核酶对细胞内HBeAg表达抑制作用的定量分析
作者：李谨革 周永兴 连建奇 冯志华 李光玉
单位：710038 西安，第四军医大学唐都传染病医院
关键词：核酶；肝炎病毒，乙型；显微镜检查，共焦
中华传染病杂志990303 【摘要】 目的 定量观察双位点核酶对细胞内HBV基因表达的抑制作用。方法 构建针对HBV C区双位点核酶的真核表达载体(pBBS212-Rz)，将该质粒与pl.2Ⅱ(含HBV全序列)，共转染人肝细胞癌(HHCC)细胞株，对转染细胞所表达HBeAg进行间接免疫荧光染色，用共聚焦显微镜对其含量进行定量分析。结果 共转染细胞可以表达HBeAg，同对照组相比，核酶组荧光量明显下降。结论 在核酶与HBV共转染细胞中，核酶通过对HBV mRNA的剪切作用，使HBeAg的表达量明显受到抑制。
Preliminary study on the inhibition of HBeAg expression in cells by ribozyme
, http://www.100md.com
LI Jinge, ZHOU Yong-xing, LIAN Jianqi, et al.
Tangdu Infectious Diseases Hospital, The Fourth Military Medical University, Xian 710038
【Abstract】 Objective To study the inhibition of HBeAg expression in cells by two-unit ribozyme.Methods Plasmid pBBS212-R2,a eukaryotic expression vector with a twounit ribozyme against hepatitis B virus, was constructed and cotransfected with p1.2 Ⅱ plasmid (carring genome of adr-subtype HBV) in to the HHCC cell (Human Hepatocelluar Carcinoma cell line). Immunoflurescence tests were applied to detecte the cotransfected cells, and data was analysed with confocal microscope quantitively. Results The cotransfected cells expressed HBeAg, while the quantity of fluorecein was reduced significantly in comparison with control cells.Conclusion Ribozyme can inhibit the expression of HBeAg in the cotransfected cells by cleaving the mRNA of HBV.
, 百拇医药
【Key words】 Ribozyme Hepatitis B virus Microscopy, Confocal
核酶(Ribozyme)作为一种新型的抗病毒方法，成为基因治疗中一项重要手段[1]。由于核酶可序列特异地与靶RNA配对，切割而使其失去生物功能。因此作为抗病毒、抗肿瘤的一种新的技术，已经用于实验研究。我们采用针对HBV C区双位点核酶真核表达载体，与HBV共转染人肝细胞癌(HHCC)细胞株，用共聚焦显微镜对HHCC细胞内表达的HBeAg进行定量分析。
材料与方法
一、实验材料
(一) pBBS212真核表达载体 由河南医科大学郭建成博士提供，pGEM Rz123(含针对HBV C区双位点核酶)质粒由本室连建奇博士构建。核苷酸序列见图1[2]。
, 百拇医药
图1 核酶及靶mRNA的核苷酸序列
(二) 试剂 脂质体(Lipofectamine)、DMEM Gibco公司产品，潮霉素B(Hygromycin B) Sigma公司产品，T4DNA连接酶Promaga公司产品，各种工具酶购自华美公司，HHCC细胞本室保存。HBeAg ELISA检测试剂盒，系科华公司产品。
二、实验方法
(一) 含针对HBV C区核酶的真核表达质粒的构建 pGEM Rz123及pBBS212均用EcoRⅠ及BamHⅠ进行双酶切，分别回收88bp及10 535bp片段，用双粘法进行连接[3]，连接产物转化JM109菌。挑取克隆，用EcoRⅠ及BamHⅠ,KpnⅠ及Hind Ⅲ对筛选重组体进行酶切鉴定，用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(二) 含核酶真核表达载体pBBS212-Rz转染HHCC细胞 在6孔板中培养至60%～80%密度。准备A液：100μl无血清DMEM中含5μg pBBS212与5μg pl.2Ⅱ或5μg pBBS212-Rz与pl.2Ⅱ。准备B液：85μl无血清DMEM中加入15μl脂质体，混匀A，B液，补足1ml无血清DMEM，加入细胞单层上，培养18小时，传代，更换含200μg/ml潮霉素B，直至筛选出阳性克隆。混合所有阳性克隆，再扩增培养。
, 百拇医药
(三) 细胞免疫荧光方法 筛选后细胞玻片上生长、固定，PBS缓冲液与抗-HBe(患者血清)10∶1稀释后均匀滴于细胞玻片，放入湿盒，37°C，1小时；取出后用PBS振洗5次，共5分钟；0.01%伊文蓝液配制的PBS与FITC标记的第二抗体10∶1稀释后均匀滴于玻片；放入湿盒，37°C，1小时；PBS振洗5次，共5分钟；50%甘油缓冲液封片。
(四) 激光共聚焦显微镜观察、照相 共聚焦系统由BIO-RAD公司提供的软件控制、Pentium90计算机运行，用488激发FITC，步进马达控制显微镜聚焦旋钮，图像采集的物镜镜头为PIANNEOFLUAR 40×油浸镜，数值孔径(NA)为1.3，图像存贮为512×512象素类型，扫描激光值3%～10%。
(五) 荧光染色结果判定 选1象素(pixel)宽的线垂直穿过细胞，所选细胞的宽度为X轴，相应Y轴为其象素线荧光强度；同时在同等宽度下计算平均荧光强度。
, 百拇医药
(六) 胞质裂解液的制备 筛选阳性细胞，扩增后用冰浴的PBS缓冲液洗3次，加入1ml含10mmol/L EDTA的PBS缓冲液消化细胞，加入1～10ml PBS悬浮细胞计数，离心去除上清，悬浮细胞于0.25mmol/L Tris-HCl(pH7.5,106细胞/100μl)，上清即为胞质裂解液，用于测定HBeAg。
(七) HBeAg测定 用ELISA法检测胞质裂解液。A值在A450下读取，结果以阳性孔A值/阴性孔A值(P/N)表示，抑制率按下式计算：抑制率=(实验孔P/N值-对照孔P/N)/(对照孔P/N值-2.1)×100%。
结果
一、含针对HBV C区核酶真核表达载体的构建
经酶切、连接、转化后筛选出阳性克隆pBBS212-Rz，用EcoRⅠ、BamHⅠ及KpnⅠ,Hind Ⅲ两组酶切鉴定，可分别切出88bp及214bp片段。用聚丙烯酰胺凝胶电泳可见一清晰条带，见图2。
, 百拇医药
1. KpnⅠ+HindⅢ酶切后214bp片断
2. pGEM-7Zf(+)/Hea Ⅲ Markers
3. BamH Ⅰ+EcoR Ⅰ酶切后88bp片断
图2 pBBS212-Rz重组质粒限制性内切酶酶切分析
二、激光共聚焦分析HBeAg的表达
由图3、4可以看出，共转染HHCC细胞，两组均可表达HBeAg，但两组表达量有明显差异，转染核酶细胞的荧光量明显低于空载组。核酶使HBeAg的表达明显下降。将两组细胞采用定量方法进行分析，未转染核酶组荧光量的象素密度为59.4±14.3，而转染核酶组像素密度为22.5±5.3。用公式计算抑制率=1-核酶组象素密度/未转核酶组象素密度，经计算，该核酶对HBeAg表达的抑制率达62%。
, 百拇医药
图3 pBBS212-Rz与pl.2Ⅱ共转染HHCC细胞(激光共聚焦)
图4 pBBS212与pl.2Ⅱ共转染HHCC细胞(激光共聚焦)
三、ELISA分析HBeAg的表达
将样本共分四组(含空载质粒与pl.2Ⅱ共转染组)，每组分取4份样本。由表1可以看出针对HBV C区双位点核酶对细胞内HBeAg的表达有明显抑制作用，最高达65%，最低50%。表1 针对HBV C区双位点核酶对HBeAg
表达的作用(P/N值，
) 样 本
, 百拇医药
P/N值
抑制率
pBBS212与pl.2Ⅱ共转染组
3.95±0.06
pBBS212-Rz与pl.2Ⅱ共转染组Ⅰ
2.84±0.11
60%
pBBS212-Rz与pl.2Ⅱ共转染组Ⅱ
3.12±0.10
50%
pBBS212-Rz与pl.2Ⅱ共转染组Ⅲ
, http://www.100md.com
2.75±0.25
65%
讨论 通过使用荧光素交联的特异性抗体可以测定细胞所表达的特异抗原。传统的方法因不同平面上的荧光干扰，尤其是爬片细胞造成组织结构不清，本底较高，同时无法进行定量研究。
共聚焦显微镜的优点是可以排除焦点以外的荧光干扰，使图像有更高的分辨率及清晰度，同时还可对荧光强度进行定量分析[4]。共聚焦法可以直接对细胞内的抗原原位进行测定，结果敏感性优于ELISA法。共聚焦显微镜定量研究表明，抗HBV C区双位点核酶可明显抑制HBeAg在细胞内的表达，经定量分析，其抑制率可达62%。
研究表明，典型的HBV复制过程包括病毒脱衣壳，核酸进入细胞内，经过补缺口形成双链DNA，在细胞的RNA多聚酶参与下转录成多拷贝的3.5kb mRNA，以此为模板，通过逆转录合成负链DNA。其逆转录过程是关键环节，在此环节通过核酶作用使RNA数量下降，可达到抑制病毒复制的目的。
, 百拇医药
Weizsaker等[5]使用三个联结型核酶，离体研究表明对HBV的转录物切割作用显著。Beck等[6]构建切割HBV中高度保守的顺式作用元件(包装信号)的锤头状核酶，离体切割有效，但在细胞内未能有效地抑制靶RNA水平。Welch等[7]则使用三个发夹状核酶，通过逆转录病毒载体导入Huh7细胞，与HBV共表达，结果使病毒颗粒下降66%～83%，国内也有类似报道[8，9]。
我们于1995年设计并构建了针对HBV C区的多位点核酶，体外切割达80%。进一步在细胞内应用，通过免疫荧光定量分析，对HBV中e蛋白的表达有明确的抑制作用，抑制率62%，说明核酶作为一种抗HBV的方法是可行的。
本课题受国家自然科学基金资助 (编号：39570652)
参考文献
, 百拇医药
1 Naseloff J, Getlach WL. Simple RNA enzymes with new and highly specific endoribonuclease activites. Nature, 1988, 344:585-591.
2 连建奇，周永兴，金由辛.抗HBV C区基因核酶自剪切转录转体的构建.第四军医大学学报，1997，8:376-377.
3 姜泊，张亚历，周殿元，主编.分子生物学常用实验方法.第1版.北京：人民军医出版社，1996.19-23.
4 王春梅，黄晓峰，李玉松，等.激光共聚焦显微镜在医学研究中的比较.第四军医大学学报，1997，18(专)：62-63.
5 Weizsacker FV, Blum HE, Wands JR. Cleavage of hepatitis B virus RNA by three ribozyme transcribed from a single DNA templete. Biochem Biophys Res Commun, 1992, 189:743-748.
, http://www.100md.com
6 Beck J, Nassal M. Effcient hammerhand ribozyme-mediated clea-vage of the structured hepatitis B virus encapsidetion signal in vitro and in cell extracts, but no in intact cells. Nucleic Acids Res, 1995, 23:4954-4962.
7 Welch PJ, Tritz R, Yei S, et al. Intracellullar appliction of hairpin ribozyme genes against hepatitis B virus. Gene Ther, 1997, 4:736-743.
8 王平，徐炜，曾力宇，等.核酶Ripc对HBV基因体外转录物的作用.病毒学报，1993，9：278-280.
9 竺来发，易荣大，陆长德，等.乙型肝炎病毒adr亚型核心抗原RNA片段的体外Ribozyme定点切割.生物化学与生物物理学报，1993，25：316-317.
(收稿：1998- 09-20 修回：1999-02-05), http://www.100md.com
单位：710038 西安，第四军医大学唐都传染病医院
关键词：核酶；肝炎病毒，乙型；显微镜检查，共焦
中华传染病杂志990303 【摘要】 目的 定量观察双位点核酶对细胞内HBV基因表达的抑制作用。方法 构建针对HBV C区双位点核酶的真核表达载体(pBBS212-Rz)，将该质粒与pl.2Ⅱ(含HBV全序列)，共转染人肝细胞癌(HHCC)细胞株，对转染细胞所表达HBeAg进行间接免疫荧光染色，用共聚焦显微镜对其含量进行定量分析。结果 共转染细胞可以表达HBeAg，同对照组相比，核酶组荧光量明显下降。结论 在核酶与HBV共转染细胞中，核酶通过对HBV mRNA的剪切作用，使HBeAg的表达量明显受到抑制。
Preliminary study on the inhibition of HBeAg expression in cells by ribozyme
, http://www.100md.com
LI Jinge, ZHOU Yong-xing, LIAN Jianqi, et al.
Tangdu Infectious Diseases Hospital, The Fourth Military Medical University, Xian 710038
【Abstract】 Objective To study the inhibition of HBeAg expression in cells by two-unit ribozyme.Methods Plasmid pBBS212-R2,a eukaryotic expression vector with a twounit ribozyme against hepatitis B virus, was constructed and cotransfected with p1.2 Ⅱ plasmid (carring genome of adr-subtype HBV) in to the HHCC cell (Human Hepatocelluar Carcinoma cell line). Immunoflurescence tests were applied to detecte the cotransfected cells, and data was analysed with confocal microscope quantitively. Results The cotransfected cells expressed HBeAg, while the quantity of fluorecein was reduced significantly in comparison with control cells.Conclusion Ribozyme can inhibit the expression of HBeAg in the cotransfected cells by cleaving the mRNA of HBV.
, 百拇医药
【Key words】 Ribozyme Hepatitis B virus Microscopy, Confocal
核酶(Ribozyme)作为一种新型的抗病毒方法，成为基因治疗中一项重要手段[1]。由于核酶可序列特异地与靶RNA配对，切割而使其失去生物功能。因此作为抗病毒、抗肿瘤的一种新的技术，已经用于实验研究。我们采用针对HBV C区双位点核酶真核表达载体，与HBV共转染人肝细胞癌(HHCC)细胞株，用共聚焦显微镜对HHCC细胞内表达的HBeAg进行定量分析。
材料与方法
一、实验材料
(一) pBBS212真核表达载体 由河南医科大学郭建成博士提供，pGEM Rz123(含针对HBV C区双位点核酶)质粒由本室连建奇博士构建。核苷酸序列见图1[2]。
, 百拇医药
图1 核酶及靶mRNA的核苷酸序列
(二) 试剂 脂质体(Lipofectamine)、DMEM Gibco公司产品，潮霉素B(Hygromycin B) Sigma公司产品，T4DNA连接酶Promaga公司产品，各种工具酶购自华美公司，HHCC细胞本室保存。HBeAg ELISA检测试剂盒，系科华公司产品。
二、实验方法
(一) 含针对HBV C区核酶的真核表达质粒的构建 pGEM Rz123及pBBS212均用EcoRⅠ及BamHⅠ进行双酶切，分别回收88bp及10 535bp片段，用双粘法进行连接[3]，连接产物转化JM109菌。挑取克隆，用EcoRⅠ及BamHⅠ,KpnⅠ及Hind Ⅲ对筛选重组体进行酶切鉴定，用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(二) 含核酶真核表达载体pBBS212-Rz转染HHCC细胞 在6孔板中培养至60%～80%密度。准备A液：100μl无血清DMEM中含5μg pBBS212与5μg pl.2Ⅱ或5μg pBBS212-Rz与pl.2Ⅱ。准备B液：85μl无血清DMEM中加入15μl脂质体，混匀A，B液，补足1ml无血清DMEM，加入细胞单层上，培养18小时，传代，更换含200μg/ml潮霉素B，直至筛选出阳性克隆。混合所有阳性克隆，再扩增培养。
, 百拇医药
(三) 细胞免疫荧光方法 筛选后细胞玻片上生长、固定，PBS缓冲液与抗-HBe(患者血清)10∶1稀释后均匀滴于细胞玻片，放入湿盒，37°C，1小时；取出后用PBS振洗5次，共5分钟；0.01%伊文蓝液配制的PBS与FITC标记的第二抗体10∶1稀释后均匀滴于玻片；放入湿盒，37°C，1小时；PBS振洗5次，共5分钟；50%甘油缓冲液封片。
(四) 激光共聚焦显微镜观察、照相 共聚焦系统由BIO-RAD公司提供的软件控制、Pentium90计算机运行，用488激发FITC，步进马达控制显微镜聚焦旋钮，图像采集的物镜镜头为PIANNEOFLUAR 40×油浸镜，数值孔径(NA)为1.3，图像存贮为512×512象素类型，扫描激光值3%～10%。
(五) 荧光染色结果判定 选1象素(pixel)宽的线垂直穿过细胞，所选细胞的宽度为X轴，相应Y轴为其象素线荧光强度；同时在同等宽度下计算平均荧光强度。
, 百拇医药
(六) 胞质裂解液的制备 筛选阳性细胞，扩增后用冰浴的PBS缓冲液洗3次，加入1ml含10mmol/L EDTA的PBS缓冲液消化细胞，加入1～10ml PBS悬浮细胞计数，离心去除上清，悬浮细胞于0.25mmol/L Tris-HCl(pH7.5,106细胞/100μl)，上清即为胞质裂解液，用于测定HBeAg。
(七) HBeAg测定 用ELISA法检测胞质裂解液。A值在A450下读取，结果以阳性孔A值/阴性孔A值(P/N)表示，抑制率按下式计算：抑制率=(实验孔P/N值-对照孔P/N)/(对照孔P/N值-2.1)×100%。
结果
一、含针对HBV C区核酶真核表达载体的构建
经酶切、连接、转化后筛选出阳性克隆pBBS212-Rz，用EcoRⅠ、BamHⅠ及KpnⅠ,Hind Ⅲ两组酶切鉴定，可分别切出88bp及214bp片段。用聚丙烯酰胺凝胶电泳可见一清晰条带，见图2。
, 百拇医药
1. KpnⅠ+HindⅢ酶切后214bp片断
2. pGEM-7Zf(+)/Hea Ⅲ Markers
3. BamH Ⅰ+EcoR Ⅰ酶切后88bp片断
图2 pBBS212-Rz重组质粒限制性内切酶酶切分析
二、激光共聚焦分析HBeAg的表达
由图3、4可以看出，共转染HHCC细胞，两组均可表达HBeAg，但两组表达量有明显差异，转染核酶细胞的荧光量明显低于空载组。核酶使HBeAg的表达明显下降。将两组细胞采用定量方法进行分析，未转染核酶组荧光量的象素密度为59.4±14.3，而转染核酶组像素密度为22.5±5.3。用公式计算抑制率=1-核酶组象素密度/未转核酶组象素密度，经计算，该核酶对HBeAg表达的抑制率达62%。
, 百拇医药
图3 pBBS212-Rz与pl.2Ⅱ共转染HHCC细胞(激光共聚焦)
图4 pBBS212与pl.2Ⅱ共转染HHCC细胞(激光共聚焦)
三、ELISA分析HBeAg的表达
将样本共分四组(含空载质粒与pl.2Ⅱ共转染组)，每组分取4份样本。由表1可以看出针对HBV C区双位点核酶对细胞内HBeAg的表达有明显抑制作用，最高达65%，最低50%。表1 针对HBV C区双位点核酶对HBeAg
表达的作用(P/N值，
) 样 本, 百拇医药
P/N值
抑制率
pBBS212与pl.2Ⅱ共转染组
3.95±0.06
pBBS212-Rz与pl.2Ⅱ共转染组Ⅰ
2.84±0.11
60%
pBBS212-Rz与pl.2Ⅱ共转染组Ⅱ
3.12±0.10
50%
pBBS212-Rz与pl.2Ⅱ共转染组Ⅲ
, http://www.100md.com
2.75±0.25
65%
讨论 通过使用荧光素交联的特异性抗体可以测定细胞所表达的特异抗原。传统的方法因不同平面上的荧光干扰，尤其是爬片细胞造成组织结构不清，本底较高，同时无法进行定量研究。
共聚焦显微镜的优点是可以排除焦点以外的荧光干扰，使图像有更高的分辨率及清晰度，同时还可对荧光强度进行定量分析[4]。共聚焦法可以直接对细胞内的抗原原位进行测定，结果敏感性优于ELISA法。共聚焦显微镜定量研究表明，抗HBV C区双位点核酶可明显抑制HBeAg在细胞内的表达，经定量分析，其抑制率可达62%。
研究表明，典型的HBV复制过程包括病毒脱衣壳，核酸进入细胞内，经过补缺口形成双链DNA，在细胞的RNA多聚酶参与下转录成多拷贝的3.5kb mRNA，以此为模板，通过逆转录合成负链DNA。其逆转录过程是关键环节，在此环节通过核酶作用使RNA数量下降，可达到抑制病毒复制的目的。
, 百拇医药
Weizsaker等[5]使用三个联结型核酶，离体研究表明对HBV的转录物切割作用显著。Beck等[6]构建切割HBV中高度保守的顺式作用元件(包装信号)的锤头状核酶，离体切割有效，但在细胞内未能有效地抑制靶RNA水平。Welch等[7]则使用三个发夹状核酶，通过逆转录病毒载体导入Huh7细胞，与HBV共表达，结果使病毒颗粒下降66%～83%，国内也有类似报道[8，9]。
我们于1995年设计并构建了针对HBV C区的多位点核酶，体外切割达80%。进一步在细胞内应用，通过免疫荧光定量分析，对HBV中e蛋白的表达有明确的抑制作用，抑制率62%，说明核酶作为一种抗HBV的方法是可行的。
本课题受国家自然科学基金资助 (编号：39570652)
参考文献
, 百拇医药
1 Naseloff J, Getlach WL. Simple RNA enzymes with new and highly specific endoribonuclease activites. Nature, 1988, 344:585-591.
2 连建奇，周永兴，金由辛.抗HBV C区基因核酶自剪切转录转体的构建.第四军医大学学报，1997，8:376-377.
3 姜泊，张亚历，周殿元，主编.分子生物学常用实验方法.第1版.北京：人民军医出版社，1996.19-23.
4 王春梅，黄晓峰，李玉松，等.激光共聚焦显微镜在医学研究中的比较.第四军医大学学报，1997，18(专)：62-63.
5 Weizsacker FV, Blum HE, Wands JR. Cleavage of hepatitis B virus RNA by three ribozyme transcribed from a single DNA templete. Biochem Biophys Res Commun, 1992, 189:743-748.
, http://www.100md.com
6 Beck J, Nassal M. Effcient hammerhand ribozyme-mediated clea-vage of the structured hepatitis B virus encapsidetion signal in vitro and in cell extracts, but no in intact cells. Nucleic Acids Res, 1995, 23:4954-4962.
7 Welch PJ, Tritz R, Yei S, et al. Intracellullar appliction of hairpin ribozyme genes against hepatitis B virus. Gene Ther, 1997, 4:736-743.
8 王平，徐炜，曾力宇，等.核酶Ripc对HBV基因体外转录物的作用.病毒学报，1993，9：278-280.
9 竺来发，易荣大，陆长德，等.乙型肝炎病毒adr亚型核心抗原RNA片段的体外Ribozyme定点切割.生物化学与生物物理学报，1993，25：316-317.
(收稿：1998- 09-20 修回：1999-02-05), http://www.100md.com