HBV X蛋白结合共同转录因子ⅡB的研究
作者：杨益大 马亦林 郑临 村上清史
单位：杨益大、马亦林、郑临 310003 杭州，浙江大学附属第一医院；；村上清史 日本金泽大学肿瘤研究所
关键词：乙型肝炎病毒X蛋白；共同转录因子ⅡB；结合
中华传染病杂志990304 【摘要】 目的 研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBV X蛋白)能否结合共同转录因子ⅡB(TFⅡB)。方法 应用体外蛋白与蛋白结合试验(Pull-Down试验)和Far-Western Blot试验，以及细胞内联合免疫沉淀试验。结果 HBV X蛋白能直接与普通TFⅡB结合。HBV X的X199(51-99)是结合TFⅡB的最小基团。研究还证实土拨鼠肝炎病毒X蛋白(WHX)同样能与TFⅡB结合。细胞内联合免疫沉淀试验更进一步证实了体外蛋白与蛋白结合实验的结果。结论 嗜肝DNA病毒X蛋白与TFⅡB结合是其发挥反式转录激活作用的机制之一。
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Study on the binding of HBV X protien to the general transcription factor ⅡB
YANG Yida, MA Yilin, ZHEN Lin, et al.
Department of Infectours Diseases, The First Affiliated Hospital of Zhejiang University, Hangzhou 310003
【Abstract】 Objective To study the binding of HBV X protein(HBV X) to the general transcription factor ⅡB(TF ⅡB).Methods Pull-Down assay in vitro, Far-Western Blot assay and Co-Immunopreci-pitation assay in vivo were used to detect the binding of HBX protien to TF ⅡB. Results It was found that HBX binded TF ⅡB directly and HBV X 199(51-99)is the minimal domain responsible for the binding to TF ⅡB. Furthermore, the binding of TF ⅡB-HBX in vitro was confirmed by intracellular co-immunoprecripition assay. It was also found that the woodchuck hepatitis virus X protien (WHX) was to bind TF ⅡB. Conclusion These RE results suggest that the interaction between HBX and TF ⅡB maybe of the mechanisms which account for its transcription activity.
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【Key words】 Hepatitis B virus X protein General transcription factor ⅡB Binding
乙型肝炎病毒(HBV)X基因编码相对分子质量为17 000的X蛋白(HBV X蛋白)，具有反式转录激活作用，能广泛激活病毒和细胞的启动子的转录，在HBV复制，感染以及慢性HBV感染所致肝细胞癌(HCC)中均有十分重要的作用[1]。已报道的HBX结合蛋白有RNA聚合酶Ⅱ(RNA Pol Ⅱ)亚单位RPB5、TATA反应元件结合蛋白(TBP)及共同转录因子TFⅡB[2，3]等。HBX是通过与这些因子以及许多未知的蛋白结合参与了转录的调节。共同转录因子ⅡB(TF ⅡB)是RNA PolⅡ转录起始复合物(PIC)中的重要成分，它与TBP结合组成了PIC最基本结构；而且RNA PolⅡ与TFⅡB结合后才能进入PIC发挥其功能；同时TFⅡB又是许多具有转录活性的病毒蛋白如单疱疹病毒的VP16、EB病毒的EBNA-2、猴病毒的大T抗原等结合的靶蛋白[4]，在转录调节中有重要作用。我们用不同的方法证实HBV的HBV X蛋白也能结合TFⅡB，现将结果报道如下。
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材料与方法
(一) 质粒构建
大肠杆菌表达质粒pGENK1购自Stragagene公司，表达谷胱苷肽S转移酶(GST)融合蛋白。本实验所有的GST融合蛋白中含有能被cAMP依赖蛋白激酶磷酸化部位。HBV X蛋白全长和截短(Truncated)突变体X-1、D1、D3、D5、X16、X199和GST-WHX融合蛋白表达质粒由日本金泽大学村上教授提供。TFⅡB cDNA亦由村上教授赠送。全长TFⅡB cDNA被插入pGENK1作为大肠杆菌(E.coli)蛋白表达质粒。构建方法以约0.5μgTFⅡB片段和1μg pGENK1载体(Vector),加入1.5μl Ligation High(Takara)在室温下放置2小时。将连接好的质粒在冰上放置1小时，同时从-80°C冰箱中取出感受态细胞E.coli.XL-1 Blue(Stratagene)置于冰上融化，40μl感受态细胞加于连接后的质粒中，再在冰上放置30分钟，然后置37°C水浴箱中2分钟，再快速置于冰上2分钟，加入0.5ml SOC培养基，37°C震荡温育30分钟，离心收集细胞，接种于含氨苄青霉素(Amp)的LB培养皿中，37°C温箱过夜培养。以5GST为正链引物，GSTR为负链引物，聚合酶链反应(PCR)法筛选出阳性克隆。
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哺乳动物细胞表达质粒NKFlag Vector由日本金泽大学肿瘤所山下博士提供，该质粒含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，全长HBV X蛋白片段(insert)以酶切方法取自pGENK1 HBV X蛋白-1，将0.5μg HBV X蛋白片段，1μg NKFlag Vector,1.5μl Ligation High共同在室温下温育2小时，转化至XL-1 Blue感受态细胞，37°C过夜培养。以T7为正链引物，HBXR为负链引物筛选阳性克隆。pUTPLTF ⅡB亦为哺乳动物细胞表达质粒由村上教授提供。所有突变体均经Taq测序试剂盒(Promega)和DNA测序仪(370A，Applied Biosytem)测序。
二、重组蛋白质的诱导和纯化
GST融合蛋白mol表达质粒转化至JM109大肠杆菌(E.coli.)，单菌落接种至含有Amp的LB培养基中，37°C过夜培养，转种于250ml含Amp的LB培养基中，同时加入终浓度为0.4mol IPTG(isopropyl-β-D-thiogalac topyranoside)，30°C培养5～6小时，离心收集细胞，溶解于PBST(磷酸盐缓冲液，pH7.5,含1%Triton-100)，超声波细胞打碎仪打碎细胞后加入谷胱苷肽Sepharose 4B树脂(Pharmacia Biotech. Inc.)，4°C旋转温育1小时，经PBST洗涤3次后，结合蛋白用10mmol/L还原型谷胱苷肽洗脱，蛋白质贮存于-80°C。
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组氨酸(Histidine)融合蛋白表达质粒被转化至BL-21(E.coli.)。细菌接种至含Amp的LB培养基中，同时加入终浓度为1mol IPTG，30°C5～6小时培养后，收集细胞并由超声波粉碎仪打碎细胞，加入Nickle Sepharose树脂(Invitrogene Co.)，4°C旋转温育1小时，用TBS缓冲液(50mol Tris HCl,pH7.5, 150mol NaCl,1%Triton-100)洗涤5次，然后由依咪哒唑(Imidazole)缓冲液(300mol Imidazole, 20mol Na2HPO4,500mol NaCl,pH4.0)洗脱，蛋白质贮存于-80°C。
三、Pull-Down试验
约1μg GST或GST融合蛋白被吸附于谷胱苷肽Sepharose 4B树脂上，在GBT缓冲液中(10%甘油，50mol Hepes NaOH pH7.5, 50mol KCl, 7.5mol MgCl2,0.1mol EDTA, 0.1mol二硫苏糖醇(DTT)，1%Triton-100)，加入100～200ng靶蛋白以及终浓度为1%牛血清(BSA)，4°C旋转温育2小时，经GBT缓冲液至少洗涤5次，结合蛋白由12.5%SDS/PAGE分离，Western Blot检测结果。
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四、Far-Western Blot试验
约5～6μg GST融合蛋白，10×HMK缓冲液(20mol Tris HCl pH7.5,100mol NaCl,12mol MgCl2)，新鲜配制的cAMP依赖的蛋白激酶(PKA，Sigma)，1μci/μl r-32P ATP(Amersham)，1mol DTT在室温下温育1小时，经Sephadax柱纯化，放射自显影检测表记结果，-20°C贮藏备用。被结合蛋白经12.5%SDS-PAGE分离，转移至硝酸纤维膜上。5%牛乳阻断，然后将膜与10ml蛋白结合反应液，包括GBT缓冲液，终浓度为1%的BSA，2mol未标记的ATP，1mg/ml GST蛋白γ-32P标记的探针(40～100ng/ml蛋白质，2×106 cpm/μg蛋白质)一起在室温下温育1小时，GBT至少洗涤3次，每次10分钟，IP(Image Plate)曝光，读片(Fuji,Bas 100)。
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五、联合免疫沉淀和Western Blot试验
约1×105 Hepa G2细胞接种至直径为6cm塑料培养皿中(GIBCO),37°C，5%CO2条件下培养24小时；将20μg不同组合的pNKFlag HBV X蛋白和pUTPL TF ⅡB DNA,0.5ml 0.25mol CaCl2,0.5ml 2×BES[N，N-双(乙羟乙基)-2-氨基乙磺酸](Sigma)混匀，室温下旋转摇匀1小时，加至Hepa G2细胞中，3%CO2，35°C温育24小时，用10%FCS的DEME培养(GIBCO)清洗，加入10ml DEME(10%FCS)10ml培养24小时。离心收获细胞，在LAC缓冲液中(10%甘油，20mol Hepes NaOH pH7.5,50mol KCl, 0.4mol NaCl, 10mol MgCl2,0.1mol DTT,0.1mol EDTA,9mol CHAPS,0.5mol PMSF,10μg/ml aprotinin和leupeptinin用超声波将细胞打碎，100μl裂解液与400μl裂解缓冲液(20mol Tris HCl pH8.0,180mol NaCl, 1mol EDTA,0.5% Triton-100)混匀，加入Anti-Flag M2树脂(Kodak)，在冷房(4°C)温育6小时，经TBS缓冲液(500mol Tris HCl,150mol NaCl pH7.4)洗涤后，用0.1mg/ml Flag-peptide(Kodak)洗脱结合蛋白。经12.5%SDS/PAGE电泳后转移至硝酸纤维膜。5%牛乳阻断，与第一抗体(抗-TFⅡB，由日本金泽大学肿瘤所村上教授提供)室温温育1小时充分洗涤，然后与Protein A一起温育1小时，经增强化学发光系统(ECL，Amersham)检测。
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结果
一、确定HBV X蛋白结构内结合TFⅡB的部位
HBV X蛋白由154个氨基酸组成，其C-末端具有转录激活作用，而N-末端则能抑制转录[6]。为了确定HBX结构内结合TFⅡB的位置，本研究按照图1A所示纯化了HBV X蛋白全长和截短突变体GST融合蛋白如图1B；应用Pull-Down试验，结果表明HBV X蛋白的C-末端是结合TFⅡB部位如图1C，X199是结合TFⅡB的最小基团。而N-末端XD5不结合TFⅡB。另一证明体外蛋白与蛋白结合的方法Far-Western Blot试验结果与Pull-Down试验结果完全一致，见图1D。本结果提示HBV X蛋白转录活性基团C-末端与TFⅡB结合是其发挥转录激活作用的机制之一。
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A：HBV X蛋白全长和各截短突变体的片段长度；B:Coomassia蓝染色，为纯化HBV X蛋白全长和截短突变体GST融合蛋白(第1～7道分别是HBXD1、HBXD3，HBXD5，HBX、HBX16、HBX199和GST蛋白)；C：Pull-Down试验，第1道加入20ng His-TF ⅡB作为结合反应的阳性参照，第2道是GST蛋白质为阴性对照，第3～8道加入了HBV X全长和截短突变体(HBXD1、HBXD3、HBXD5、HBX、HBX16、HBX199)GST融合蛋白，靶蛋白是Histidin融合TFⅡB； D：Far-Western Blotting试验，第1道是阴性对照GST蛋白，第2～7道是GST融合的HBV X蛋白全长或截短突变体(HBX199、HBX16、HBX、HBXD5、HBXD3及HBXD1)蛋白质，所用探针为r-32P标记的TFⅡB，分子量Marker如各图左侧所示。
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图1 确定HBX结构内结合TFⅡB的部位
二、WHX亦能结合TFⅡB
WHX是土拨鼠肝炎病毒(WHV)复制所必需，又与导致土拨鼠肝细胞癌变密切相关[6]。TFⅡB结构在哺乳动物中高度保守[7]，为了证明WHX是否亦具有能与普通TFⅡB结合，本研究将GST融合WHX和TFⅡB一起温育，结果WHX亦能与TFⅡB结合，见图2。提示嗜肝DNA病毒X蛋白与TFⅡB结合是它们发挥反式转录激活作用的机制之一。
Pull-Down试验。第1道加入2ong His-TFⅡB作为结合反应的阳性参照，第2道加入GST蛋白为阴性对照，RPB5为结合TFⅡB的阳性对照，CBP(CREB Binding Protein)是不能结合TFⅡB的阴性对照，HBV X蛋白和WHX分别是第5道和第6道，相对分子质量Marker见图右侧
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图2 WHX结合TFⅡB
三、HBV X蛋白在细胞内也能结合TFⅡB
按“材料与方法”五，W-CaCl2沉淀方法将Flag HBX和TFⅡB(第3道)或者Flag HBV X蛋白表达质粒单独(第3道)转染Hepa G2细胞。48小时后收集细胞。超声波打碎细胞，先经Anti-Flag M2树脂将表达的Flag HBV X蛋白沉淀，由12.5%SDS/PAGE分离，结合蛋白再由Anti-TFⅡB检测，本结果指出HBV X蛋白不仅能结合过度表达TFⅡB，如第2道所示；又能结合内源性TFⅡB，如第3道所表示。而不能结合Flag Vector本身(第4道)。见图3。本结果更进一步证实HBV X蛋白和TFⅡB结合。
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联合免疫沉淀试验和Western-Blotting试验。第1道为10% pUTPL TFⅡB感染细胞裂解液作为免疫沉淀的阳性参照，第2道加入pFlag HBV X蛋白+pUTPL TFⅡB，第3道单独加入pUTPL TFⅡB。第4道为pFlay Vector作为阴性对照，具体方法见材料与方法五。相对分子质量Marker见图右侧
图3 HBX在细胞内结合TFⅡB
讨论
关于HBV X蛋白的反式转录激活作用机制有诸多报道，但多数学者认为HBV X蛋白是通过与细胞内各种活性蛋白结合而发挥其反式转录激活作用。本结果证实嗜肝DNA病毒X蛋白(HBX和WHX)均能结合TFⅡB，提示与RNA Pol Ⅱ中的转录因子结合，直接影响PIC的形成可能是HBX发挥反式转录激活作用的机制之一。
HBV X蛋白的C-末端具有反式转录激活作用，而其N-末端则具有转录抑制活性[5]。体内外转录试验证实最小的具有转录激活作用的基团位于HBX55-100氨基酸位置[8]，本研究蛋白结合试验指出X199(51-99)是能与TFⅡB结合HBV X蛋白的最小基团，两者结果基本一致，表明HBX的反式转录活性与TFⅡB结合有关。而HBV X蛋白N-末端HBV X蛋白D5不能与TFⅡB结合如图1。这一结果与Lin等[8]所报道的结果相一致。在嗜肝DNA病毒基因结构中XORF最为保守。虽然其表达产物X蛋白在嗜肝DNA病毒复制、感染当中的作用尚未完全阐明，在以土拔鼠(Woodchuck)为模型的研究中发现，如将X基因缺失突变，则WHV复制水平大大降低，并且不能建立持续感染模型[6]。本研究结果同时证明WHX亦能与TFⅡB结合，提示嗜肝DNA病毒X蛋白和TFⅡB相互结合与病毒复制以及感染有一定联系。
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TFⅡB是组成RNA PolⅡPIC的重要成分，RNA PolⅡ是通过和TFⅡB结合而进入PIC，合成mRNA。至于HBV X蛋白与TFⅡB结合后通过什么方式激活转录有以下推测：1.在无转录激活因子存在时，TFⅡB的N-端和C-端可自行结合，从而影响了TFⅡB-TBP-TATA元件复合物的组成，使转录水平维持在低水平，而当HBV X蛋白和TFⅡB C-末端结合后，消除了TFⅡB分子内自行结合，促进TFⅡB-TBP-TATA元件复合物的形成，并使其结构更稳定，激活转录。2. HBV X蛋白不仅能结合TFⅡB，而且能结合RNA PolⅡ的RPB5亚单位，所以HBV X蛋白可能作为桥梁使TFⅡB和RNA PolⅡ结合更迅速、更紧密。当然更确切的机制有待更深入研究。
参考文献
1 Chisari FV, Ferran C. Hepatitis B Virus immunopathogenesis. Anu Rev Immunol, 1995, 13:29-32.
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2 Qadri I, Maguire HF, Siddiqui A. Hepatitis B Virus transactivator X protein interacts with the TATA binding protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1995， 92:1003-1006.
3 Qadri I, Maguire HF, Siddiqui A. Hepatitis B Virus transactivator protien X, HBx, associated with the components TFⅡB and stimulates the DNA helicase actvity of TFⅡH. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:10578-10560.
4 Lin YS, Maldonado D, Reinberg D, et al. Binding of general transcription factor TFⅡB to an acidic activating region. Nature, 1991, 353:569-573.
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5 Murakami S, Cheong JH, Kaneko S. Human Hepatitis B virus X gene encodes a regulatory domain that represses transactivation of X protien. J Biol Chem, 1994, 269: 15118.
6 Chen HS, Kaneko R, Girones R, et al. The woodchuck hepatitis virus X gene is important for establish of virus infection in woodchuck. J Virol, 1993, 67:1218-1222.
7 Chselman WH. Transactivation of cellular gene by hepatitis B virus proteins: a possible mechanism of hepatocarcinogenesis. Adv. Virus Re, 1994, 47:253-256.
8 Lin Y, Nomura T, Cheong TH, et al. Hepatitis B virus X protein is a transcription modulator that communicates with TFⅡB and RPB5. J Biol Chem 1997; 272:7132-7135.
(收稿：1998- 11-11 修回：1999-03-13), 百拇医药
单位：杨益大、马亦林、郑临 310003 杭州，浙江大学附属第一医院；；村上清史 日本金泽大学肿瘤研究所
关键词：乙型肝炎病毒X蛋白；共同转录因子ⅡB；结合
中华传染病杂志990304 【摘要】 目的 研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBV X蛋白)能否结合共同转录因子ⅡB(TFⅡB)。方法 应用体外蛋白与蛋白结合试验(Pull-Down试验)和Far-Western Blot试验，以及细胞内联合免疫沉淀试验。结果 HBV X蛋白能直接与普通TFⅡB结合。HBV X的X199(51-99)是结合TFⅡB的最小基团。研究还证实土拨鼠肝炎病毒X蛋白(WHX)同样能与TFⅡB结合。细胞内联合免疫沉淀试验更进一步证实了体外蛋白与蛋白结合实验的结果。结论 嗜肝DNA病毒X蛋白与TFⅡB结合是其发挥反式转录激活作用的机制之一。
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Study on the binding of HBV X protien to the general transcription factor ⅡB
YANG Yida, MA Yilin, ZHEN Lin, et al.
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【Abstract】 Objective To study the binding of HBV X protein(HBV X) to the general transcription factor ⅡB(TF ⅡB).Methods Pull-Down assay in vitro, Far-Western Blot assay and Co-Immunopreci-pitation assay in vivo were used to detect the binding of HBX protien to TF ⅡB. Results It was found that HBX binded TF ⅡB directly and HBV X 199(51-99)is the minimal domain responsible for the binding to TF ⅡB. Furthermore, the binding of TF ⅡB-HBX in vitro was confirmed by intracellular co-immunoprecripition assay. It was also found that the woodchuck hepatitis virus X protien (WHX) was to bind TF ⅡB. Conclusion These RE results suggest that the interaction between HBX and TF ⅡB maybe of the mechanisms which account for its transcription activity.
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【Key words】 Hepatitis B virus X protein General transcription factor ⅡB Binding
乙型肝炎病毒(HBV)X基因编码相对分子质量为17 000的X蛋白(HBV X蛋白)，具有反式转录激活作用，能广泛激活病毒和细胞的启动子的转录，在HBV复制，感染以及慢性HBV感染所致肝细胞癌(HCC)中均有十分重要的作用[1]。已报道的HBX结合蛋白有RNA聚合酶Ⅱ(RNA Pol Ⅱ)亚单位RPB5、TATA反应元件结合蛋白(TBP)及共同转录因子TFⅡB[2，3]等。HBX是通过与这些因子以及许多未知的蛋白结合参与了转录的调节。共同转录因子ⅡB(TF ⅡB)是RNA PolⅡ转录起始复合物(PIC)中的重要成分，它与TBP结合组成了PIC最基本结构；而且RNA PolⅡ与TFⅡB结合后才能进入PIC发挥其功能；同时TFⅡB又是许多具有转录活性的病毒蛋白如单疱疹病毒的VP16、EB病毒的EBNA-2、猴病毒的大T抗原等结合的靶蛋白[4]，在转录调节中有重要作用。我们用不同的方法证实HBV的HBV X蛋白也能结合TFⅡB，现将结果报道如下。
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材料与方法
(一) 质粒构建
大肠杆菌表达质粒pGENK1购自Stragagene公司，表达谷胱苷肽S转移酶(GST)融合蛋白。本实验所有的GST融合蛋白中含有能被cAMP依赖蛋白激酶磷酸化部位。HBV X蛋白全长和截短(Truncated)突变体X-1、D1、D3、D5、X16、X199和GST-WHX融合蛋白表达质粒由日本金泽大学村上教授提供。TFⅡB cDNA亦由村上教授赠送。全长TFⅡB cDNA被插入pGENK1作为大肠杆菌(E.coli)蛋白表达质粒。构建方法以约0.5μgTFⅡB片段和1μg pGENK1载体(Vector),加入1.5μl Ligation High(Takara)在室温下放置2小时。将连接好的质粒在冰上放置1小时，同时从-80°C冰箱中取出感受态细胞E.coli.XL-1 Blue(Stratagene)置于冰上融化，40μl感受态细胞加于连接后的质粒中，再在冰上放置30分钟，然后置37°C水浴箱中2分钟，再快速置于冰上2分钟，加入0.5ml SOC培养基，37°C震荡温育30分钟，离心收集细胞，接种于含氨苄青霉素(Amp)的LB培养皿中，37°C温箱过夜培养。以5GST为正链引物，GSTR为负链引物，聚合酶链反应(PCR)法筛选出阳性克隆。
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哺乳动物细胞表达质粒NKFlag Vector由日本金泽大学肿瘤所山下博士提供，该质粒含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，全长HBV X蛋白片段(insert)以酶切方法取自pGENK1 HBV X蛋白-1，将0.5μg HBV X蛋白片段，1μg NKFlag Vector,1.5μl Ligation High共同在室温下温育2小时，转化至XL-1 Blue感受态细胞，37°C过夜培养。以T7为正链引物，HBXR为负链引物筛选阳性克隆。pUTPLTF ⅡB亦为哺乳动物细胞表达质粒由村上教授提供。所有突变体均经Taq测序试剂盒(Promega)和DNA测序仪(370A，Applied Biosytem)测序。
二、重组蛋白质的诱导和纯化
GST融合蛋白mol表达质粒转化至JM109大肠杆菌(E.coli.)，单菌落接种至含有Amp的LB培养基中，37°C过夜培养，转种于250ml含Amp的LB培养基中，同时加入终浓度为0.4mol IPTG(isopropyl-β-D-thiogalac topyranoside)，30°C培养5～6小时，离心收集细胞，溶解于PBST(磷酸盐缓冲液，pH7.5,含1%Triton-100)，超声波细胞打碎仪打碎细胞后加入谷胱苷肽Sepharose 4B树脂(Pharmacia Biotech. Inc.)，4°C旋转温育1小时，经PBST洗涤3次后，结合蛋白用10mmol/L还原型谷胱苷肽洗脱，蛋白质贮存于-80°C。
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组氨酸(Histidine)融合蛋白表达质粒被转化至BL-21(E.coli.)。细菌接种至含Amp的LB培养基中，同时加入终浓度为1mol IPTG，30°C5～6小时培养后，收集细胞并由超声波粉碎仪打碎细胞，加入Nickle Sepharose树脂(Invitrogene Co.)，4°C旋转温育1小时，用TBS缓冲液(50mol Tris HCl,pH7.5, 150mol NaCl,1%Triton-100)洗涤5次，然后由依咪哒唑(Imidazole)缓冲液(300mol Imidazole, 20mol Na2HPO4,500mol NaCl,pH4.0)洗脱，蛋白质贮存于-80°C。
三、Pull-Down试验
约1μg GST或GST融合蛋白被吸附于谷胱苷肽Sepharose 4B树脂上，在GBT缓冲液中(10%甘油，50mol Hepes NaOH pH7.5, 50mol KCl, 7.5mol MgCl2,0.1mol EDTA, 0.1mol二硫苏糖醇(DTT)，1%Triton-100)，加入100～200ng靶蛋白以及终浓度为1%牛血清(BSA)，4°C旋转温育2小时，经GBT缓冲液至少洗涤5次，结合蛋白由12.5%SDS/PAGE分离，Western Blot检测结果。
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四、Far-Western Blot试验
约5～6μg GST融合蛋白，10×HMK缓冲液(20mol Tris HCl pH7.5,100mol NaCl,12mol MgCl2)，新鲜配制的cAMP依赖的蛋白激酶(PKA，Sigma)，1μci/μl r-32P ATP(Amersham)，1mol DTT在室温下温育1小时，经Sephadax柱纯化，放射自显影检测表记结果，-20°C贮藏备用。被结合蛋白经12.5%SDS-PAGE分离，转移至硝酸纤维膜上。5%牛乳阻断，然后将膜与10ml蛋白结合反应液，包括GBT缓冲液，终浓度为1%的BSA，2mol未标记的ATP，1mg/ml GST蛋白γ-32P标记的探针(40～100ng/ml蛋白质，2×106 cpm/μg蛋白质)一起在室温下温育1小时，GBT至少洗涤3次，每次10分钟，IP(Image Plate)曝光，读片(Fuji,Bas 100)。
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五、联合免疫沉淀和Western Blot试验
约1×105 Hepa G2细胞接种至直径为6cm塑料培养皿中(GIBCO),37°C，5%CO2条件下培养24小时；将20μg不同组合的pNKFlag HBV X蛋白和pUTPL TF ⅡB DNA,0.5ml 0.25mol CaCl2,0.5ml 2×BES[N，N-双(乙羟乙基)-2-氨基乙磺酸](Sigma)混匀，室温下旋转摇匀1小时，加至Hepa G2细胞中，3%CO2，35°C温育24小时，用10%FCS的DEME培养(GIBCO)清洗，加入10ml DEME(10%FCS)10ml培养24小时。离心收获细胞，在LAC缓冲液中(10%甘油，20mol Hepes NaOH pH7.5,50mol KCl, 0.4mol NaCl, 10mol MgCl2,0.1mol DTT,0.1mol EDTA,9mol CHAPS,0.5mol PMSF,10μg/ml aprotinin和leupeptinin用超声波将细胞打碎，100μl裂解液与400μl裂解缓冲液(20mol Tris HCl pH8.0,180mol NaCl, 1mol EDTA,0.5% Triton-100)混匀，加入Anti-Flag M2树脂(Kodak)，在冷房(4°C)温育6小时，经TBS缓冲液(500mol Tris HCl,150mol NaCl pH7.4)洗涤后，用0.1mg/ml Flag-peptide(Kodak)洗脱结合蛋白。经12.5%SDS/PAGE电泳后转移至硝酸纤维膜。5%牛乳阻断，与第一抗体(抗-TFⅡB，由日本金泽大学肿瘤所村上教授提供)室温温育1小时充分洗涤，然后与Protein A一起温育1小时，经增强化学发光系统(ECL，Amersham)检测。
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结果
一、确定HBV X蛋白结构内结合TFⅡB的部位
HBV X蛋白由154个氨基酸组成，其C-末端具有转录激活作用，而N-末端则能抑制转录[6]。为了确定HBX结构内结合TFⅡB的位置，本研究按照图1A所示纯化了HBV X蛋白全长和截短突变体GST融合蛋白如图1B；应用Pull-Down试验，结果表明HBV X蛋白的C-末端是结合TFⅡB部位如图1C，X199是结合TFⅡB的最小基团。而N-末端XD5不结合TFⅡB。另一证明体外蛋白与蛋白结合的方法Far-Western Blot试验结果与Pull-Down试验结果完全一致，见图1D。本结果提示HBV X蛋白转录活性基团C-末端与TFⅡB结合是其发挥转录激活作用的机制之一。
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A：HBV X蛋白全长和各截短突变体的片段长度；B:Coomassia蓝染色，为纯化HBV X蛋白全长和截短突变体GST融合蛋白(第1～7道分别是HBXD1、HBXD3，HBXD5，HBX、HBX16、HBX199和GST蛋白)；C：Pull-Down试验，第1道加入20ng His-TF ⅡB作为结合反应的阳性参照，第2道是GST蛋白质为阴性对照，第3～8道加入了HBV X全长和截短突变体(HBXD1、HBXD3、HBXD5、HBX、HBX16、HBX199)GST融合蛋白，靶蛋白是Histidin融合TFⅡB； D：Far-Western Blotting试验，第1道是阴性对照GST蛋白，第2～7道是GST融合的HBV X蛋白全长或截短突变体(HBX199、HBX16、HBX、HBXD5、HBXD3及HBXD1)蛋白质，所用探针为r-32P标记的TFⅡB，分子量Marker如各图左侧所示。
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图1 确定HBX结构内结合TFⅡB的部位
二、WHX亦能结合TFⅡB
WHX是土拨鼠肝炎病毒(WHV)复制所必需，又与导致土拨鼠肝细胞癌变密切相关[6]。TFⅡB结构在哺乳动物中高度保守[7]，为了证明WHX是否亦具有能与普通TFⅡB结合，本研究将GST融合WHX和TFⅡB一起温育，结果WHX亦能与TFⅡB结合，见图2。提示嗜肝DNA病毒X蛋白与TFⅡB结合是它们发挥反式转录激活作用的机制之一。
Pull-Down试验。第1道加入2ong His-TFⅡB作为结合反应的阳性参照，第2道加入GST蛋白为阴性对照，RPB5为结合TFⅡB的阳性对照，CBP(CREB Binding Protein)是不能结合TFⅡB的阴性对照，HBV X蛋白和WHX分别是第5道和第6道，相对分子质量Marker见图右侧
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图2 WHX结合TFⅡB
三、HBV X蛋白在细胞内也能结合TFⅡB
按“材料与方法”五，W-CaCl2沉淀方法将Flag HBX和TFⅡB(第3道)或者Flag HBV X蛋白表达质粒单独(第3道)转染Hepa G2细胞。48小时后收集细胞。超声波打碎细胞，先经Anti-Flag M2树脂将表达的Flag HBV X蛋白沉淀，由12.5%SDS/PAGE分离，结合蛋白再由Anti-TFⅡB检测，本结果指出HBV X蛋白不仅能结合过度表达TFⅡB，如第2道所示；又能结合内源性TFⅡB，如第3道所表示。而不能结合Flag Vector本身(第4道)。见图3。本结果更进一步证实HBV X蛋白和TFⅡB结合。
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联合免疫沉淀试验和Western-Blotting试验。第1道为10% pUTPL TFⅡB感染细胞裂解液作为免疫沉淀的阳性参照，第2道加入pFlag HBV X蛋白+pUTPL TFⅡB，第3道单独加入pUTPL TFⅡB。第4道为pFlay Vector作为阴性对照，具体方法见材料与方法五。相对分子质量Marker见图右侧
图3 HBX在细胞内结合TFⅡB
讨论
关于HBV X蛋白的反式转录激活作用机制有诸多报道，但多数学者认为HBV X蛋白是通过与细胞内各种活性蛋白结合而发挥其反式转录激活作用。本结果证实嗜肝DNA病毒X蛋白(HBX和WHX)均能结合TFⅡB，提示与RNA Pol Ⅱ中的转录因子结合，直接影响PIC的形成可能是HBX发挥反式转录激活作用的机制之一。
HBV X蛋白的C-末端具有反式转录激活作用，而其N-末端则具有转录抑制活性[5]。体内外转录试验证实最小的具有转录激活作用的基团位于HBX55-100氨基酸位置[8]，本研究蛋白结合试验指出X199(51-99)是能与TFⅡB结合HBV X蛋白的最小基团，两者结果基本一致，表明HBX的反式转录活性与TFⅡB结合有关。而HBV X蛋白N-末端HBV X蛋白D5不能与TFⅡB结合如图1。这一结果与Lin等[8]所报道的结果相一致。在嗜肝DNA病毒基因结构中XORF最为保守。虽然其表达产物X蛋白在嗜肝DNA病毒复制、感染当中的作用尚未完全阐明，在以土拔鼠(Woodchuck)为模型的研究中发现，如将X基因缺失突变，则WHV复制水平大大降低，并且不能建立持续感染模型[6]。本研究结果同时证明WHX亦能与TFⅡB结合，提示嗜肝DNA病毒X蛋白和TFⅡB相互结合与病毒复制以及感染有一定联系。
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TFⅡB是组成RNA PolⅡPIC的重要成分，RNA PolⅡ是通过和TFⅡB结合而进入PIC，合成mRNA。至于HBV X蛋白与TFⅡB结合后通过什么方式激活转录有以下推测：1.在无转录激活因子存在时，TFⅡB的N-端和C-端可自行结合，从而影响了TFⅡB-TBP-TATA元件复合物的组成，使转录水平维持在低水平，而当HBV X蛋白和TFⅡB C-末端结合后，消除了TFⅡB分子内自行结合，促进TFⅡB-TBP-TATA元件复合物的形成，并使其结构更稳定，激活转录。2. HBV X蛋白不仅能结合TFⅡB，而且能结合RNA PolⅡ的RPB5亚单位，所以HBV X蛋白可能作为桥梁使TFⅡB和RNA PolⅡ结合更迅速、更紧密。当然更确切的机制有待更深入研究。
参考文献
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(收稿：1998- 11-11 修回：1999-03-13), 百拇医药