野生型p53基因的导入对膀胱癌细胞抑制作用的观察
作者：魏 东 黎 健 王建业 蒋 雷 夏永静 唐蔚青 李红霞 许 进 邵鸿勋
单位：魏 东 王建业 许 进 邵鸿勋(北京医院(北京 100730)泌尿外科)；黎 健 蒋 雷 夏永静 唐蔚青 李红霞(老年生化室)
关键词：膀胱肿瘤；基因，p53；腺病毒载体；肿瘤细胞，培养的
肿瘤990307 目的 转染外源野生型p53基因对膀胱癌EJ细胞的抑制作用。方法 将含外源野生型p53基因的(ad-Wtp53)转染膀胱癌EJ细胞，观察生长曲线，细胞周期变化及裸鼠体内抑瘤试验。结果 转染了ad-Wtp53的EJ细胞在体外生长速率下降，在裸鼠体内致瘤性丧失，流式细胞仪显示，DNA合成前期或静止期的细胞比例增高。另外，ad-Wtp53直接注射到肿瘤组织内，可使外源野生型p53基因在肿瘤细胞内有效、稳定的表达，肿瘤表现为生长减缓，最后停止生长并有缩小。结论 腺病毒载体介导基因转染效率高，速度快，安全，是很有前途的体内基因治疗载体。
, 百拇医药
INHIBITION OF HUMAN URINARY BLADDER CANCER CELL
GROWTH BY TRANSFECTION OF WILD-TYPE p53 GENE
Wei Dong,Li Jian,Jiang Lei, et al.
Department of Urology,Beijing Hospital,Beijing 100730
Objective：Inhibition of human urinary bladder cancer cell by wild-type p53 gene was investigated.Methods：A replication-deficient adenovirus vector encoding a wild-type p53 (ad-Wtp53) was constructed.Results：The pretreatment of cultured human urinary bladder carcinoma cell line EJ with recombinant p53 adenovirus expressing wild-type p53 were able to suppress their growth in vitro and their tumorigenicity in nude mice.Introduction of wild-type p53 into EJresulted in increasing proportion of cells in the G0/G1 phase of the cell cycle as compared to untransfected cells.Furthermore,exogenous wild-type p53 can efficiently transfect into human bladder cancers formed in nude mice via direct intratumor injection as confirmed by immunohistochemical staining.The gene therapy of established human bladder xenograft cancers in nude mice by ad-Wtp53 resulted in regression of treated tumors.Conclusion：The results demonstrated the potential of adenovirusmediated p53 gene therapy for human urinary bladder cancer.
, 百拇医药
Key words Urinary bladder cancer p53 gene Adeno-virus Tumor cells,cultured
在膀胱癌中，抑癌基因p53变异率达50%以上[1]。试验证明[2～4]，将外源野生型p53基因(Wtp53)导入肿瘤细胞，可使其恶性表型逆转，这为抑癌基因治疗肿瘤提供了依据。有效的基因治疗依赖于外源基因高效、稳定地表达。腺病毒载体，作为基因介导载体，以其简便、高效、安全等特点日益受到瞩目[5]。本实验通过构建野生型p53基因腺病毒载体，研究它在体外和体内对人膀胱癌EJ细胞的抑制作用，为基因治疗膀胱癌提供依据。
材料和方法
一、野生型p53基因腺病毒载体的构建 用分子生物学技术将外源野生型p53基因(Wtp53)cDNA克隆到pXCJL-1载体上。用Lipofectin将该质粒载体与另一个载体pJM17共转染人肾293细胞，构建野生型p53基因腺病毒载体(ad-Wtp53)和标记基因LacZ腺病毒载体(ad-LacZ)，破碎细胞，收集含有病毒培养液，测定病毒的滴度为1012 pfu/ml。
, 百拇医药
二、EJ细胞培养及基因转染 EJ细胞购于北京医科大学泌尿外科研究所。含10%胎牛血清RPMI 1640培养基，37℃，5% CO2条件下培养，1∶6传代后3天，即有90%以上细胞汇合。将EJ细胞接种于放有2 cm ×2 cm载玻片的六孔板中，24 h后换液，并加入ad-Wtp53和ad-LacZ，24 h后再换液，继续培养2天，分别进行以下试验：
1.野生型p53基因蛋白表达 用免疫组化法检测Wtp53蛋白表达，检测用的抗体是抗p53单克隆抗体，光镜下观察，未转染EJ细胞做对照。
2.LacZ基因表达标记β-半乳糖苷酶(β-gal)的检测 用PBS洗1遍，再用含2%甲醛、0.2%戊二醛PBS固定，加含20 μg/ml x-gal的20 mmol K3 Fe(CN)6-K4 Fe(CN)6染液，37 ℃染色4 h，光镜下观察病毒的转染效率。
, 百拇医药
三、细胞生长曲线 以0.6×105(细胞)/ml接种于24孔板，1 ml/孔，24 h后换液，加入10 μl ad-Wtp53/孔，24 h后再换液，对照组EJ细胞和LacZ基因转染细胞做对照，每天细胞计数。
四、流式细胞仪检测细胞周期 分别收集经ad-Wtp53转染24 h、48 h、72 h的细胞，70%乙醇固定，PBS洗，加RNAse(10 mg/ml)10μl，37 ℃ 30 min,PI 染色30 min，流式细胞仪检测。
五、裸鼠体内抑瘤试验
实验1.先转染后成瘤观察 雌性5～6周BALB/c-nu裸鼠4只，将Wtp53转染细胞，LacZ转染细胞和EJ细胞，各0.2 ml细胞悬液(1×107)注射在裸鼠左上肢，左下肢和右上肢外侧皮下。每周测量肿瘤体积。
实验2.先成瘤后转染观察 雌性5～6周BALB/c-nu裸鼠8只，分别在左上肢和右上肢外侧皮下注射EJ细胞1×107(0.2 ml)，制成肿瘤模型。成瘤后第4周开始，将8只鼠随机分成两组，在第1组4只裸鼠左上肢外侧肿瘤内分别注射ad-Wtp53 0.1 ml(10 pfu)，右上肢肿瘤注射等量生理盐水作对照。同法用于第2组4只裸鼠左上肢肿瘤注射ad-LacZ，右上肢做对照，每周注射2次，每周测量肿瘤体积。第10周处死裸鼠，用免疫组化方法检测ad-Wtp53转染组Wtp53蛋白表达情况，非转染组做对照。
, 百拇医药
结果
一、免疫组化法检测Wtp53蛋白表达 对照组EJ细胞核着蓝色表示阴性，而Wtp53转染组在病毒滴度为107 pfu时，有80%以上EJ细胞核着棕色表示阳性，说明有外源野生型p53基因蛋白表达。
二、腺病毒载体转染效率 ad-LacZ基因转染24 h后有100%的EJ细胞核着绿色，说明用腺病毒载体转染高效快速。
三、细胞生长曲线 体外标准培养条件下，Wtp53转染组细胞生长率明显低于对照组和LacZ转染组，统计学处理有非常显著性差异(P<0.001)(见图1)。
四、细胞周期分析 Wtp53转染组细胞DNA合成前期和静止期细胞比例为68%，而对照组为35%，两组有非常显著性差异(P<0.01)(见图2)。
五、裸鼠体内抑瘤试验
, 百拇医药
实验1：先转染后成瘤观察 对照组和LacZ转染组均有成瘤，两组肿瘤体积无显著性差异(P>0.05)，而Wtp53转染组一直未见成瘤(见表1)。但与对照组或Lac Z组比较没有统计学意义。
图1 细胞生长曲线
图2 细胞周期分析
表1 先转染后成瘤观察*
分组
测量瘤体体积时间(周)
P值
1
, 百拇医药
2
3
4
5
6
Wtp53组
0
0
0
0
0
0
LacZ组
0
, 百拇医药
0.010
0.033
0.144
0.449
1.360
>0.05**
对照组
0
0.008
0.048
0.161
0.523
1.514
, 百拇医药
*表内数值为肿瘤体积平均值(立方厘米)
**与对照组比较
实验2：先成瘤后转染观察 与对照组和LacZ转染组比较，Wtp53转染组肿瘤生长缓慢，约至6周时，肿瘤生长处于停止状态，以后有缩小趋势(见表2)。用免疫组化法检测Wtp53转染组肿瘤组织切片，肿瘤细胞核着棕色，而对照组呈阴性。说明通过肿瘤组织内直接注射的方法，可将外源Wtp53转染至肿瘤细胞内。
表2 先成瘤后转染观察*
分组
测量瘤体体积时间(周)
P值
3
4#
, http://www.100md.com
4.5
6
7
8
9
Wtp53组
0.011
0.128
0.164
0.523
0.414
0.414
0.321
, 百拇医药
<0.05**
LacZ组
0.011
0.099
0.293
0.555
1.949
1.949
3.052
>0.05***
对照组
0.014
0.128
, http://www.100md.com
0.351
1.022
1.288
1.679
2.571
*表内数值为肿瘤体积平均值(立方厘米) ＃注药时间 **与其它2组比较，***与对照组比较
讨论
细胞内存在的癌基因和抑癌基因对细胞生长发育和终末分化起着正负调节作用[6]。一些学者[2～4]利用基因转染法恢复和添加肿瘤细胞中失活或缺失的抑癌基因，对肿瘤产生了一定的抑制作用。Wtp53是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因[7]，其蛋白表达产物是细胞中G1/S期的调控点，当它出现缺失或异常时，则失去对细胞的监视作用，含有DNA损伤的细胞进入S期，使细胞遗传特性发生改变，造成基因突变，最终导致癌变。在本试验中，作者用腺病毒载体将Wtp53导入人膀胱癌EJ细胞，使EJ细胞在体外生长速率明显下降，在裸鼠体内致瘤性丧失，流式细胞仪测定，DNA合成前期和静止期细胞比例明显增高。由此推测，增加了肿瘤细胞内Wtp53蛋白表达水平具有一定的治疗作用，这为开展肿瘤的抑癌基因治疗提供了依据。本试验同时表明，用腺病毒载体介导基因转染细胞速度快，效率高。将ad-Wtp53直接注射到肿瘤组织内，可使外源Wtp53在肿瘤细胞内有效而稳定地表达，肿瘤表现为生长减缓，最后停止生长，并有缩小趋势。
, 百拇医药
根据膀胱的解剖特点，外国学者[8，9]已开展了经膀胱灌注，进行膀胱癌基因治疗的研究。Bernard[8]把含有标记基因LacZ的腺病毒载体注入小鼠膀胱内，2天后PCR检测发现膀胱标本中有DNA和mRNA表达，免疫组化法检测膀胱壁全层有标记基因蛋白产物的表达，基因表达可持续7天，没有发现病毒远处扩散的证据。膀胱肿瘤是泌尿外科的常见肿瘤，且术后易复发，上述基因治疗方法可望为膀胱肿瘤的治疗提供一条新途径。
第一作者简介 魏东，男，硕士，主治医生。
参 考 文 献
1 陈庆华，宋永胜，候云德，等.肿瘤免疫-基因治疗在泌尿系肿瘤中的应用.中华泌尿外科杂志，1995，16：499
2 李鸣，李万波，周爱儒，等.野生型p53基因导入对膀胱癌细胞生长抑制和H-ras基因表达控制.中华泌尿外科杂志，1995，16：259
, 百拇医药
3 Nilliams BI,Carter BS,Ewing CM, et al.Wild-type p53 suppresses growthof human prostate cancer cells containing mutant p53 alleles.Cancer Res,1991,51:4716
4 Baker SJ.Sanford M.Eric RF,et al.Suppression of human colo-rectalcarcinoma cell growth by wild-type p53.Science,1990,249:912
5 Taneja SS,Belldegrum A,Dekernion JB,et al.Adenoviral vector mediated high efficiency gene transfer in prostate cancer lines.J Urol,1994,151:253A
, http://www.100md.com
6 Lecine AJ,Momand J,Finlay A, et al. The p53 tumor suppressor gene.Nature,1991,351:453
7 Nigro JM,Suzann LJB,Antonette CB, et al. Mutations in the p53 gene occur in diverse human tumors type. Nature,1989,342:705
8 Bernard DM,Morris JR,Kenneth ED, et al. Adenoviral-mediated gene transfer to bladder in vivo.J Urol,1994,152:506
9 Sharon SL,Eisenlohr LC,McCue PA, et al.Intravesical gene therapy for bladder cancer:in vivo gene transfer using vaccinia vectors.J Urol,1994,151:518A
(收稿：1998-06-15), 百拇医药
单位：魏 东 王建业 许 进 邵鸿勋(北京医院(北京 100730)泌尿外科)；黎 健 蒋 雷 夏永静 唐蔚青 李红霞(老年生化室)
关键词：膀胱肿瘤；基因，p53；腺病毒载体；肿瘤细胞，培养的
肿瘤990307 目的 转染外源野生型p53基因对膀胱癌EJ细胞的抑制作用。方法 将含外源野生型p53基因的(ad-Wtp53)转染膀胱癌EJ细胞，观察生长曲线，细胞周期变化及裸鼠体内抑瘤试验。结果 转染了ad-Wtp53的EJ细胞在体外生长速率下降，在裸鼠体内致瘤性丧失，流式细胞仪显示，DNA合成前期或静止期的细胞比例增高。另外，ad-Wtp53直接注射到肿瘤组织内，可使外源野生型p53基因在肿瘤细胞内有效、稳定的表达，肿瘤表现为生长减缓，最后停止生长并有缩小。结论 腺病毒载体介导基因转染效率高，速度快，安全，是很有前途的体内基因治疗载体。
, 百拇医药
INHIBITION OF HUMAN URINARY BLADDER CANCER CELL
GROWTH BY TRANSFECTION OF WILD-TYPE p53 GENE
Wei Dong,Li Jian,Jiang Lei, et al.
Department of Urology,Beijing Hospital,Beijing 100730
Objective：Inhibition of human urinary bladder cancer cell by wild-type p53 gene was investigated.Methods：A replication-deficient adenovirus vector encoding a wild-type p53 (ad-Wtp53) was constructed.Results：The pretreatment of cultured human urinary bladder carcinoma cell line EJ with recombinant p53 adenovirus expressing wild-type p53 were able to suppress their growth in vitro and their tumorigenicity in nude mice.Introduction of wild-type p53 into EJresulted in increasing proportion of cells in the G0/G1 phase of the cell cycle as compared to untransfected cells.Furthermore,exogenous wild-type p53 can efficiently transfect into human bladder cancers formed in nude mice via direct intratumor injection as confirmed by immunohistochemical staining.The gene therapy of established human bladder xenograft cancers in nude mice by ad-Wtp53 resulted in regression of treated tumors.Conclusion：The results demonstrated the potential of adenovirusmediated p53 gene therapy for human urinary bladder cancer.
, 百拇医药
Key words Urinary bladder cancer p53 gene Adeno-virus Tumor cells,cultured
在膀胱癌中，抑癌基因p53变异率达50%以上[1]。试验证明[2～4]，将外源野生型p53基因(Wtp53)导入肿瘤细胞，可使其恶性表型逆转，这为抑癌基因治疗肿瘤提供了依据。有效的基因治疗依赖于外源基因高效、稳定地表达。腺病毒载体，作为基因介导载体，以其简便、高效、安全等特点日益受到瞩目[5]。本实验通过构建野生型p53基因腺病毒载体，研究它在体外和体内对人膀胱癌EJ细胞的抑制作用，为基因治疗膀胱癌提供依据。
材料和方法
一、野生型p53基因腺病毒载体的构建 用分子生物学技术将外源野生型p53基因(Wtp53)cDNA克隆到pXCJL-1载体上。用Lipofectin将该质粒载体与另一个载体pJM17共转染人肾293细胞，构建野生型p53基因腺病毒载体(ad-Wtp53)和标记基因LacZ腺病毒载体(ad-LacZ)，破碎细胞，收集含有病毒培养液，测定病毒的滴度为1012 pfu/ml。
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二、EJ细胞培养及基因转染 EJ细胞购于北京医科大学泌尿外科研究所。含10%胎牛血清RPMI 1640培养基，37℃，5% CO2条件下培养，1∶6传代后3天，即有90%以上细胞汇合。将EJ细胞接种于放有2 cm ×2 cm载玻片的六孔板中，24 h后换液，并加入ad-Wtp53和ad-LacZ，24 h后再换液，继续培养2天，分别进行以下试验：
1.野生型p53基因蛋白表达 用免疫组化法检测Wtp53蛋白表达，检测用的抗体是抗p53单克隆抗体，光镜下观察，未转染EJ细胞做对照。
2.LacZ基因表达标记β-半乳糖苷酶(β-gal)的检测 用PBS洗1遍，再用含2%甲醛、0.2%戊二醛PBS固定，加含20 μg/ml x-gal的20 mmol K3 Fe(CN)6-K4 Fe(CN)6染液，37 ℃染色4 h，光镜下观察病毒的转染效率。
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三、细胞生长曲线 以0.6×105(细胞)/ml接种于24孔板，1 ml/孔，24 h后换液，加入10 μl ad-Wtp53/孔，24 h后再换液，对照组EJ细胞和LacZ基因转染细胞做对照，每天细胞计数。
四、流式细胞仪检测细胞周期 分别收集经ad-Wtp53转染24 h、48 h、72 h的细胞，70%乙醇固定，PBS洗，加RNAse(10 mg/ml)10μl，37 ℃ 30 min,PI 染色30 min，流式细胞仪检测。
五、裸鼠体内抑瘤试验
实验1.先转染后成瘤观察 雌性5～6周BALB/c-nu裸鼠4只，将Wtp53转染细胞，LacZ转染细胞和EJ细胞，各0.2 ml细胞悬液(1×107)注射在裸鼠左上肢，左下肢和右上肢外侧皮下。每周测量肿瘤体积。
实验2.先成瘤后转染观察 雌性5～6周BALB/c-nu裸鼠8只，分别在左上肢和右上肢外侧皮下注射EJ细胞1×107(0.2 ml)，制成肿瘤模型。成瘤后第4周开始，将8只鼠随机分成两组，在第1组4只裸鼠左上肢外侧肿瘤内分别注射ad-Wtp53 0.1 ml(10 pfu)，右上肢肿瘤注射等量生理盐水作对照。同法用于第2组4只裸鼠左上肢肿瘤注射ad-LacZ，右上肢做对照，每周注射2次，每周测量肿瘤体积。第10周处死裸鼠，用免疫组化方法检测ad-Wtp53转染组Wtp53蛋白表达情况，非转染组做对照。
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结果
一、免疫组化法检测Wtp53蛋白表达 对照组EJ细胞核着蓝色表示阴性，而Wtp53转染组在病毒滴度为107 pfu时，有80%以上EJ细胞核着棕色表示阳性，说明有外源野生型p53基因蛋白表达。
二、腺病毒载体转染效率 ad-LacZ基因转染24 h后有100%的EJ细胞核着绿色，说明用腺病毒载体转染高效快速。
三、细胞生长曲线 体外标准培养条件下，Wtp53转染组细胞生长率明显低于对照组和LacZ转染组，统计学处理有非常显著性差异(P<0.001)(见图1)。
四、细胞周期分析 Wtp53转染组细胞DNA合成前期和静止期细胞比例为68%，而对照组为35%，两组有非常显著性差异(P<0.01)(见图2)。
五、裸鼠体内抑瘤试验
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实验1：先转染后成瘤观察 对照组和LacZ转染组均有成瘤，两组肿瘤体积无显著性差异(P>0.05)，而Wtp53转染组一直未见成瘤(见表1)。但与对照组或Lac Z组比较没有统计学意义。
图1 细胞生长曲线
图2 细胞周期分析
表1 先转染后成瘤观察*
分组
测量瘤体体积时间(周)
P值
1
, 百拇医药
2
3
4
5
6
Wtp53组
0
0
0
0
0
0
LacZ组
0
, 百拇医药
0.010
0.033
0.144
0.449
1.360
>0.05**
对照组
0
0.008
0.048
0.161
0.523
1.514
, 百拇医药
*表内数值为肿瘤体积平均值(立方厘米)
**与对照组比较
实验2：先成瘤后转染观察 与对照组和LacZ转染组比较，Wtp53转染组肿瘤生长缓慢，约至6周时，肿瘤生长处于停止状态，以后有缩小趋势(见表2)。用免疫组化法检测Wtp53转染组肿瘤组织切片，肿瘤细胞核着棕色，而对照组呈阴性。说明通过肿瘤组织内直接注射的方法，可将外源Wtp53转染至肿瘤细胞内。
表2 先成瘤后转染观察*
分组
测量瘤体体积时间(周)
P值
3
4#
, http://www.100md.com
4.5
6
7
8
9
Wtp53组
0.011
0.128
0.164
0.523
0.414
0.414
0.321
, 百拇医药
<0.05**
LacZ组
0.011
0.099
0.293
0.555
1.949
1.949
3.052
>0.05***
对照组
0.014
0.128
, http://www.100md.com
0.351
1.022
1.288
1.679
2.571
*表内数值为肿瘤体积平均值(立方厘米) ＃注药时间 **与其它2组比较，***与对照组比较
讨论
细胞内存在的癌基因和抑癌基因对细胞生长发育和终末分化起着正负调节作用[6]。一些学者[2～4]利用基因转染法恢复和添加肿瘤细胞中失活或缺失的抑癌基因，对肿瘤产生了一定的抑制作用。Wtp53是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因[7]，其蛋白表达产物是细胞中G1/S期的调控点，当它出现缺失或异常时，则失去对细胞的监视作用，含有DNA损伤的细胞进入S期，使细胞遗传特性发生改变，造成基因突变，最终导致癌变。在本试验中，作者用腺病毒载体将Wtp53导入人膀胱癌EJ细胞，使EJ细胞在体外生长速率明显下降，在裸鼠体内致瘤性丧失，流式细胞仪测定，DNA合成前期和静止期细胞比例明显增高。由此推测，增加了肿瘤细胞内Wtp53蛋白表达水平具有一定的治疗作用，这为开展肿瘤的抑癌基因治疗提供了依据。本试验同时表明，用腺病毒载体介导基因转染细胞速度快，效率高。将ad-Wtp53直接注射到肿瘤组织内，可使外源Wtp53在肿瘤细胞内有效而稳定地表达，肿瘤表现为生长减缓，最后停止生长，并有缩小趋势。
, 百拇医药
根据膀胱的解剖特点，外国学者[8，9]已开展了经膀胱灌注，进行膀胱癌基因治疗的研究。Bernard[8]把含有标记基因LacZ的腺病毒载体注入小鼠膀胱内，2天后PCR检测发现膀胱标本中有DNA和mRNA表达，免疫组化法检测膀胱壁全层有标记基因蛋白产物的表达，基因表达可持续7天，没有发现病毒远处扩散的证据。膀胱肿瘤是泌尿外科的常见肿瘤，且术后易复发，上述基因治疗方法可望为膀胱肿瘤的治疗提供一条新途径。
第一作者简介 魏东，男，硕士，主治医生。
参 考 文 献
1 陈庆华，宋永胜，候云德，等.肿瘤免疫-基因治疗在泌尿系肿瘤中的应用.中华泌尿外科杂志，1995，16：499
2 李鸣，李万波，周爱儒，等.野生型p53基因导入对膀胱癌细胞生长抑制和H-ras基因表达控制.中华泌尿外科杂志，1995，16：259
, 百拇医药
3 Nilliams BI,Carter BS,Ewing CM, et al.Wild-type p53 suppresses growthof human prostate cancer cells containing mutant p53 alleles.Cancer Res,1991,51:4716
4 Baker SJ.Sanford M.Eric RF,et al.Suppression of human colo-rectalcarcinoma cell growth by wild-type p53.Science,1990,249:912
5 Taneja SS,Belldegrum A,Dekernion JB,et al.Adenoviral vector mediated high efficiency gene transfer in prostate cancer lines.J Urol,1994,151:253A
, http://www.100md.com
6 Lecine AJ,Momand J,Finlay A, et al. The p53 tumor suppressor gene.Nature,1991,351:453
7 Nigro JM,Suzann LJB,Antonette CB, et al. Mutations in the p53 gene occur in diverse human tumors type. Nature,1989,342:705
8 Bernard DM,Morris JR,Kenneth ED, et al. Adenoviral-mediated gene transfer to bladder in vivo.J Urol,1994,152:506
9 Sharon SL,Eisenlohr LC,McCue PA, et al.Intravesical gene therapy for bladder cancer:in vivo gene transfer using vaccinia vectors.J Urol,1994,151:518A
(收稿：1998-06-15), 百拇医药