇医药