肾组织中葡萄糖转运蛋白与糖尿病肾病的关系*
作者：刘志红 张婷婷 王金泉 陈朝红 周虹 陈惠萍 黎磊石
单位：南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所(南京，210002)
关键词：葡萄糖转运蛋白；糖尿病肾病；肾活检
肾脏病与透析肾移植杂志990302
摘 要 目的：了解葡萄糖转运蛋白-1(GLUT1)和葡萄糖转运蛋白-4(GLUT4)在糖尿病患者肾组织中的分布特点及其与糖尿病肾病(DN)发生及病情进展的关系。方法：应用免疫组化技术和特异性抗体，对19例DN和4例糖尿病无肾病患者肾组织中GLUT1和GLUT4进行了观察，并结合肾脏病理、血糖水平和GLUT1基因型进行了分析。结果：肾组织中GLUT1和GLUT4主要分布在部分肾小球、肾小管和间质血管。肾小球内葡萄糖转运蛋白以GLUT1表达为主。DN患者肾小球中GLUT1表达明显增多，其表达强度与肾脏病变程度相关，并呈局灶节段性增强。在大多数血糖控制良好的DN患者中仍有肾小球GLUT1的持续高表达。没有证实GLUT1基因型对肾组织GLUT1表达有肯定的联系。结论：DN患者肾小球葡萄糖转运蛋白表达明显增加，并且以GLUT1主。GLUT1的表达形式与肾组织病理学改变相关。这种改变在血糖得到良好控制的DN患者中仍持续存在。糖尿病所致肾脏GLUT1表达的改变不仅与DN的发生相关，可能还在DN病情进展中起一定作用。
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DISTRIBUTION OF GLUCOSE TRANSPORTERS IN RENAL TISSUE AND ITS RELATIONSHIP WITH DIABETIC NEPHROPATHY
Liu Zhihong，Zhang Tingting，Wang Jinquan，Chen Zhaohong，Zhou Hong，Chen Huiping，Li Leishi
(Research Institute of Nephrology，Jinling Hospital，Nanjing University School of Medicine，Nanjing，210002)
OBJECTIVE To identify the distributions of glucose transporter-1(GLUT1)and glucose transporter-4(GLUT4)in renal tissue of patients with diabetic nephropathy and to evaluate the role of glucose transporter in the pathogenesis of diabetic nephropathy.
, 百拇医药
METHODOLOGY Twenty-three patients who satisfied the diagnostic criteria of WHO 1985 report for type 2 diabetes mellitus were involved in this study.Diabetic nephropathy was defined as the presence of persistent albuminuria or proteinuria with or without impaired renal function with no known cause of renal disease other than diabetes.All of the patients underwent a renal biopsy.Diabetic nephropathy was detected in 19 cases，and not in the other 4 cases.The distributions of GLUT1 and GLUT4 were detected by immunohistochemical stain with the specific antibodies.GLUT1 gene polymorphism was detected by PCR-RFLP.Renal tissue from donors kidney of transplantation as used as normal control.
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RESULTS GLUT1 and GLUT4 distributed widely in glomeruli，tubules and interstitial vessels in normal kidney.The expression of GLUT1 in glomeruli was found markedly enhanced in patients with diabetic nephropathy.Distribution of GLUT1 was characterized by a focal segmental pattern and positively correlated to the degree of glomerular lesion in patients with diabetic nephropathy.Interestingly，glomerular expression of GLUT1 was found also enhanced in patients without diabetic nephropathy，and no difference of the extent of glomerular GLUT1 was found between hyperglycemic and euglycemic patients with diabetic nephropathy.No association was found between the extent of GLUT1 in glomeruli and the genotype of GLUT1.
, 百拇医药
CONCLUSION Glomerular GLUT1 expression markedly increased in patients with diabetic nephropathy.The up-regulation of glomerular GLUT1 expression also existed in diabetic patients without renal lesion and persisted in patients with diabetic nephropathy when their hyperglycemia was under control.The regulation of GLUT1 in renal tissue may play an important role in the pathogenesis and progression of diabetic nephropathy.
Key words glucose transporter diabetic nephropathy renal biopsy
, 百拇医药
糖尿病肾病(DN)的发生不仅有一定的易感性(2型糖尿病患者中大约有40%的患者最终发展成为DN)，而且，在用胰岛素严格控制血糖的情况下，仍有部分患者发展为DN[1]。DN患者行胰腺移植后五年，肾脏病变依然存在，而且有加重的趋势[2]。因此，除了高血糖和遗传因素外，组织细胞对高血糖造成后果的“记忆”及其滞后效应在DN病情进行性进展中可能也起一定作用。我们以往的研究发现，葡萄糖转运蛋白-1(GLUT1)基因在人群中存在不同的基因表型，并证实携带GLUT1基因XbaI(-)等位基因者，DN的发生率明显高于不携带该等位基因的糖尿病患者[3]。在此基础上，我们又证实了在人类肾小球系膜细胞上有GLUT1的表达，其功能状态受血糖及TGF-β1的影响[4]。目前尚无人肾组织中葡萄糖转运蛋白分布研究的报道，对其在DN情况下变化更无资料可考。作者应用免疫组化技术对正常人及DN患者肾组织中GLUT1和葡萄糖转运蛋白-4(GLUT4)的分布特点进行了观察，结合临床、病理及GLUT1基因型进行了分析，以期进一步阐明肾组织中葡萄糖转运蛋白的变化在DN发生及进展中的作用。
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1 对象和方法
1.1 病例选择 23例2型糖尿病患者均符合1985年WHO制定的糖尿病诊断标准。其中男性15例，女性8例，年龄38～65岁。病程从1个月到20年不等。23例患者均施以经皮肾活检术。结合临床表现及肾活检病理检查结果，诊断DN者19例，4例无糖尿病肾脏损害。DN的诊断标准为2型糖尿病诊断明确，持续性白蛋白尿(尿白蛋白排出率>30mg/24h)和(或)蛋白尿。肾活检病理符合DN的组织学改变，同时排除可能伴发的其它肾脏疾病。详细收集肾活检时患者血糖、糖化血红蛋白、血清胰岛素和C肽水平以及血清肌酐、尿蛋白和尿白蛋白检查结果。
1.2 观察指标
1.2.1 肾组织病理学检查 肾穿刺活检肾组织经石蜡包埋，切片厚度为2μm，分别行HE、PAS、PASM和Masson三色染色，观察病理形态学改变。
1.2.2 GLUT1和GLUT4染色 肾活检组织冰冻切片，用冷丙酮固定10min，再用10%小牛血清室温封闭20min，加兔抗人GLUT1抗体(1∶500)或兔抗人GLUT4抗体(1∶250)，室温孵育1.5h，用PBS漂洗后加辣根过氧化酶标记的猪抗兔IgG(DAKO，1∶100)，室温下孵育40min，用PBS漂洗后加过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物(PAP，DAKO，1∶50)，室温孵育40min，PBS漂洗，用DAB-H2O2显色，再用苏木素复染细胞核，封片观察。正常对照肾组织(n＝13)来自肾移植供肾。兔抗人GLUT1和GLUT4抗血清由美国国立卫生研究院(NIH)SW Cushman博士惠赠。GLUT1在肾组织的表达强度依据辣根过氧化酶着色强度分为阳性着色(+)和强阳性着色(≥++)。由同一技师在单盲情况下进行观察记录。
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1.2.3 GLUT1基因多态性分析 基因组DNA的提取。取新鲜全血2ml，用Triton X-100破碎红细胞和白细胞，直接得到白细胞核，然后用NaClO4、SDS解聚核蛋白，最后用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，乙醇沉淀。GLUT1基因第2号内含子序列中限制性内切酶XbaI点突变检测的引物，PCR及酶切条件详见参考文献[3]。根据患者是否携带XbaI(-)等位基因，将GLUT1分为三个不同的基因型，即XbaI(+/+)、XbaI(+/-)和XbaI(-/-)型[3]。
1.2.4 统计学处理 计数资料采用χ2检验，以P<0.05代表差异具有显著性。
2 结果
2.1 GLUT1和GLUT4在正常人肾组织中的分布 在13例正常人肾组织中有7例(54%)肾小球系膜区可见弥漫性GLUT1阳性着色，染色强度均为“+”。部份标本肾小管和间质血管壁GLUT1也呈阳性着色(表1)。在正常人肾组织中有2例肾小球系膜区GLUT4是阳性表达(15%)，在部分标本中也能见到肾小管和间质血管壁GLUT4阳性着色(表1)。
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表1 GLUT1和GLUT4在DN患者和正常人肾组织中的分布
GLUT1
GLUT4
n
肾小球
肾小管
间质
血管
肾小球
肾小管
间质
血管
DN
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19
18(94)*
14(74)
4(21)
8(42)
10(52)
8(42)
正常人
13
7(54)
8(62)
3(23)
2(15)
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5(38)
2(15)
*P<0.01，括弧内为百分数
2.2 GLUT1和GLUT4在糖尿病及DN患者肾组织中的分布 比较4例糖尿病无肾脏损害者和19例DN患者肾组织中GLUT1和GLUT4的分布，发现糖尿病无肾脏损害者肾组织中GLUT1和GLUT4的分布与正常人相比差异不明显，主要分布在肾小球系膜区、肾小管及个别间质血管。DN患者肾小球GLUT1表达的发生率明显高于正常人(表1)。不仅如此，GLUT1在肾小球中的表达形式还与肾小球组织学改变有关。病变重的肾小球GLUT1的表达均较强，而且，在同一个患者的切片中可呈局灶节段性增强。在肾小球结节样病变处可见GLUT1节段性增强。GLUT4在肾小球和间质血管的表达在糖尿病患者虽有增高的趋势，但无统计学意义(P>0.05)。
2.3 肾小球内GLUT1和GLUT4表达与血糖水平的关系 根据患者肾活检时血糖及糖化血红蛋白水平，比较肾小球内GLUT1和GLUT4表达与血糖控制状态的关系发现，在血糖控制良好的患者中GLUT1在肾小球内呈强阳性表达(≥++)者的发生率比存在高血糖的患者(空腹血糖>7mmol/L和/或餐后血糖>12mmol/L)有所增高，但未达到统计学意义(P>0.05)，而GLUT4在肾小球内的表达似没有类似的变化(表2)。
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表2 肾小球内GLUT1表达与血糖水平及GLUT1基因型的关系
n
GLUT1表达增加
高血糖
10
3(30)
血糖正常
13
9(69)
携带XbaI(-)
6
4(67)
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不携带XbaI(-)
17
8(47)
括弧内为百分数
2.4 肾小球内GLUT1和GLUT4表达与GLUT1基因多态性的关系 根据患者GLUT1基因型，将患者分为携带和不携带XbaI(-)等位基因两组，比较肾小球GLUT1表达增强(≥++)与GLUT1基因型的关系，虽然携带XbaI(-)等位基因者肾小球GLUT1强表达者似有增高的趋势，但无统计学意义(P>0.05)(表2)。
3 讨论
3.1 肾小球葡萄糖转运蛋白表达以GLUT1为主 葡萄糖转运蛋白是介导细胞内葡萄糖摄入的主要转运体，也是调控细胞内糖代谢的重要关卡之一，其功能状态与糖尿病细胞内糖代谢紊乱及并发症的发生密切相关。目前，已克隆的人类葡萄糖转运蛋白有六种，根据不同组织细胞糖代谢的特点，葡萄糖转运蛋白在组织中的类型有所不同[5，6]。葡萄糖转运蛋白在肾组织中的分布很广，从肾小球至髓质集合管均有葡萄糖转运蛋白的存在，但在肾单位的不同部分葡萄糖转运蛋白的种类是不同的[7，8]。肾小球中有GLUT1和GLUT4的存在，在肾小管的不同阶段还有GLUT1、GLUT4和GLUT2的分布[9～11]。目前，上述工作只局限于动物标本和体外细胞培养的观察。对人肾脏组织以及DN患者肾组织中GLUT1和GLUT4的分布目前尚无这方面的报道。
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我们在观察中发现，在正常人肾组织中GLUT1和GLUT4分别分布于肾小球、部分肾小管和间质血管。虽然在肾小球中可以看到GLUT1和GLUT4的表达，但大多数病例以GLUT1为主，肾小球GLUT4的阳性率在正常人仅为15%。我们最近的工作首次证实了人肾小球系膜细胞上有GLUT1和GLUT4的表达[4]。GLUT1和GLUT4功能的调控机制不同，GLUT4的功能受胰岛素的调控，而胰岛素对GLUT1的功能基本没有影响。鉴于胰岛素对体外培养大鼠系膜细胞葡萄糖的摄入没有明显影响[12]，人们认为GLUT1是系膜细胞葡萄糖转运的主要载体。通过对人肾活检组织进行观察证实了在正常人肾小球虽然也有GLUT1和GLUT4的表达，但在多数情况下以GLUT1的表达为主。
3.2 肾小球内GLUT1的改变与DN肾小球病变的发生有关 系膜细胞上GLUT1的功能直接参与糖尿病系膜病变的形成。用GLUT1基因转染系膜细胞，这种过度表达GLUT1的系膜细胞在生理糖浓度培养的条件下，就能表现出正常细胞只有在高糖培养条件下才能表现出来的细胞肥大、细胞外基质产生增多等现象[13]，该结果表明，在糖尿病系膜病变的形成中，系膜细胞GLUT1的功能状态在某些情况下可能比高血糖更重要，而不同个体系膜细胞GLUT1功能的差异有可能是影响DN易感性的因素之一。为了进一步对这个问题进行阐明，我们在对DN患者肾小球GLUT1分布进行观察的同时，对糖尿病不伴DN，血糖控制程度不同以及GLUT1不同基因型患者肾小球中GLUT1的表达强度进行了比较，发现4例糖尿病无DN患者中有3例肾小球中GLUT1呈强阳性表达，该结果提示，在一些糖尿病尚未出现DN的患者中肾小球GLUT1表达增高就已经存在。DN患者不仅肾小球GLUT1表达比正常人明显增多增强，而且GLUT1在肾小球中的表达形式还与肾小球组织学改变相关。在同一个患者的切片中GLUT1在肾小球内的表达表现出局灶节段性增强，在肾小球结节样病变处可见GLUT1呈节段性增强。DN患者肾组织中GLUT1上述分布特点，进一步证明了GLUT1在DN发病中的作用。
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3.3 血糖控制良好的患者肾小球内仍有GLUT1的持续高表达 DN患者肾小球内GLUT1表达增高，在血糖得到良好控制的情况下这种改变是否能够得到逆转，我们的结果显示，在许多长期血糖控制良好的患者中仍有69%伴肾小球GLUT1强阳性表达，表明DN患者肾小球内GLUT1表达增加在血糖得到良好控制的情况下仍然持续存在。该现象可能是许多血糖控制良好的患者肾脏病变持续性发展的因素之一。最近有文章报道，DN患者在接受胰腺移植术后10年，肾脏病变几乎能得到完全逆转，但是这批患者术后五年肾活检显示肾脏病变并无明显改善，甚至有加重的迹象[2，14]。另外，将在高糖环境下培养的内皮细胞转移到正常糖浓度培养液中进行培养观察，发现高糖所致的一些改变仍然持续存在[15]。这些现象提示，高糖对细胞功能的影响确实存在一个相当长时间的滞后效应。细胞对高血糖留下这种“记忆”的机制目前尚不清楚，血糖正常的DN患者肾小球内GLUT1持续高表达有可能是保持细胞对糖尿病“记忆”的机制之一。进一步借助体内、体外模型在更深的水平上对此加以研究，对于阐明DN的发病机制具有重要的意义。
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3.4 GLUT1基因多态性与肾小球内GLUT1表达的关系 高血糖和遗传因素是DN发病机制中两个重要因素。在DN分子发病机制的研究中，GLUT1是一个理想的候选基因[10]。我们以往的工作证实，GLUT1基因多态性与DN的发生有关，携带GLUT1基因XbaI(-)等位基因者，DN的发生率明显高于不携带该等位基因者[3]。本项研究在观察中发现，携带XbaI(-)等位基因的6名患者中有4位肾小球内GLUT1呈强阳性表达，其发生率似较不携带该等位基因者高，但无统计学意义(P>0.05)。由于观察的例数有限，目前尚无法就此现象做出结论。GLUT1基因型与肾组织GLUT1表达的关系有待在扩大病例的基础上，结合其功能研究进一步加以阐明。
*江苏省自然科学基金资助项目(BK97176)
参考文献
1 The diabetes control and complications trial research group.The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus.N Eng1 J Med，1994，45：659
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2 Fioretto P，Steffes MW，Sutherland DER et al.Reversal of lesions of diabetic nephropathy after pancreas transplantation.N Eng1 J Med，1998，339：69
3 刘志红，关天俊，陈朝红等.胰岛素受体底物-1和葡萄糖转运蛋白基因多态性与糖尿病及糖尿病肾病的关系.中华医学杂志，1998，78：662
4 Liu Zhihong，Zhang Jin，Chen Zhaohong et al.Identification of GLUT1 in human mesangial cells and its modulation by rhein and TGF-β 1.J Am Soc Nephrol，1998，9：636A
5 Klip P，Tsakiridis T，Marette A et al.Regulation of expression of glucose transporter by glucose：a review of studies in vivo and in cell cultures.FASEB J，1994，8：43
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9 Heilig C，Brosius FC，Henry DN.Glucose transporters of the glomerulus and the implications for diabetic nephropathy.Kidney Int，1997，52(suppl 60)：S91
10 Liu Zhihong，Li Leishi.Glucose transporter-Implication for diabetic nephropathy.J Nephrol Dialy Transplant，1998，7：205
11 章精，刘志红，陈朝红等.小鼠肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白的鉴定及其功能研究.肾脏病与透析肾移植杂志，1998，7：212
12 Kreisberg JI，Ayo SH.The glomerular mesangium in diabetes mellitus.Kidney Int，1993，43：109
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13 Heilig CW，Concepcion LA，Riser BL et al.Overexpression of glucose transporters in rat mesangial cells cultured in normal glucose millieu mimics the diabetic phenotype.J Clin Invest，1995，96：1802
14 Fioretto P，Mauer SM，Bilous JM et al.Effect pancreas transplantation on glomerular structure in insulin-dependent-diabetes patients with their own kidney.Lancet，1993，342：1193
15 Roy S，Sala R，Cagliero E et al.Overexpression of fibronectin induced by diabetes or high glucose：Phenomenon with a memory.Proc Natl Acad Sci USA，1990，87：404
(1999-04-03收稿), http://www.100md.com
单位：南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所(南京，210002)
关键词：葡萄糖转运蛋白；糖尿病肾病；肾活检
肾脏病与透析肾移植杂志990302
摘 要 目的：了解葡萄糖转运蛋白-1(GLUT1)和葡萄糖转运蛋白-4(GLUT4)在糖尿病患者肾组织中的分布特点及其与糖尿病肾病(DN)发生及病情进展的关系。方法：应用免疫组化技术和特异性抗体，对19例DN和4例糖尿病无肾病患者肾组织中GLUT1和GLUT4进行了观察，并结合肾脏病理、血糖水平和GLUT1基因型进行了分析。结果：肾组织中GLUT1和GLUT4主要分布在部分肾小球、肾小管和间质血管。肾小球内葡萄糖转运蛋白以GLUT1表达为主。DN患者肾小球中GLUT1表达明显增多，其表达强度与肾脏病变程度相关，并呈局灶节段性增强。在大多数血糖控制良好的DN患者中仍有肾小球GLUT1的持续高表达。没有证实GLUT1基因型对肾组织GLUT1表达有肯定的联系。结论：DN患者肾小球葡萄糖转运蛋白表达明显增加，并且以GLUT1主。GLUT1的表达形式与肾组织病理学改变相关。这种改变在血糖得到良好控制的DN患者中仍持续存在。糖尿病所致肾脏GLUT1表达的改变不仅与DN的发生相关，可能还在DN病情进展中起一定作用。
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DISTRIBUTION OF GLUCOSE TRANSPORTERS IN RENAL TISSUE AND ITS RELATIONSHIP WITH DIABETIC NEPHROPATHY
Liu Zhihong，Zhang Tingting，Wang Jinquan，Chen Zhaohong，Zhou Hong，Chen Huiping，Li Leishi
(Research Institute of Nephrology，Jinling Hospital，Nanjing University School of Medicine，Nanjing，210002)
OBJECTIVE To identify the distributions of glucose transporter-1(GLUT1)and glucose transporter-4(GLUT4)in renal tissue of patients with diabetic nephropathy and to evaluate the role of glucose transporter in the pathogenesis of diabetic nephropathy.
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METHODOLOGY Twenty-three patients who satisfied the diagnostic criteria of WHO 1985 report for type 2 diabetes mellitus were involved in this study.Diabetic nephropathy was defined as the presence of persistent albuminuria or proteinuria with or without impaired renal function with no known cause of renal disease other than diabetes.All of the patients underwent a renal biopsy.Diabetic nephropathy was detected in 19 cases，and not in the other 4 cases.The distributions of GLUT1 and GLUT4 were detected by immunohistochemical stain with the specific antibodies.GLUT1 gene polymorphism was detected by PCR-RFLP.Renal tissue from donors kidney of transplantation as used as normal control.
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RESULTS GLUT1 and GLUT4 distributed widely in glomeruli，tubules and interstitial vessels in normal kidney.The expression of GLUT1 in glomeruli was found markedly enhanced in patients with diabetic nephropathy.Distribution of GLUT1 was characterized by a focal segmental pattern and positively correlated to the degree of glomerular lesion in patients with diabetic nephropathy.Interestingly，glomerular expression of GLUT1 was found also enhanced in patients without diabetic nephropathy，and no difference of the extent of glomerular GLUT1 was found between hyperglycemic and euglycemic patients with diabetic nephropathy.No association was found between the extent of GLUT1 in glomeruli and the genotype of GLUT1.
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CONCLUSION Glomerular GLUT1 expression markedly increased in patients with diabetic nephropathy.The up-regulation of glomerular GLUT1 expression also existed in diabetic patients without renal lesion and persisted in patients with diabetic nephropathy when their hyperglycemia was under control.The regulation of GLUT1 in renal tissue may play an important role in the pathogenesis and progression of diabetic nephropathy.
Key words glucose transporter diabetic nephropathy renal biopsy
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糖尿病肾病(DN)的发生不仅有一定的易感性(2型糖尿病患者中大约有40%的患者最终发展成为DN)，而且，在用胰岛素严格控制血糖的情况下，仍有部分患者发展为DN[1]。DN患者行胰腺移植后五年，肾脏病变依然存在，而且有加重的趋势[2]。因此，除了高血糖和遗传因素外，组织细胞对高血糖造成后果的“记忆”及其滞后效应在DN病情进行性进展中可能也起一定作用。我们以往的研究发现，葡萄糖转运蛋白-1(GLUT1)基因在人群中存在不同的基因表型，并证实携带GLUT1基因XbaI(-)等位基因者，DN的发生率明显高于不携带该等位基因的糖尿病患者[3]。在此基础上，我们又证实了在人类肾小球系膜细胞上有GLUT1的表达，其功能状态受血糖及TGF-β1的影响[4]。目前尚无人肾组织中葡萄糖转运蛋白分布研究的报道，对其在DN情况下变化更无资料可考。作者应用免疫组化技术对正常人及DN患者肾组织中GLUT1和葡萄糖转运蛋白-4(GLUT4)的分布特点进行了观察，结合临床、病理及GLUT1基因型进行了分析，以期进一步阐明肾组织中葡萄糖转运蛋白的变化在DN发生及进展中的作用。
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1 对象和方法
1.1 病例选择 23例2型糖尿病患者均符合1985年WHO制定的糖尿病诊断标准。其中男性15例，女性8例，年龄38～65岁。病程从1个月到20年不等。23例患者均施以经皮肾活检术。结合临床表现及肾活检病理检查结果，诊断DN者19例，4例无糖尿病肾脏损害。DN的诊断标准为2型糖尿病诊断明确，持续性白蛋白尿(尿白蛋白排出率>30mg/24h)和(或)蛋白尿。肾活检病理符合DN的组织学改变，同时排除可能伴发的其它肾脏疾病。详细收集肾活检时患者血糖、糖化血红蛋白、血清胰岛素和C肽水平以及血清肌酐、尿蛋白和尿白蛋白检查结果。
1.2 观察指标
1.2.1 肾组织病理学检查 肾穿刺活检肾组织经石蜡包埋，切片厚度为2μm，分别行HE、PAS、PASM和Masson三色染色，观察病理形态学改变。
1.2.2 GLUT1和GLUT4染色 肾活检组织冰冻切片，用冷丙酮固定10min，再用10%小牛血清室温封闭20min，加兔抗人GLUT1抗体(1∶500)或兔抗人GLUT4抗体(1∶250)，室温孵育1.5h，用PBS漂洗后加辣根过氧化酶标记的猪抗兔IgG(DAKO，1∶100)，室温下孵育40min，用PBS漂洗后加过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物(PAP，DAKO，1∶50)，室温孵育40min，PBS漂洗，用DAB-H2O2显色，再用苏木素复染细胞核，封片观察。正常对照肾组织(n＝13)来自肾移植供肾。兔抗人GLUT1和GLUT4抗血清由美国国立卫生研究院(NIH)SW Cushman博士惠赠。GLUT1在肾组织的表达强度依据辣根过氧化酶着色强度分为阳性着色(+)和强阳性着色(≥++)。由同一技师在单盲情况下进行观察记录。
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1.2.3 GLUT1基因多态性分析 基因组DNA的提取。取新鲜全血2ml，用Triton X-100破碎红细胞和白细胞，直接得到白细胞核，然后用NaClO4、SDS解聚核蛋白，最后用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，乙醇沉淀。GLUT1基因第2号内含子序列中限制性内切酶XbaI点突变检测的引物，PCR及酶切条件详见参考文献[3]。根据患者是否携带XbaI(-)等位基因，将GLUT1分为三个不同的基因型，即XbaI(+/+)、XbaI(+/-)和XbaI(-/-)型[3]。
1.2.4 统计学处理 计数资料采用χ2检验，以P<0.05代表差异具有显著性。
2 结果
2.1 GLUT1和GLUT4在正常人肾组织中的分布 在13例正常人肾组织中有7例(54%)肾小球系膜区可见弥漫性GLUT1阳性着色，染色强度均为“+”。部份标本肾小管和间质血管壁GLUT1也呈阳性着色(表1)。在正常人肾组织中有2例肾小球系膜区GLUT4是阳性表达(15%)，在部分标本中也能见到肾小管和间质血管壁GLUT4阳性着色(表1)。
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表1 GLUT1和GLUT4在DN患者和正常人肾组织中的分布
GLUT1
GLUT4
n
肾小球
肾小管
间质
血管
肾小球
肾小管
间质
血管
DN
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19
18(94)*
14(74)
4(21)
8(42)
10(52)
8(42)
正常人
13
7(54)
8(62)
3(23)
2(15)
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5(38)
2(15)
*P<0.01，括弧内为百分数
2.2 GLUT1和GLUT4在糖尿病及DN患者肾组织中的分布 比较4例糖尿病无肾脏损害者和19例DN患者肾组织中GLUT1和GLUT4的分布，发现糖尿病无肾脏损害者肾组织中GLUT1和GLUT4的分布与正常人相比差异不明显，主要分布在肾小球系膜区、肾小管及个别间质血管。DN患者肾小球GLUT1表达的发生率明显高于正常人(表1)。不仅如此，GLUT1在肾小球中的表达形式还与肾小球组织学改变有关。病变重的肾小球GLUT1的表达均较强，而且，在同一个患者的切片中可呈局灶节段性增强。在肾小球结节样病变处可见GLUT1节段性增强。GLUT4在肾小球和间质血管的表达在糖尿病患者虽有增高的趋势，但无统计学意义(P>0.05)。
2.3 肾小球内GLUT1和GLUT4表达与血糖水平的关系 根据患者肾活检时血糖及糖化血红蛋白水平，比较肾小球内GLUT1和GLUT4表达与血糖控制状态的关系发现，在血糖控制良好的患者中GLUT1在肾小球内呈强阳性表达(≥++)者的发生率比存在高血糖的患者(空腹血糖>7mmol/L和/或餐后血糖>12mmol/L)有所增高，但未达到统计学意义(P>0.05)，而GLUT4在肾小球内的表达似没有类似的变化(表2)。
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表2 肾小球内GLUT1表达与血糖水平及GLUT1基因型的关系
n
GLUT1表达增加
高血糖
10
3(30)
血糖正常
13
9(69)
携带XbaI(-)
6
4(67)
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不携带XbaI(-)
17
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括弧内为百分数
2.4 肾小球内GLUT1和GLUT4表达与GLUT1基因多态性的关系 根据患者GLUT1基因型，将患者分为携带和不携带XbaI(-)等位基因两组，比较肾小球GLUT1表达增强(≥++)与GLUT1基因型的关系，虽然携带XbaI(-)等位基因者肾小球GLUT1强表达者似有增高的趋势，但无统计学意义(P>0.05)(表2)。
3 讨论
3.1 肾小球葡萄糖转运蛋白表达以GLUT1为主 葡萄糖转运蛋白是介导细胞内葡萄糖摄入的主要转运体，也是调控细胞内糖代谢的重要关卡之一，其功能状态与糖尿病细胞内糖代谢紊乱及并发症的发生密切相关。目前，已克隆的人类葡萄糖转运蛋白有六种，根据不同组织细胞糖代谢的特点，葡萄糖转运蛋白在组织中的类型有所不同[5，6]。葡萄糖转运蛋白在肾组织中的分布很广，从肾小球至髓质集合管均有葡萄糖转运蛋白的存在，但在肾单位的不同部分葡萄糖转运蛋白的种类是不同的[7，8]。肾小球中有GLUT1和GLUT4的存在，在肾小管的不同阶段还有GLUT1、GLUT4和GLUT2的分布[9～11]。目前，上述工作只局限于动物标本和体外细胞培养的观察。对人肾脏组织以及DN患者肾组织中GLUT1和GLUT4的分布目前尚无这方面的报道。
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我们在观察中发现，在正常人肾组织中GLUT1和GLUT4分别分布于肾小球、部分肾小管和间质血管。虽然在肾小球中可以看到GLUT1和GLUT4的表达，但大多数病例以GLUT1为主，肾小球GLUT4的阳性率在正常人仅为15%。我们最近的工作首次证实了人肾小球系膜细胞上有GLUT1和GLUT4的表达[4]。GLUT1和GLUT4功能的调控机制不同，GLUT4的功能受胰岛素的调控，而胰岛素对GLUT1的功能基本没有影响。鉴于胰岛素对体外培养大鼠系膜细胞葡萄糖的摄入没有明显影响[12]，人们认为GLUT1是系膜细胞葡萄糖转运的主要载体。通过对人肾活检组织进行观察证实了在正常人肾小球虽然也有GLUT1和GLUT4的表达，但在多数情况下以GLUT1的表达为主。
3.2 肾小球内GLUT1的改变与DN肾小球病变的发生有关 系膜细胞上GLUT1的功能直接参与糖尿病系膜病变的形成。用GLUT1基因转染系膜细胞，这种过度表达GLUT1的系膜细胞在生理糖浓度培养的条件下，就能表现出正常细胞只有在高糖培养条件下才能表现出来的细胞肥大、细胞外基质产生增多等现象[13]，该结果表明，在糖尿病系膜病变的形成中，系膜细胞GLUT1的功能状态在某些情况下可能比高血糖更重要，而不同个体系膜细胞GLUT1功能的差异有可能是影响DN易感性的因素之一。为了进一步对这个问题进行阐明，我们在对DN患者肾小球GLUT1分布进行观察的同时，对糖尿病不伴DN，血糖控制程度不同以及GLUT1不同基因型患者肾小球中GLUT1的表达强度进行了比较，发现4例糖尿病无DN患者中有3例肾小球中GLUT1呈强阳性表达，该结果提示，在一些糖尿病尚未出现DN的患者中肾小球GLUT1表达增高就已经存在。DN患者不仅肾小球GLUT1表达比正常人明显增多增强，而且GLUT1在肾小球中的表达形式还与肾小球组织学改变相关。在同一个患者的切片中GLUT1在肾小球内的表达表现出局灶节段性增强，在肾小球结节样病变处可见GLUT1呈节段性增强。DN患者肾组织中GLUT1上述分布特点，进一步证明了GLUT1在DN发病中的作用。
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3.3 血糖控制良好的患者肾小球内仍有GLUT1的持续高表达 DN患者肾小球内GLUT1表达增高，在血糖得到良好控制的情况下这种改变是否能够得到逆转，我们的结果显示，在许多长期血糖控制良好的患者中仍有69%伴肾小球GLUT1强阳性表达，表明DN患者肾小球内GLUT1表达增加在血糖得到良好控制的情况下仍然持续存在。该现象可能是许多血糖控制良好的患者肾脏病变持续性发展的因素之一。最近有文章报道，DN患者在接受胰腺移植术后10年，肾脏病变几乎能得到完全逆转，但是这批患者术后五年肾活检显示肾脏病变并无明显改善，甚至有加重的迹象[2，14]。另外，将在高糖环境下培养的内皮细胞转移到正常糖浓度培养液中进行培养观察，发现高糖所致的一些改变仍然持续存在[15]。这些现象提示，高糖对细胞功能的影响确实存在一个相当长时间的滞后效应。细胞对高血糖留下这种“记忆”的机制目前尚不清楚，血糖正常的DN患者肾小球内GLUT1持续高表达有可能是保持细胞对糖尿病“记忆”的机制之一。进一步借助体内、体外模型在更深的水平上对此加以研究，对于阐明DN的发病机制具有重要的意义。
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3.4 GLUT1基因多态性与肾小球内GLUT1表达的关系 高血糖和遗传因素是DN发病机制中两个重要因素。在DN分子发病机制的研究中，GLUT1是一个理想的候选基因[10]。我们以往的工作证实，GLUT1基因多态性与DN的发生有关，携带GLUT1基因XbaI(-)等位基因者，DN的发生率明显高于不携带该等位基因者[3]。本项研究在观察中发现，携带XbaI(-)等位基因的6名患者中有4位肾小球内GLUT1呈强阳性表达，其发生率似较不携带该等位基因者高，但无统计学意义(P>0.05)。由于观察的例数有限，目前尚无法就此现象做出结论。GLUT1基因型与肾组织GLUT1表达的关系有待在扩大病例的基础上，结合其功能研究进一步加以阐明。
*江苏省自然科学基金资助项目(BK97176)
参考文献
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(1999-04-03收稿), http://www.100md.com