40 kV/m电磁脉冲辐照后大鼠海马区细胞凋亡研究
作者：丁桂荣 吴彦卓 谢学军 郑振兴 周晏 郭鹞
单位：丁桂荣、吴彦卓、谢学军、郭鹞 710032 西安，第四军医大学放射医学教研室；郑振兴、周晏 西北核技术研究所
关键词：电磁脉冲；大鼠；海马；细胞凋亡
中华物理医学与康复杂志990325 【中图号】 R318.03
细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序的死亡[1] 。在以往的实验中，我们发现电磁脉冲(EMP)对小鼠脑内儿茶酚胺类物质含量有影响[2]，并且EMP辐照后小鼠的学习、记忆能力也有改变(另文报道)，但对EMP辐照后动物海马细胞凋亡的研究尚未见文献报道，为进一步探讨EMP对中枢神经系统的生物学效应，我们对EMP辐照后大鼠海马的细胞凋亡现象进行了观察。
, http://www.100md.com 1 材 料 和 方 法
1.1 动物分组及照射
健康雄性Wistar大鼠49只，由本校动物研究中心提供，体质量180 g～220 g，将动物随机分为对照和照后不同时间组，每组5只动物。EMP辐照参数为：电场强度40 kV/m，前沿(Tr)24 ns，半宽(Th)340 ns。用于电镜及光镜检查的大鼠(共25只)分别于照后1.5、24、48、72 h取材，用于电泳(共4只)和末端标记的大鼠(共25只)分别于辐照后1.5、24、48 h取材。
1.2 DNA 提取及电泳
将大鼠活杀，剥离完整的海马组织，放入预先置有细胞裂解液的匀浆器中，冰浴中匀浆，匀浆液65 ℃水浴放置30 min，酚氯仿进行抽提，加入异丙醇沉淀，用RNaseA消化后，取10μLDNA在10 g/L的琼脂糖凝胶(内含溴化乙锭)中电泳，同时用Marker作对照，紫外灯下观察电泳带型。
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1.3 透射电镜标本制备
按透射电镜样本常规切片，在JEM-200EX透射电镜下观察。
1.4 缺口末端标记
各实验组大鼠用体积分数为1%戊巴比妥钠腹腔麻醉后，用体积分数为4%多聚甲PB(pH 7.4)左心室灌注固定1 h，取脑置于同一固定液中后固定2 h，常规脱水包埋，切片厚约5 μm，按照in situ cell death detection kit 使用说明进行染色。
2 结 果
2.1 DNA琼脂糖凝胶电泳
对照组大鼠海马DNA电泳呈一条约23130bp的大分子片段。EMP照后1.5、24、48 h 组海马DNA电泳与对照组相似也呈一条大分子DNA片段，四条DNA电泳带在同一水平位置，均为见到DNA梯形片段。
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2.2 电镜观察
电镜下可见海马神经元核大而圆，染色质分布均匀，偶可见1～2个核仁，胞浆丰富，内含大量粗面内质网及线粒体。突触结构多见。未发现凋亡小体。照射组海马超微结构与对照组无明显差别。
2.3 光镜观察
海马各层光镜下均可见，尤以锥体细胞层引人注目，细胞呈锥体形，核大而圆，胞浆丰富。齿状回处可见由圆或卵圆形细胞紧密排列而组成的颗粒层。未发现凋亡小体。照射组大鼠海马光镜下结构与对照相比无明显变化。
2.4 缺口末端标记
阳性对照染色阳性，空白对照染色阴性，实验组及对照组染色均为阴性，未见凋亡细胞。
3 讨 论
, http://www.100md.com
1972年Kerr等首先对细胞凋亡现象作了报道[3]，他们根据存在于许多正常组织中散在不完整细胞及细胞碎片的形态学特征提出了生物学中凋亡的概念。凋亡是一种区别于坏死的特殊细胞死亡类型。其形态学特征表现为，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，核染色质边集呈半月型，核仁裂解，进而胞膜内陷，形成凋亡小体。凋亡小体很快被邻近细胞所吞噬[4]。发生凋亡的细胞，其DNA发生裂解，并发生片段化，大小为185bp。从细胞中抽提DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，则可以分带，呈梯状(Ladder)排列[1]。此为细胞凋亡最常见的生化标志。
在本实验中我们应用了生化方法及形态学方法对EMP照射后大鼠海马细胞凋亡进行了检测，并且还采用了目前原位检测细胞凋亡敏感性和特异性都很高的末端转移酶介导的缺口末端标记方法，未发现阳性指征，说明在本实验条件下，大鼠海马神经元未发生细胞凋亡现象。
参 考 文 献
, 百拇医药
1 成军,主编.程序性细胞死亡与疾病.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社.1997，237.
2 吴彦卓，贾宇峰，郭鹞,等.电磁脉冲对小鼠脑内儿茶酚胺类物质含量的影响.第四军医大学学报，1997,18：423.
3 Kerr JFR, Wyllie AH, Gurrie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972,26:239.
4 Kerr JFR,Winterford CM, Harmon BR. Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer ,1994,73:2013.
(收稿 1998-05-05 修回 1999-04-23), http://www.100md.com
单位：丁桂荣、吴彦卓、谢学军、郭鹞 710032 西安，第四军医大学放射医学教研室；郑振兴、周晏 西北核技术研究所
关键词：电磁脉冲；大鼠；海马；细胞凋亡
中华物理医学与康复杂志990325 【中图号】 R318.03
细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序的死亡[1] 。在以往的实验中，我们发现电磁脉冲(EMP)对小鼠脑内儿茶酚胺类物质含量有影响[2]，并且EMP辐照后小鼠的学习、记忆能力也有改变(另文报道)，但对EMP辐照后动物海马细胞凋亡的研究尚未见文献报道，为进一步探讨EMP对中枢神经系统的生物学效应，我们对EMP辐照后大鼠海马的细胞凋亡现象进行了观察。
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1.1 动物分组及照射
健康雄性Wistar大鼠49只，由本校动物研究中心提供，体质量180 g～220 g，将动物随机分为对照和照后不同时间组，每组5只动物。EMP辐照参数为：电场强度40 kV/m，前沿(Tr)24 ns，半宽(Th)340 ns。用于电镜及光镜检查的大鼠(共25只)分别于照后1.5、24、48、72 h取材，用于电泳(共4只)和末端标记的大鼠(共25只)分别于辐照后1.5、24、48 h取材。
1.2 DNA 提取及电泳
将大鼠活杀，剥离完整的海马组织，放入预先置有细胞裂解液的匀浆器中，冰浴中匀浆，匀浆液65 ℃水浴放置30 min，酚氯仿进行抽提，加入异丙醇沉淀，用RNaseA消化后，取10μLDNA在10 g/L的琼脂糖凝胶(内含溴化乙锭)中电泳，同时用Marker作对照，紫外灯下观察电泳带型。
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1.3 透射电镜标本制备
按透射电镜样本常规切片，在JEM-200EX透射电镜下观察。
1.4 缺口末端标记
各实验组大鼠用体积分数为1%戊巴比妥钠腹腔麻醉后，用体积分数为4%多聚甲PB(pH 7.4)左心室灌注固定1 h，取脑置于同一固定液中后固定2 h，常规脱水包埋，切片厚约5 μm，按照in situ cell death detection kit 使用说明进行染色。
2 结 果
2.1 DNA琼脂糖凝胶电泳
对照组大鼠海马DNA电泳呈一条约23130bp的大分子片段。EMP照后1.5、24、48 h 组海马DNA电泳与对照组相似也呈一条大分子DNA片段，四条DNA电泳带在同一水平位置，均为见到DNA梯形片段。
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2.2 电镜观察
电镜下可见海马神经元核大而圆，染色质分布均匀，偶可见1～2个核仁，胞浆丰富，内含大量粗面内质网及线粒体。突触结构多见。未发现凋亡小体。照射组海马超微结构与对照组无明显差别。
2.3 光镜观察
海马各层光镜下均可见，尤以锥体细胞层引人注目，细胞呈锥体形，核大而圆，胞浆丰富。齿状回处可见由圆或卵圆形细胞紧密排列而组成的颗粒层。未发现凋亡小体。照射组大鼠海马光镜下结构与对照相比无明显变化。
2.4 缺口末端标记
阳性对照染色阳性，空白对照染色阴性，实验组及对照组染色均为阴性，未见凋亡细胞。
3 讨 论
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1972年Kerr等首先对细胞凋亡现象作了报道[3]，他们根据存在于许多正常组织中散在不完整细胞及细胞碎片的形态学特征提出了生物学中凋亡的概念。凋亡是一种区别于坏死的特殊细胞死亡类型。其形态学特征表现为，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，核染色质边集呈半月型，核仁裂解，进而胞膜内陷，形成凋亡小体。凋亡小体很快被邻近细胞所吞噬[4]。发生凋亡的细胞，其DNA发生裂解，并发生片段化，大小为185bp。从细胞中抽提DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，则可以分带，呈梯状(Ladder)排列[1]。此为细胞凋亡最常见的生化标志。
在本实验中我们应用了生化方法及形态学方法对EMP照射后大鼠海马细胞凋亡进行了检测，并且还采用了目前原位检测细胞凋亡敏感性和特异性都很高的末端转移酶介导的缺口末端标记方法，未发现阳性指征，说明在本实验条件下，大鼠海马神经元未发生细胞凋亡现象。
参 考 文 献
, 百拇医药
1 成军,主编.程序性细胞死亡与疾病.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社.1997，237.
2 吴彦卓，贾宇峰，郭鹞,等.电磁脉冲对小鼠脑内儿茶酚胺类物质含量的影响.第四军医大学学报，1997,18：423.
3 Kerr JFR, Wyllie AH, Gurrie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972,26:239.
4 Kerr JFR,Winterford CM, Harmon BR. Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer ,1994,73:2013.
(收稿 1998-05-05 修回 1999-04-23), http://www.100md.com