单克隆抗体对茸毛链球菌主要表面蛋白的免疫定位观察
作者：张 平 樊明文 边 专 杜民权 金妮莉
单位：武汉市(430079)湖北医科大学口腔医学院
关键词：单克隆抗体；表面蛋白抗原；茸毛链球菌
口腔医学纵横990302 摘要 目的：研究所制备的单抗与其相应的非变性抗原PAg的反应，并直观显示PAg在茸毛链球菌原位的分布。方法：采用间接免疫金标技术，通过透射电镜观察，并设置多抗以及变形链球菌和鼠链球菌作为对照。结果：抗PAg的单抗可与茸毛链球菌发生反应，与变形链球菌反应不明确，与鼠链球菌不发生反应。结论：所制备的单抗能与PAg特异性结合，PAg可能与茸毛链球菌表面茸毛层相关。
中图分类号 R781.1
Location of the major cell surface protein antigen of streptococcus sobrinus with monoclonal antibody
, 百拇医药
by immunogold electron microscope.
Zhang Ping , Fan Mingwen , Bian Zhuan , et al. College of Stomatology , Hubei Medical University , Wuhan 430079
Abstract Objective：To determine the accessibility of the monoclonal antibody (McAb) to the surface of native protein on S.sobrinus 6715. Methods：The reactions of McAb or PcAbs against the major cell surface protein antigen of streptococcus sobrinus (PAg) with S.sobrinus 6715, S.mutans Ingbritt C, S.rattus BHT were investigated by an indirect immunogold labelling technique. Results and Conclusion：The collidal gold particles appeared to be localized on the surface of S.sobrinus cells, and these revealed an association between the fuzzy coat on the surface of S.sobrinus and PAg.
, 百拇医药
Key words Monoclonal antibody Streptococcus sobrinus the major cell surface protein antigen
在口腔链球菌及变形链球菌组细菌表面均存在主要表面蛋白或其类似物，迄今为止，已从变形链球菌组血清型a、c、d、e、f、g菌株中分离。基因序列分析表明不同菌种间的主要表面蛋白具有同源性，它们可能在细菌对牙面的粘附及细菌间的聚集过程中发挥作用[1,2]。
为了进一步研究变形链球菌组细胞主要表面蛋白抗原的结构和功能，制备了抗茸毛链球菌6715(S.sobrinus，血清g型)主要表面蛋白(PAg)的单克隆 抗体(简称单抗)，通过免疫电镜技术用金标颗粒直观显示单抗与原位PAg的反应，以对PAg进行超微定位。同时设置了抗PAg多克隆抗体(简称多抗)、抗茸毛链球菌6715全细胞多抗以及变形链球菌Ingbritt C (S.mutans, 血清C型)、鼠链球菌BHT(S.rattus，血清b型)作对照。
, 百拇医药
材料和方法
1. 细菌：茸毛链球菌6715国际标准株，变形链球菌Ingbritt C，由湖北医科大学口腔医学院实验中心提供；鼠链球菌BHT，由北京药品生物制品检定所提供。
2. 培养基：轻唾琼脂培养基(MSA, DEFCO)，牛心脑浸液培养基(BHI, GIBCO)。
3. 抗体：①抗PAg单抗：采用经典的单抗制备法，即将茸毛链球菌6715活细胞免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0-AG14融合，ELISA筛选，有限稀释法克隆化，得到稳定分泌抗PAg的杂交瘤细胞株ZS2/286, 所致小鼠腹水单抗用辛酸—硫酸铵沉淀法纯化。经免疫双扩鉴定为IgG1亚类单抗，Western-blotting 显示其在PAg相应位置呈单一条带。②兔抗PAg抗血清由Dr. Toshihiko Koga(Kyushu University, Japan)惠赠。③兔抗茸毛链球菌6715全细胞抗血清：将灭活6715经兔耳静脉注射，每周2～3次，共5周。末次注射8d后采血，免疫双扩鉴定其特异性。④10nm胶体金标记羊抗小鼠IgG，10nm胶体金标记羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程公司)。
, 百拇医药
4. 免疫电镜：分别接种各菌株于MSA平皿，培养48h后挑典型单菌落于BHI中培养18h，菌液离心，沉淀细胞用PBS洗涤并悬浮。取20μl菌液加于Formvar包被的镍网上，室温孵育10min并干燥。3%BSA/PBS封闭60min。洗涤后加一抗孵育60min，阴性对照为小鼠非特异性腹水。洗涤后分别加二抗孵育60min。充分洗涤，4℃过夜干燥，2%磷钨酸染色2min, TEM(Hitachi H-600型)观察。 结 果
1. 抗6715全细胞多抗与各菌株的作用： 由图1, 2, 3可见， 抗茸毛链球菌6715全细胞多抗与6715、变形链球菌Ingbritt C和鼠链球菌BHT均有不同程度的反应。
2. 抗PAg多抗与各菌株的作用：由图4, 5, 6可见，抗PAg多抗除可与茸毛链球菌6715发生明显反应外，与变形链球菌Ingbritt C也存在明显交叉反应。但未见抗PAg多抗与鼠链球菌BHT发生反应。
, 百拇医药
3. 抗PAg单抗与各菌株的作用：抗PAg单抗ZS2/286可与6715发生反应，且金标颗粒均位于完整的细胞外层表面，但与多抗相比，结合的金标颗粒较少(图7)。Ingbritt C与抗PAg单抗反应不明确或较微弱(图8)。BHT与抗PAg单抗不发生反应(图9)。
4. 6715阴性对照细胞表面未见金标颗粒存在(图10)。
图1 抗6715全细胞多抗+S.sobrinus 6715
图2 抗6715全细胞多抗+S.mutans Ingbritt C
, http://www.100md.com
图3 抗6715全细胞多抗+S.rattus BHT
图4 抗PAg多抗+S.sobrinus 6715
图5 抗PAg多抗+S.mutans Ingbritt C
图6 抗PAg多抗+S.rattus BHT
图7 单抗ZS2/286+S.sobrinus 6715
, 百拇医药
图8 单抗ZS2/286+S.mutans Ingbritt C
图9 单抗ZS2/286+S.rattus BHT
图10 S.sobrinus 6715阴性对照
讨 论
茸毛链球菌(血清型d,g型)因其较强的产酸性、耐酸性及致龋潜力，是除c型变形链球菌外受以关注的另一重要致龋菌。主要表面蛋白抗原SAI/II，又称P1,AgB,PAc,PAg等在除血清b型即鼠链球菌(S.rattus)外的变形链球菌组中广泛分布，动物实验证实，SAI/II有较强的免疫原性，能有效地减少实验性龋齿的发生。
, 百拇医药
鉴于鼠链球菌细胞壁表面无SAI/II存在[3,4]，本研究选择其为参考菌株。首先，用抗6715全细胞多抗分别与茸毛链球菌6715、变形链球菌Ingbritt C和鼠链球菌BHT三菌株作用，均显示不同程度的反应，表明三菌株之间存在有交叉反应性抗原。尽管多数研究显示鼠链球菌细胞壁表面不存在SAI/II，但其葡糖基转移酶和抗原A等与变形链球菌的相关抗原仍存在交叉反应性[5]。用抗PAg的多抗与三菌株作用显示，其与茸毛链球6715明显反应，与变形链球菌IngbrittC也有较明显反应(图4, 5)，证实了变形链球菌主要表面蛋白PAc与PAg具有交叉反应性，即两者具有共同的抗原决定簇。有研究表明，茸毛链球菌主要表面蛋白PAg与变形链球菌主要表面蛋白抗原PAc在分子量大小和氨基酸组成等方面十分类似，具有共同的抗原决定簇，在与相关抗体作用时表现为交叉反应性。Berzofsdy等[6]从分子水平将抗原的交叉反应性分为两大类：第一类是指抗原上的两个配体(即决定簇)均可与同一分子抗体的同一抗原结合部位结合，然而亲和力有所不同；另一类交叉反应性指的是抗原决定簇分别与抗体中的不同抗体分子起反应而表现出的交叉反应性，这一类交叉反应性多见于抗体为不均一的条件下，即见于多抗。目前有研究推测，氨基酸序列AKA-YEA和YEA-L-QY可能是PAc与PAg的发生交叉反应的决定簇[7]。本实验未发现抗PAg多抗与鼠链球菌BHT发生反应(图6)，这与多数学者的报告一致[3,4]。
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单抗是针对单一抗原决定簇的具有高度特异性的均质抗体，可克服常规抗血清即多抗的非特异性交叉反应，但单抗的特异性并不能排除由于识别类似抗原或不同抗原上相同决定簇所造成的交叉反应[8]。本研究用所制备的单抗ZS2/286与三菌株作用显示，其可与茸毛链球菌6715发生反应(图7)，与变形链球菌Ingbritt C反应不明确(图8)，推测存在所制备的单抗可识别PAc上的PAg的共同或类似的抗原决定簇的可能性。但与抗PAg多抗相比，单抗作用于细菌上的金标颗粒明显不及多抗，这可能与单抗的识别单一抗原决定簇的特性有关。抗PAg的单抗仍与鼠链球菌BHT无反应(图9)，进一步证实了由多抗作用所获结论。
关于主要表面蛋白抗原在变形链球菌组细菌上的分布位置，研究显示各血清型的分布具有特征性。本实验显示，无论是用抗PAg的单抗还是多抗，胶体金颗粒均分布于细菌表面，这一结果证实了主要表面蛋白是细菌细胞壁的组成成份，均匀分布于整个细胞壁表面。所不同的是，在变形链球菌胶体金颗粒呈单层分布，而在茸毛链球菌，胶体金颗粒呈多层分布，并显示标记的金颗粒与细菌细胞表面的茸毛层(fuzzy coat layer)联系紧密，提示了茸毛层与表面蛋白抗原的相关性，即这种抗原可能是细菌表面茸毛层的组成部分。参考文献
, 百拇医药
1 Moisset A, Schatz N, Lepoivre Y, et al. Conservation of salivary glycoprotein-interacting and human immunoglobulin G-cross-reactive domains of antigen I/II in oral streptococci. Infect Immun, 1994, 62:184～193
2 Loeshe WJ. Role of Streptococcus mutans in human dental decay. Microbiol Rev. 1986; 50:353～380
3 樊明文，边专，杜民权等. 抗原I/II在变形链球菌组细胞表面分布的观察. 中华口腔医学杂志，1996；31(6)：323～325
4 Russell MW, Bergmeier LA, Ianders ED, et al. Protein antigens of streptococcus mutans: purification and properties of a double antigen and its proteaseresistan component. Infect Immun, 1980; 30:486～493
, http://www.100md.com
5 Russell RRB. Distribution of cross-reactive antigens A and B in streptococcus mutans and other oral streptococci. J Gen Microbiol, 1980;11(8):383～388
6 Berzefsky JA, Schechter AN. The concept of cross reactivity and specificity in immunology. Mol Immunol, 1981;18:751
7 Okahashi N, Takahashi T, Nakai M, et al. Identification of antigenic epitopes in an alanine-rich repeating region of a surface protein antigen of streptococcus mutans. Infect Immun, 1993;61(4):1301～1306
8 张平，樊明文. 茸毛链球菌单克隆抗体的研究进展. 口腔医学纵横杂志，1996；12(4)：246～248
[收稿：1999-02-25], 百拇医药
单位：武汉市(430079)湖北医科大学口腔医学院
关键词：单克隆抗体；表面蛋白抗原；茸毛链球菌
口腔医学纵横990302 摘要 目的：研究所制备的单抗与其相应的非变性抗原PAg的反应，并直观显示PAg在茸毛链球菌原位的分布。方法：采用间接免疫金标技术，通过透射电镜观察，并设置多抗以及变形链球菌和鼠链球菌作为对照。结果：抗PAg的单抗可与茸毛链球菌发生反应，与变形链球菌反应不明确，与鼠链球菌不发生反应。结论：所制备的单抗能与PAg特异性结合，PAg可能与茸毛链球菌表面茸毛层相关。
中图分类号 R781.1
Location of the major cell surface protein antigen of streptococcus sobrinus with monoclonal antibody
, 百拇医药
by immunogold electron microscope.
Zhang Ping , Fan Mingwen , Bian Zhuan , et al. College of Stomatology , Hubei Medical University , Wuhan 430079
Abstract Objective：To determine the accessibility of the monoclonal antibody (McAb) to the surface of native protein on S.sobrinus 6715. Methods：The reactions of McAb or PcAbs against the major cell surface protein antigen of streptococcus sobrinus (PAg) with S.sobrinus 6715, S.mutans Ingbritt C, S.rattus BHT were investigated by an indirect immunogold labelling technique. Results and Conclusion：The collidal gold particles appeared to be localized on the surface of S.sobrinus cells, and these revealed an association between the fuzzy coat on the surface of S.sobrinus and PAg.
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Key words Monoclonal antibody Streptococcus sobrinus the major cell surface protein antigen
在口腔链球菌及变形链球菌组细菌表面均存在主要表面蛋白或其类似物，迄今为止，已从变形链球菌组血清型a、c、d、e、f、g菌株中分离。基因序列分析表明不同菌种间的主要表面蛋白具有同源性，它们可能在细菌对牙面的粘附及细菌间的聚集过程中发挥作用[1,2]。
为了进一步研究变形链球菌组细胞主要表面蛋白抗原的结构和功能，制备了抗茸毛链球菌6715(S.sobrinus，血清g型)主要表面蛋白(PAg)的单克隆 抗体(简称单抗)，通过免疫电镜技术用金标颗粒直观显示单抗与原位PAg的反应，以对PAg进行超微定位。同时设置了抗PAg多克隆抗体(简称多抗)、抗茸毛链球菌6715全细胞多抗以及变形链球菌Ingbritt C (S.mutans, 血清C型)、鼠链球菌BHT(S.rattus，血清b型)作对照。
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材料和方法
1. 细菌：茸毛链球菌6715国际标准株，变形链球菌Ingbritt C，由湖北医科大学口腔医学院实验中心提供；鼠链球菌BHT，由北京药品生物制品检定所提供。
2. 培养基：轻唾琼脂培养基(MSA, DEFCO)，牛心脑浸液培养基(BHI, GIBCO)。
3. 抗体：①抗PAg单抗：采用经典的单抗制备法，即将茸毛链球菌6715活细胞免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0-AG14融合，ELISA筛选，有限稀释法克隆化，得到稳定分泌抗PAg的杂交瘤细胞株ZS2/286, 所致小鼠腹水单抗用辛酸—硫酸铵沉淀法纯化。经免疫双扩鉴定为IgG1亚类单抗，Western-blotting 显示其在PAg相应位置呈单一条带。②兔抗PAg抗血清由Dr. Toshihiko Koga(Kyushu University, Japan)惠赠。③兔抗茸毛链球菌6715全细胞抗血清：将灭活6715经兔耳静脉注射，每周2～3次，共5周。末次注射8d后采血，免疫双扩鉴定其特异性。④10nm胶体金标记羊抗小鼠IgG，10nm胶体金标记羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程公司)。
, 百拇医药
4. 免疫电镜：分别接种各菌株于MSA平皿，培养48h后挑典型单菌落于BHI中培养18h，菌液离心，沉淀细胞用PBS洗涤并悬浮。取20μl菌液加于Formvar包被的镍网上，室温孵育10min并干燥。3%BSA/PBS封闭60min。洗涤后加一抗孵育60min，阴性对照为小鼠非特异性腹水。洗涤后分别加二抗孵育60min。充分洗涤，4℃过夜干燥，2%磷钨酸染色2min, TEM(Hitachi H-600型)观察。 结 果
1. 抗6715全细胞多抗与各菌株的作用： 由图1, 2, 3可见， 抗茸毛链球菌6715全细胞多抗与6715、变形链球菌Ingbritt C和鼠链球菌BHT均有不同程度的反应。
2. 抗PAg多抗与各菌株的作用：由图4, 5, 6可见，抗PAg多抗除可与茸毛链球菌6715发生明显反应外，与变形链球菌Ingbritt C也存在明显交叉反应。但未见抗PAg多抗与鼠链球菌BHT发生反应。
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3. 抗PAg单抗与各菌株的作用：抗PAg单抗ZS2/286可与6715发生反应，且金标颗粒均位于完整的细胞外层表面，但与多抗相比，结合的金标颗粒较少(图7)。Ingbritt C与抗PAg单抗反应不明确或较微弱(图8)。BHT与抗PAg单抗不发生反应(图9)。
4. 6715阴性对照细胞表面未见金标颗粒存在(图10)。
图1 抗6715全细胞多抗+S.sobrinus 6715
图2 抗6715全细胞多抗+S.mutans Ingbritt C
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图3 抗6715全细胞多抗+S.rattus BHT
图4 抗PAg多抗+S.sobrinus 6715
图5 抗PAg多抗+S.mutans Ingbritt C
图6 抗PAg多抗+S.rattus BHT
图7 单抗ZS2/286+S.sobrinus 6715
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图8 单抗ZS2/286+S.mutans Ingbritt C
图9 单抗ZS2/286+S.rattus BHT
图10 S.sobrinus 6715阴性对照
讨 论
茸毛链球菌(血清型d,g型)因其较强的产酸性、耐酸性及致龋潜力，是除c型变形链球菌外受以关注的另一重要致龋菌。主要表面蛋白抗原SAI/II，又称P1,AgB,PAc,PAg等在除血清b型即鼠链球菌(S.rattus)外的变形链球菌组中广泛分布，动物实验证实，SAI/II有较强的免疫原性，能有效地减少实验性龋齿的发生。
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鉴于鼠链球菌细胞壁表面无SAI/II存在[3,4]，本研究选择其为参考菌株。首先，用抗6715全细胞多抗分别与茸毛链球菌6715、变形链球菌Ingbritt C和鼠链球菌BHT三菌株作用，均显示不同程度的反应，表明三菌株之间存在有交叉反应性抗原。尽管多数研究显示鼠链球菌细胞壁表面不存在SAI/II，但其葡糖基转移酶和抗原A等与变形链球菌的相关抗原仍存在交叉反应性[5]。用抗PAg的多抗与三菌株作用显示，其与茸毛链球6715明显反应，与变形链球菌IngbrittC也有较明显反应(图4, 5)，证实了变形链球菌主要表面蛋白PAc与PAg具有交叉反应性，即两者具有共同的抗原决定簇。有研究表明，茸毛链球菌主要表面蛋白PAg与变形链球菌主要表面蛋白抗原PAc在分子量大小和氨基酸组成等方面十分类似，具有共同的抗原决定簇，在与相关抗体作用时表现为交叉反应性。Berzofsdy等[6]从分子水平将抗原的交叉反应性分为两大类：第一类是指抗原上的两个配体(即决定簇)均可与同一分子抗体的同一抗原结合部位结合，然而亲和力有所不同；另一类交叉反应性指的是抗原决定簇分别与抗体中的不同抗体分子起反应而表现出的交叉反应性，这一类交叉反应性多见于抗体为不均一的条件下，即见于多抗。目前有研究推测，氨基酸序列AKA-YEA和YEA-L-QY可能是PAc与PAg的发生交叉反应的决定簇[7]。本实验未发现抗PAg多抗与鼠链球菌BHT发生反应(图6)，这与多数学者的报告一致[3,4]。
, http://www.100md.com
单抗是针对单一抗原决定簇的具有高度特异性的均质抗体，可克服常规抗血清即多抗的非特异性交叉反应，但单抗的特异性并不能排除由于识别类似抗原或不同抗原上相同决定簇所造成的交叉反应[8]。本研究用所制备的单抗ZS2/286与三菌株作用显示，其可与茸毛链球菌6715发生反应(图7)，与变形链球菌Ingbritt C反应不明确(图8)，推测存在所制备的单抗可识别PAc上的PAg的共同或类似的抗原决定簇的可能性。但与抗PAg多抗相比，单抗作用于细菌上的金标颗粒明显不及多抗，这可能与单抗的识别单一抗原决定簇的特性有关。抗PAg的单抗仍与鼠链球菌BHT无反应(图9)，进一步证实了由多抗作用所获结论。
关于主要表面蛋白抗原在变形链球菌组细菌上的分布位置，研究显示各血清型的分布具有特征性。本实验显示，无论是用抗PAg的单抗还是多抗，胶体金颗粒均分布于细菌表面，这一结果证实了主要表面蛋白是细菌细胞壁的组成成份，均匀分布于整个细胞壁表面。所不同的是，在变形链球菌胶体金颗粒呈单层分布，而在茸毛链球菌，胶体金颗粒呈多层分布，并显示标记的金颗粒与细菌细胞表面的茸毛层(fuzzy coat layer)联系紧密，提示了茸毛层与表面蛋白抗原的相关性，即这种抗原可能是细菌表面茸毛层的组成部分。参考文献
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1 Moisset A, Schatz N, Lepoivre Y, et al. Conservation of salivary glycoprotein-interacting and human immunoglobulin G-cross-reactive domains of antigen I/II in oral streptococci. Infect Immun, 1994, 62:184～193
2 Loeshe WJ. Role of Streptococcus mutans in human dental decay. Microbiol Rev. 1986; 50:353～380
3 樊明文，边专，杜民权等. 抗原I/II在变形链球菌组细胞表面分布的观察. 中华口腔医学杂志，1996；31(6)：323～325
4 Russell MW, Bergmeier LA, Ianders ED, et al. Protein antigens of streptococcus mutans: purification and properties of a double antigen and its proteaseresistan component. Infect Immun, 1980; 30:486～493
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5 Russell RRB. Distribution of cross-reactive antigens A and B in streptococcus mutans and other oral streptococci. J Gen Microbiol, 1980;11(8):383～388
6 Berzefsky JA, Schechter AN. The concept of cross reactivity and specificity in immunology. Mol Immunol, 1981;18:751
7 Okahashi N, Takahashi T, Nakai M, et al. Identification of antigenic epitopes in an alanine-rich repeating region of a surface protein antigen of streptococcus mutans. Infect Immun, 1993;61(4):1301～1306
8 张平，樊明文. 茸毛链球菌单克隆抗体的研究进展. 口腔医学纵横杂志，1996；12(4)：246～248
[收稿：1999-02-25], 百拇医药