肺小细胞癌p53基因分析与mdm-2基因蛋白表达的关系
作者：杨廷桐 张俊 郑杰 吴秉铨
单位：杨廷桐 张俊 郑杰(北京医科大学病理系，北京 100083)；吴秉铨(新乡医学院病理学教研室，新乡 453003)
关键词：肺肿瘤；癌；小细胞；基因；p53；mdm-2蛋白
临床与实验病理学杂志990412摘要 目的：探讨肺小细胞癌(SCLC)的p53基因改变与mdm-2基因蛋白表达的关系。方法：应用免疫组化LSAB法和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析的方法，对14例SCLC的石蜡切片组织进行研究。结果：免疫组化染色p53蛋白阳性9例，阳性率为64.3%(9/14)；mdm-2蛋白阳性4例，阳性率为28.6%(4/14)。p53基因第5、6、7、8外显子，突变率分别为21.4%(3/14)；14.3(2/14)；14.3%(2/14)；7.1%(1/14)，总突变率为57.1%(8/14)。结论：SCLC中存在较高的p53基因突变率和mdm-2基因蛋白的明显表达。
, 百拇医药
分类号 R734.2；R392.31 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)04-0315-03
Relationship of the analyse of p53 gene and the expression of mdm-2 gene protein in small cell lung cancer
Yang Tingtong
(Dept of Pathol, Xinxiang Medical College, Xinxiang 453003)
Zhang Jun, 2Zheng Jie et al
(Dept of Pathol, Beijing Medical University, Beijing 100083)
, 百拇医药
ABSTRACT Purpose To discuss the relationship between the change of p53 gene and the expression of murine double minute 2 (mdm-2) gene protein in small cell lung cancer (SCLC). Methods The p53 gene and mdm-2 protein in 14 paraffin embedded tissue sections were observed by immunohistochemical (IHC) staining (LSAB method) and polymerase chain reaction and single strand conformation polymorsphism (PCR-SSCP) analysis. Results IHC: The positivity rate of p53 was 64.3%(9/14); the positivity rate of mdm-2 was 28.6%(4/14). p53 gene point mutation in exon 5, 6, 7 and 8 were 21.4%(3/14), 14.3%(2/14), 14.3%(2/14), 7.1%(1/14) respectively. The total mutation rate was 57.1%(8/14). Conclusion The compartively high mutation rate of p53 gene exists in SCLC, and the obvious expression of mdm-2 gene protein.
, http://www.100md.com
KEY WORDS lung neoplasms; carcinoma, small cell; genes, p53; mdm-2 protein
近年来在肺癌的诊治方面已有许多先进的方法、技术问世，但其疗效仍很差，尤其是肺小细胞癌(SCLC)〔1〕。为进一步探讨SCLC发生的分子机理，p53基因突变与mdm-2基因蛋白表达之间的关系，及其在生物学行为上的意义，我们应用免疫组化(IHC)和聚合酶链-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析的方法，对14例SCLC的石蜡包埋组织标本进行研究。
1 材料和方法
1.1 材料 源于湖北省肿瘤医院1988～1993年手术切除的125例肺癌石蜡包埋组织标本，参照《诊断病理学》〔2〕标准重新诊断分类。选出其中SCLC 14例，占11.2%(14/125)，做为研究对象。
, http://www.100md.com
1.2 IHC主要试剂 鼠抗人p53单克隆抗体，(Do-7，Dako公司)，鼠抗人mdm-2单克隆抗体(Oncogene Science)，生物素标记的兔抗鼠IgG(Link， Reagent公司)。采用LSAB法。阳性标准：10%～25%细胞核着色为+，25%～50%细胞核着色为
，>50%细胞核着色为
。
1.3 DNA制备 采用酚-氯仿提取法。切取石蜡癌组织10 μm厚5～10片，放入1.5 ml离心管中，蜕蜡及脱水后加入400 μl lysis buffer, 8 μl 20 g.L-1蛋白酶K，37℃彻底消化，具体方法详见《分子生物学实验技术》〔3〕。
1.4 PCR-SSCP检测
, 百拇医药
1.4.1 PCR扩增p53基因5～8外显子，应用4对引物(由北京医科大学病理系分子生物室合成)，其序列如下：exon 5: 5′TACTCCCCTGCCCTCAAC-AAGA3′, 5′CGCTATCTFAC|GCAGCGCTCAT3′; exon 6: 5′GATTGCTCTTAGGTCTGGCCCCT3′, 5′CAGACCTCAGGCGGCTCATAGG3′; exon 7: 5′CTGGGTTGGCTCTGACTGTACCA3′, 5′TGACC-TGGAGTCGTTCCAGTGTG3′; exon 8: 5′GATG-
TGGTAATCTACTGGGACGGA3′, 5′CTCGCTTA-GTGCTCCCTGGGGGC3′。
1.4.2 PCR扩增反应条件 95℃ 2 min，95℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 30 s，30个循环，72℃延伸5 min。
1.4.3 PCR-SSCP分析 取5 μl PCR扩增产物加5 μl SSCP上样液，100℃冰浴10 min，冰浴后立即上样于垂直电泳槽中的SSCP胶孔中，恒压50 V，恒温15℃，电泳液为0.5×TBE约为800 ml，电泳12 h。
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1.4.4 银染 取出电泳胶，固定12 h后，用0.1%硝酸银染色30 min，均在脱色摇床上进行，1%乙酸终止反应，封胶。
1.4.5 结果判断 每次电泳的肿瘤标本，都以正常肺组织扩增产物作为对照，若同时电泳的肿瘤标本与正常相比较，出现条带增多、减少或位置变动，即说明该样品存在基因突变。
2 结果
2.1 免疫组化染色结果 p53蛋白与mdm-2蛋白阳性均呈现位于细胞核内的棕黄色颗粒。在14例SCLC中p53蛋白阳性有9例，其中2例为+，7例为～，阳性率为64.3%(9/14)；mdm-2蛋白阳性反应有4例，其中1例为+，3例为～，阳性率为28.6%(4/14)。而在p53蛋白阳性的9例中，mdm-2蛋白阳性2例(22.2%)，阴性7例(77.8%)；p53蛋白阴性的5例中，mdm-2蛋白阳性2例(40%)，阴性3例(60%)。上述结果可以看出肺小细胞癌中有较高的p53蛋白表达率和mdm-2蛋白的明显表达。在p53蛋白表达阳性中mdm-2蛋白阳性只有22.2%，而p53蛋白阴性表达中mdm-2蛋白阳性占40%。
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2.2 p53基因PCR-SSCP分析与mdm-2蛋白表达关系 在14例SCLC中，PCR-SSCP分析p53基因第5～8外显子，阴性者6例，占42.9%。阳性者8例，其中第5～8外显子突变率分别为3例(21.4%)；2例(14.3%)；2例(14.3%)；1例(7.1%)，总突变率为57.1%(图1，2)。在PCR-SSCP检测p53基因阳性的8例中，mdm-2阳性1例(12.5%)，阴性7例(87.5%)。而在6例阴性中，mdm-2阳性3例(50%)，mdm-2阴性3例(50%)。由此可见，SCLC中存在着高p53基因突变率。在p53基因阳性8例中，mdm-2蛋白只有1例阳性，占12.5%；而在其阴性的6例中，mdm-2蛋白阳性3例，占50%，两者之间似乎呈负相关性。
图1 p53基因第5外显子
的PCR-SSCP检测结果
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N表示正常对照；箭头所指为泳动变位
图2 p53基因第6外显子
的PCR-SSCP检测结果
N表示正常对照；箭头所指为泳动变位
2.3 p53蛋白、mdm-2蛋白表达和p53基因突变率与SCLC临床病理特征的关系 与患者的年龄、性别、肿瘤的大小等无明显的相关性。3 讨论
mdm-2基因编码一个锌蛋白，通过结合或掩饰p53转录活化区而负性调节p53〔4〕。mdm-2 mRNA在人的肺、肝、肌肉及胰腺有表达，约有1/3左右的肉瘤中有mdm-2基因扩增，并且这些肉瘤往往不伴有突变型p53(MT-p53)，而含有野生型p53(WT-p53)〔5〕。在我们所用IHC检测的14例SCLC中p53蛋白有较高表达率(64.3%)，mdm-2蛋白亦呈明显的表达(28.6%)。而p53呈阳性表达的9例中，mdm-2阳性2例，阳性率为22.2%；p53呈阴性表达的5例中，mdm-2阳性2例，阳性率40%。p53是公认的抑癌基因，对细胞周期起负调节作用，抑制细胞过度生长，当其功能失活时就导致肿瘤发生。mdm-2在SCLC中明显表达，引起肿瘤发生。在肿瘤发生过程中与p53之间的关系，我们支持Momand等〔5，6〕提出的p53-mdm-2自动调节环假说，WT-p53作用于WT-mdm-2并正性调节其转录活性。WT-p53升高，激发更多的mdm-2 mRNA，mdm-2蛋白水平升高，反过来与p53蛋白结合而降低其转录能力。mdm-2基因产物p90与p53结合形成p90-p53复合体，使p53失去与靶DNA结合能力，进而丧失转录激活机制和抑制细胞生长转化功能，从而使细胞恶变。在不伴有p53基因突变的肺癌中mdm-2起何种作用，尚待进一步探讨。
, 百拇医药
我们应用PCR-SSCP对14例SCLC的p53基因第5～8外显子进行了检测，其突变率达57.1%，比Kishimoto等〔7〕检测的NSCLC p53基因第5～8外显子的52.0%突变为高，所以在SCLC发生中MT-p53是一种重要的关键性基因。在PCR-SSCP检测有p53突变的8例中，mdm-2蛋白阳性1例(12.5%)；而未检测出突变的6例中，mdm-2蛋白阳性3例(50%)。说明mdm-2既能与WT-p53也能与MT-p53作用〔8〕。本文结果提示mdm-2蛋白的明显表达在没有p53突变的肺癌发生过程中起重要作用。其发生机制可能是mdm-2具有与DNA结合的能力，可直接作用于靶DNA，促进DNA合成和细胞生长，从而拮抗p53效应；当mdm-2明显表达时，产生类似p53突变失活效应，使细胞发生转化和恶变。
作者简介：杨廷桐，男，45岁，教授。研究方向：癌侵袭转移的生物学特性
参考文献
, http://www.100md.com
1，Lin AY, Ihde DC. Recent developments in the treatment of lung cancer. JAMA, 1992;267:1661
2，刘彤华.诊断病理学.北京：人民卫生出版社，1994：183
3，姚志建，沈倍奋，刘亚霞等译.分子生物学实验技术.北京：科学出版社, 1990：205
4，Boddy MN, Freemoot PS, Borden KLB et al. The p53-associated protein mdm-2 contains a newly characterized zincbinding domain called the RING finger. Trends Biochem Sci, 1994;19:198
5，Oliner JD, Kinzler KW, Meltzer PS et al. Amplification of a gene encoding a p53-associated protein in human sarcoma. Nature, 1992;358:80
, http://www.100md.com
6，Momand J, Zambett GP, Olson DC et al. The mdm-2 oncogene product forms a complec with the p53 protein and inhibits p53 mediated transac tivation. Cell, 1992;69:1 237
7，Kishimoto Y, Murakami Y, Shiraishi M et al. Aberration of the p53 tumor suppressor gene in human non-small cell lung carcinomas of the lung cancer. Cancer Res, 1992;52:4 799
8，Matsumura T, Yoshihama Y, Kimura T et al. p53 and mdm-2 expression in oral squamous cell carcinoma. Oncology, 1996;53:308
收稿日期：1998-07-30
修回日期：1998-12-02, http://www.100md.com
单位：杨廷桐 张俊 郑杰(北京医科大学病理系，北京 100083)；吴秉铨(新乡医学院病理学教研室，新乡 453003)
关键词：肺肿瘤；癌；小细胞；基因；p53；mdm-2蛋白
临床与实验病理学杂志990412摘要 目的：探讨肺小细胞癌(SCLC)的p53基因改变与mdm-2基因蛋白表达的关系。方法：应用免疫组化LSAB法和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析的方法，对14例SCLC的石蜡切片组织进行研究。结果：免疫组化染色p53蛋白阳性9例，阳性率为64.3%(9/14)；mdm-2蛋白阳性4例，阳性率为28.6%(4/14)。p53基因第5、6、7、8外显子，突变率分别为21.4%(3/14)；14.3(2/14)；14.3%(2/14)；7.1%(1/14)，总突变率为57.1%(8/14)。结论：SCLC中存在较高的p53基因突变率和mdm-2基因蛋白的明显表达。
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分类号 R734.2；R392.31 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)04-0315-03
Relationship of the analyse of p53 gene and the expression of mdm-2 gene protein in small cell lung cancer
Yang Tingtong
(Dept of Pathol, Xinxiang Medical College, Xinxiang 453003)
Zhang Jun, 2Zheng Jie et al
(Dept of Pathol, Beijing Medical University, Beijing 100083)
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ABSTRACT Purpose To discuss the relationship between the change of p53 gene and the expression of murine double minute 2 (mdm-2) gene protein in small cell lung cancer (SCLC). Methods The p53 gene and mdm-2 protein in 14 paraffin embedded tissue sections were observed by immunohistochemical (IHC) staining (LSAB method) and polymerase chain reaction and single strand conformation polymorsphism (PCR-SSCP) analysis. Results IHC: The positivity rate of p53 was 64.3%(9/14); the positivity rate of mdm-2 was 28.6%(4/14). p53 gene point mutation in exon 5, 6, 7 and 8 were 21.4%(3/14), 14.3%(2/14), 14.3%(2/14), 7.1%(1/14) respectively. The total mutation rate was 57.1%(8/14). Conclusion The compartively high mutation rate of p53 gene exists in SCLC, and the obvious expression of mdm-2 gene protein.
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KEY WORDS lung neoplasms; carcinoma, small cell; genes, p53; mdm-2 protein
近年来在肺癌的诊治方面已有许多先进的方法、技术问世，但其疗效仍很差，尤其是肺小细胞癌(SCLC)〔1〕。为进一步探讨SCLC发生的分子机理，p53基因突变与mdm-2基因蛋白表达之间的关系，及其在生物学行为上的意义，我们应用免疫组化(IHC)和聚合酶链-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析的方法，对14例SCLC的石蜡包埋组织标本进行研究。
1 材料和方法
1.1 材料 源于湖北省肿瘤医院1988～1993年手术切除的125例肺癌石蜡包埋组织标本，参照《诊断病理学》〔2〕标准重新诊断分类。选出其中SCLC 14例，占11.2%(14/125)，做为研究对象。
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1.2 IHC主要试剂 鼠抗人p53单克隆抗体，(Do-7，Dako公司)，鼠抗人mdm-2单克隆抗体(Oncogene Science)，生物素标记的兔抗鼠IgG(Link， Reagent公司)。采用LSAB法。阳性标准：10%～25%细胞核着色为+，25%～50%细胞核着色为
，>50%细胞核着色为。1.3 DNA制备 采用酚-氯仿提取法。切取石蜡癌组织10 μm厚5～10片，放入1.5 ml离心管中，蜕蜡及脱水后加入400 μl lysis buffer, 8 μl 20 g.L-1蛋白酶K，37℃彻底消化，具体方法详见《分子生物学实验技术》〔3〕。
1.4 PCR-SSCP检测
, 百拇医药
1.4.1 PCR扩增p53基因5～8外显子，应用4对引物(由北京医科大学病理系分子生物室合成)，其序列如下：exon 5: 5′TACTCCCCTGCCCTCAAC-AAGA3′, 5′CGCTATCTFAC|GCAGCGCTCAT3′; exon 6: 5′GATTGCTCTTAGGTCTGGCCCCT3′, 5′CAGACCTCAGGCGGCTCATAGG3′; exon 7: 5′CTGGGTTGGCTCTGACTGTACCA3′, 5′TGACC-TGGAGTCGTTCCAGTGTG3′; exon 8: 5′GATG-
TGGTAATCTACTGGGACGGA3′, 5′CTCGCTTA-GTGCTCCCTGGGGGC3′。
1.4.2 PCR扩增反应条件 95℃ 2 min，95℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 30 s，30个循环，72℃延伸5 min。
1.4.3 PCR-SSCP分析 取5 μl PCR扩增产物加5 μl SSCP上样液，100℃冰浴10 min，冰浴后立即上样于垂直电泳槽中的SSCP胶孔中，恒压50 V，恒温15℃，电泳液为0.5×TBE约为800 ml，电泳12 h。
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1.4.4 银染 取出电泳胶，固定12 h后，用0.1%硝酸银染色30 min，均在脱色摇床上进行，1%乙酸终止反应，封胶。
1.4.5 结果判断 每次电泳的肿瘤标本，都以正常肺组织扩增产物作为对照，若同时电泳的肿瘤标本与正常相比较，出现条带增多、减少或位置变动，即说明该样品存在基因突变。
2 结果
2.1 免疫组化染色结果 p53蛋白与mdm-2蛋白阳性均呈现位于细胞核内的棕黄色颗粒。在14例SCLC中p53蛋白阳性有9例，其中2例为+，7例为～，阳性率为64.3%(9/14)；mdm-2蛋白阳性反应有4例，其中1例为+，3例为～，阳性率为28.6%(4/14)。而在p53蛋白阳性的9例中，mdm-2蛋白阳性2例(22.2%)，阴性7例(77.8%)；p53蛋白阴性的5例中，mdm-2蛋白阳性2例(40%)，阴性3例(60%)。上述结果可以看出肺小细胞癌中有较高的p53蛋白表达率和mdm-2蛋白的明显表达。在p53蛋白表达阳性中mdm-2蛋白阳性只有22.2%，而p53蛋白阴性表达中mdm-2蛋白阳性占40%。
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2.2 p53基因PCR-SSCP分析与mdm-2蛋白表达关系 在14例SCLC中，PCR-SSCP分析p53基因第5～8外显子，阴性者6例，占42.9%。阳性者8例，其中第5～8外显子突变率分别为3例(21.4%)；2例(14.3%)；2例(14.3%)；1例(7.1%)，总突变率为57.1%(图1，2)。在PCR-SSCP检测p53基因阳性的8例中，mdm-2阳性1例(12.5%)，阴性7例(87.5%)。而在6例阴性中，mdm-2阳性3例(50%)，mdm-2阴性3例(50%)。由此可见，SCLC中存在着高p53基因突变率。在p53基因阳性8例中，mdm-2蛋白只有1例阳性，占12.5%；而在其阴性的6例中，mdm-2蛋白阳性3例，占50%，两者之间似乎呈负相关性。
图1 p53基因第5外显子
的PCR-SSCP检测结果
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N表示正常对照；箭头所指为泳动变位
图2 p53基因第6外显子
的PCR-SSCP检测结果
N表示正常对照；箭头所指为泳动变位
2.3 p53蛋白、mdm-2蛋白表达和p53基因突变率与SCLC临床病理特征的关系 与患者的年龄、性别、肿瘤的大小等无明显的相关性。3 讨论
mdm-2基因编码一个锌蛋白，通过结合或掩饰p53转录活化区而负性调节p53〔4〕。mdm-2 mRNA在人的肺、肝、肌肉及胰腺有表达，约有1/3左右的肉瘤中有mdm-2基因扩增，并且这些肉瘤往往不伴有突变型p53(MT-p53)，而含有野生型p53(WT-p53)〔5〕。在我们所用IHC检测的14例SCLC中p53蛋白有较高表达率(64.3%)，mdm-2蛋白亦呈明显的表达(28.6%)。而p53呈阳性表达的9例中，mdm-2阳性2例，阳性率为22.2%；p53呈阴性表达的5例中，mdm-2阳性2例，阳性率40%。p53是公认的抑癌基因，对细胞周期起负调节作用，抑制细胞过度生长，当其功能失活时就导致肿瘤发生。mdm-2在SCLC中明显表达，引起肿瘤发生。在肿瘤发生过程中与p53之间的关系，我们支持Momand等〔5，6〕提出的p53-mdm-2自动调节环假说，WT-p53作用于WT-mdm-2并正性调节其转录活性。WT-p53升高，激发更多的mdm-2 mRNA，mdm-2蛋白水平升高，反过来与p53蛋白结合而降低其转录能力。mdm-2基因产物p90与p53结合形成p90-p53复合体，使p53失去与靶DNA结合能力，进而丧失转录激活机制和抑制细胞生长转化功能，从而使细胞恶变。在不伴有p53基因突变的肺癌中mdm-2起何种作用，尚待进一步探讨。
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我们应用PCR-SSCP对14例SCLC的p53基因第5～8外显子进行了检测，其突变率达57.1%，比Kishimoto等〔7〕检测的NSCLC p53基因第5～8外显子的52.0%突变为高，所以在SCLC发生中MT-p53是一种重要的关键性基因。在PCR-SSCP检测有p53突变的8例中，mdm-2蛋白阳性1例(12.5%)；而未检测出突变的6例中，mdm-2蛋白阳性3例(50%)。说明mdm-2既能与WT-p53也能与MT-p53作用〔8〕。本文结果提示mdm-2蛋白的明显表达在没有p53突变的肺癌发生过程中起重要作用。其发生机制可能是mdm-2具有与DNA结合的能力，可直接作用于靶DNA，促进DNA合成和细胞生长，从而拮抗p53效应；当mdm-2明显表达时，产生类似p53突变失活效应，使细胞发生转化和恶变。
作者简介：杨廷桐，男，45岁，教授。研究方向：癌侵袭转移的生物学特性
参考文献
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1，Lin AY, Ihde DC. Recent developments in the treatment of lung cancer. JAMA, 1992;267:1661
2，刘彤华.诊断病理学.北京：人民卫生出版社，1994：183
3，姚志建，沈倍奋，刘亚霞等译.分子生物学实验技术.北京：科学出版社, 1990：205
4，Boddy MN, Freemoot PS, Borden KLB et al. The p53-associated protein mdm-2 contains a newly characterized zincbinding domain called the RING finger. Trends Biochem Sci, 1994;19:198
5，Oliner JD, Kinzler KW, Meltzer PS et al. Amplification of a gene encoding a p53-associated protein in human sarcoma. Nature, 1992;358:80
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6，Momand J, Zambett GP, Olson DC et al. The mdm-2 oncogene product forms a complec with the p53 protein and inhibits p53 mediated transac tivation. Cell, 1992;69:1 237
7，Kishimoto Y, Murakami Y, Shiraishi M et al. Aberration of the p53 tumor suppressor gene in human non-small cell lung carcinomas of the lung cancer. Cancer Res, 1992;52:4 799
8，Matsumura T, Yoshihama Y, Kimura T et al. p53 and mdm-2 expression in oral squamous cell carcinoma. Oncology, 1996;53:308
收稿日期：1998-07-30
修回日期：1998-12-02, http://www.100md.com