粪抗原检测法诊断犬细粒棘球绦虫感染的研究*Ⅱ.粪抗原检测的敏感性、特异性及实验感染犬排出粪抗原的动态观察
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作者：焦 伟 柴君杰 伊斯拉音·乌斯曼 付 承 瞿 群
单位：新疆维吾尔自治区地方病防治研究所卫生部包虫病防治培训基地
关键词：细粒棘球绦虫；犬；槟榔碱；粪抗原；双抗体夹心ELISA
中国人兽共患病杂志990412 摘 要 用细粒棘球绦虫成虫虫体抗原及其抗体建立的双抗体夹心ELISA滴定成虫抗原的结果A450值与抗原含量呈指数曲线关系，高度相关(r=0.98)。实验感染家犬粪抗原含量在2.5-8.0μg/ml之间，因此本法在检测粪抗原中具有足够的敏感性。家犬泡状带绦虫的感染引起的交叉反应是影响本法特异性的主要问题。选择最适的抗体包被浓度可消除交叉反应。用细粒棘球蚴原头节感染家犬后，粪抗原呈低滴度阳性，至21天后迅速升高。实验感染泡状带绦虫的家犬观察50天粪抗原均在临界水平之下。作者推荐本法可用于家犬细粒棘球绦虫成虫感染的诊断。
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DIAGNOSIS OF ECHINOCOCCUS GRANULOSUS INFECTION IN DOGS
WITH COPROANTIGEN DETECTION
Ⅱ.INVESTIGATION ON SENSITIVITY,SPECIFICITY AND DINAMICS
OF COPROANTIGEN DETECTION
IN DOGS EXPERIMENTALLY INFECTED WITH E.GRANULOSUS
Jiao Wei Chai Junjie Israyil.Osman Fu Chen Qu Qun
, 百拇医药 (National Hydatid Disease Centre of China,Xinjiang Institute for Endemic Diseases Control and Research,Urumuqi,830002)
ABSTRACT A double antibody sandwich ELISA developed with the somatic antigen of E.granulosus adult worm and antibody system were used in antigen titration.The A450 values correlated with concentrations of antigen by an exponential curve.Coproantigen contained in feces of infected dogs were 2.1-8.0μg/ml,therefore this method possess sufficient sensitivity for detection of coproantigen.The cross reaction were found in fecal samples of T.hydatigena infected dogs and this cross reaction could be eliminated by selection of optimal concentration of coating antibody.A low titre of coproantigen were found in feces ofter experimentally infection of dogs and elevated markedly at the 21th day.The authors recommanded this method to apply in coproantigen detection for diagnosis of E.granulosus infection in dogs.
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KEY WORDS Echinococcus granulosus Dog Coproantigen Diagnosis
我们在前文中报道了应用细粒棘球绦虫成虫虫体抗原和抗体系统建立的检测粪抗原的双抗体夹心ELISA方法[1]。本文报告对这种方法的敏感性、特异性和家犬在实验感染后排出粪抗原的动态进一步研究的结果。
1 材料和方法
1.1 抗原与抗体 采用细粒棘球绦虫成虫虫体抗原和用这种抗原免疫家兔的高价免疫血清经硫酸铵粗提后再经抗原亲和层析柱纯化的免疫家兔IgG作为基础检测系统，方法按文献[1]。泡状带绦虫和犬弓首蛔虫的成虫虫体抗原亦按同一方法制备。
1.2 双抗体夹心ELISA 用不同浓度抗体150μl/孔包板4℃18h后，用含10%小牛血清的PBS—T封闭，37℃1h，洗板，加入不同量已知抗原或待检犬粪标本100μl/孔，37℃温育1h，洗板，加入与包被抗体同源的HRP标记抗体(1∶200)100μl/孔，37℃1h，洗板，加TMB底物100μl/孔，37℃30′，加2mol/L H2SO4 50μl/孔，终止反应，读取A450值，以正常家犬粪便标本A450的均值加4S为阳性临界值。
, 百拇医药
1.3 感染的虫种
1.3.1 细粒棘球绦虫 从屠宰场收集的感染细粒棘球蚴的绵羊肝收取原头节。按每只犬1×105个原头节的剂量，将原头节混悬于包囊液中给家犬灌服，间隔一天后，再用同一剂量感染一次。感染后35天用槟榔碱驱虫检查感染结果。
1.3.2 泡状带绦虫 从屠宰场绵羊腹腔中收集细颈囊尾蚴，按每只犬8～10个使其吞食。感染后不同时间采集犬粪标本，并于感染后50天用槟榔碱驱虫，检查感染结果。
1.4 犬粪标本的处理 收集新鲜犬粪，按1g犬粪+1ml保存液(pH7. 2 0.15M/L.PBS含0.02%NaN3，0.3%Tween-20和0.05%牛血红蛋白)制成悬液后，经3000r/min离心10sec，取上清，分装保存于-20℃待用。
2 结果
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2.1 双抗体夹心ELISA检出粪抗原的水平及与感染程度的关系
2.1.1 以20mg/ml抗体包板，与不同量成虫虫体抗原(按蛋白质含量测定的结果)进行双抗体夹心ELISA滴定，其A450值与抗原的量之间呈指数曲线关系=10-0.8164+0.094π(图1)，曲线拟合结果良好，A450值与抗原的量之间呈高度正相关(r=0.98)实验感染细粒棘球绦虫的家犬其粪抗原检出量按A450为0.25～0.75范围内相当于2.5μg/ml～8.0μg/ml。
图1 双抗体夹心ELISA检出细粒棘球绦虫成虫抗原的指数曲线
Fig1 The exponential curveof double antibody sandwich ELISA in detection of antigens from E.granulosus adult worm
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2.1.2 8只实验感染细粒棘球绦虫的家犬在感染后第35天进行槟榔碱驱虫，于驱虫前采集粪便标本测定粪抗原。结果见图2。驱出成虫数与粪抗原检测结果的OD值呈正相关(r=0.94)。
图2 人工感染细粒棘球绦虫的家犬粪抗原检测与槟榔碱驱虫结果(图中数字为驱出E.g成虫数)
Fig Results of coproantigen fetection and areccoline purgation in dogs artificially infected with E.granulosus at day 35 after infection(The number in figure is adult worms purged)
2.2 泡状带绦虫抗原的交叉反应
2.2.1 用20μg/ml纯化兔抗细粒棘球绦虫成虫IgG包板，用双抗体夹心ELISA检测3种成虫抗原的结果见图3。表明细粒棘球绦虫和泡状带绦虫虫体抗原之间有很强的交叉反应。而与犬弓首蛔虫的交叉反应则很低。
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图3 用20μg/ml抗体包被的双抗体夹心ELISA对3种蠕虫虫体抗原滴定结果
E.g 细粒棘球绦虫 T.h 泡状带绦虫 T.c 犬弓首蛔虫
Fig3 Results of double antibody sandwich ELISAtitration with 20μg/ml antibody against antigens from E.granulosus,T.hydatigena and Tox.caninum
2.2.2 3只感染细粒棘球绦虫的犬和5只感染泡状带绦虫的犬于感染后不同时间采取粪便标本，用不同量抗体包被进行ELISA试验的结果见表1，表中数据说明用20μg/ml抗体包板时，感染细粒棘球绦虫的犬粪标本全部为阳性。感染泡状带绦虫的犬粪标本阳性率也达87.5%(14/16)。降低抗体包被量至5μg/ml时，虽然与泡状带绦虫感染犬粪标本的交叉反应降至最低，而对同型感染犬粪抗原的检出率也降至50%(6/12)。用10μg/ml抗体包板时，在保持同型感染犬的粪抗原检测结果全部为阳性的条件下，与泡状带绦虫感染犬粪标本的阳性交叉反应为25%(4/16)。而且这些交叉反应阳性的标本A450均为临界值。如果以A450 +4S为临界值时(A450=0.23)，可在保持同型犬粪标本阳性率100%条件下，与泡状带绦虫粪抗原的交叉反应降为零。
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表1用不同量抗体包板的双抗体夹心ELISA检测实验感染细粒棘球绦虫和泡状带绦虫家犬粪抗原的结果
Tab 1 Results of double antibody sandwich ELIS Ausing different concentrations of coating antibody in detetion of coproantigen in dogs experimentally infected with E.granulosus and T.hydatigena 标本来源
Origin of samples
不同量抗体包板的ELISA结果(A450)
Results of ELISA with different concentration of coating antibody(A450)
, 百拇医药
20μg/ml
10μg/ml
5μg/ml
细粒棘球绦虫感染犬粪便
Fecal sample of
E.granulosus infected dogs
1
0.30+
0.23
0.22-
2
0.27+
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0.25+
0.28+
3
0.26+
0.32+
0.32+
4
0.30+
0.34+
0.32+
5
0.28+
0.30+
, 百拇医药
0.23-
6
0.32+
0.31+
0.33+
7
0.48+
0.29+
0.19-
8
0.54+
0.29+
0.21-
, 百拇医药
9
0.31+
0.27+
0.21-
10
0.46+
0.34+
0.24+
11
0.31+
0.22-
12
0.56+
, 百拇医药
0.39+
0.26+
泡状带绦虫感染犬粪便
Fecal Sample of
T.hydatigena infected dogs
13
0.27+
0.18-
0.19-
14
0.28+
.20-
, 百拇医药
0.22-
15
0.30+
0.18-
0.17-
16
0.30+
0.21-
0.21-
17
0.28+
0.21-
0.19-
, 百拇医药
18
0.30+
0.18-
0.20-
19
0.26+
0.17-
0.16-
20
0.24-
0.18-
0.17-
21
, 百拇医药
0.21-
0.16-
0.16-
22
0.31+
0.17-
0.18-
23
0.29+
0.16-
0.18-
24
0.31+
, 百拇医药
0.22-
0.21-
25
0.32+
0.15-
0.17-
26
0.26+
0.15-
0.20-
27
0.30+
0.18-
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0.20-
28
0.26+
0.21+
0.24-
正常犬粪对照(±s)
0.22±0.01
0.16±0.018
0.19±0.019
+4SD
0.26
0.23
, 百拇医药
0.26
2.3 家犬实验感染细粒棘球绦虫和泡状带绦虫后检出粪抗原的动态
2.3.1 3只实验感染细粒棘球绦虫的犬在感染后不同时间检测粪抗原的动态见图4。这3只犬于感染后35天驱出的细粒棘球绦虫成虫数分别为11600、13114和9600条。表明在感染后即可检出低滴度粪抗原，至第24天时明显升高。并维持至34天。
图4 人工感染细粒棘球绦虫的家犬不同时间粪抗原检测结果
1，2，4为感染犬，3为对照犬
Fig4 Results of coproantigen detection in dogs artificially infected with protoscoplex of E.granulosus at different time
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1,2,4infected dogs,3control dog
2.3.2 5只实验感染泡状带绦虫的犬从感染后第20天开始检测粪抗原，至50天皆为阴性(见图5)。
图5 人工感染泡状带绦虫的家犬不同时间粪抗原检测结果
1—5为5只家犬的检测结果
Fig 5 Results of coproantigen detection in dogs artificially infected with T.hydatigena in different days after infection
1—5lls the samples of different dogs infected
, 百拇医药 这5只家犬驱出泡状带绦虫数分别为3条、8条、2条、7条和10条。
3 讨论
用细粒棘球绦虫成虫虫体抗原及其抗体系统建立的双抗体夹心ELISA在人工模拟犬粪标本中检出成虫虫体抗原的下限达5～2.5ng/ml[1]，检测的OD值与抗原含量之间呈指数曲线关系并高度相关(r=0.98)。由此估计实验感染细粒棘球绦虫的家犬粪抗原含量在2.5～8.0μg/ml之间，自然感染的家犬粪抗原含量在1.12～5.0μg/ml之间[2]，因此，本方法在用于检出家犬感染上具有足够的敏感性。
最主要的交叉反应是泡状带绦虫的感染。泡状带绦虫是我国西北地区主要的家犬肠道寄生蠕虫。而且经常与细粒棘球绦虫同时寄生。因此消除二者之间的交叉反应十分重要。选择最适的抗体包被量，提高反应的阳性临界值可以达到这个目标。
, 百拇医药 家犬实验感染细粒棘球蚴原头节后粪抗原即呈现阳性，21天后显著上升。表明犬肠道中成虫发育水平与粪抗原的量相关。感染21天后检出的阳性率将显著提高。通过对本法的敏感性、特异性的进一步实验观察，作者认为本法可用于家犬细粒棘球绦虫感染的诊断。
卫生部科研基金资助项目(96-1-371)
参考文献
1.焦伟等.粪抗原检测诊断犬细粒棘球绦虫感染的研究Ⅰ.用细粒棘球绦虫虫体抗原抗体系统检测粪抗原方法的建立.地方病通报，1998，12(2)：16.
2.焦伟等.粪抗原检测诊断犬细粒棘球绦虫感染的研究Ⅲ.双抗体夹心ELISA法检测粪抗原诊断家犬细粒棘球绦虫感染的现场评价.中国人兽共患病杂志，待发表., http://www.100md.com