星形胶质细胞瘤恶性程度与细胞凋亡、细胞增殖的相关性研究
作者：刘鹏翀 刘砚 吴克兰
单位：刘鹏翀 吴克兰(同济医科大学病理学教研室，武汉 430030)；刘砚(辽宁省锦州医学院附属医院内科，锦州 121000)
关键词：神经胶质瘤；细胞凋亡；凋亡指数；增殖指数
临床与实验病理学杂志990406摘要 目的：探讨星形胶质细胞瘤的恶性程度与细胞凋亡、细胞增殖的相关性。方法：利用DNA凝胶电泳确定34例肿瘤细胞群体中细胞凋亡的存在，使用体视学方法计数凋亡指数(AI)、增殖指数(MI)、AI/MI比率。结果：DNA凝胶电泳26例显示特征性的DNA梯带， AI、MI分别随肿瘤恶性程度增加而递增，且AI与MI呈正相关，但AI/MI随恶性度增高而降低。结论：肿瘤细胞群体中存在细胞凋亡，恶性肿瘤中细胞的增殖远活跃于细胞凋亡。AI/MI比率提示了细胞凋亡与增殖的关系。
分类号 R739.41 文献标识码 A
, 百拇医药
文章编号 1001-7399(1999)04-0298-03
Correlation among apoptosis、cell proliferation and the degrees of malignancy in astrocytoma
Liu Pengchong, Liu Yan, Wu Kelan
(Dept of Pathol, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
ABSTRACT Purpose To study the correlation among apoptosis, proliferation and the degrees of malignancy in astrocytoma. Methods The existence of apoptotic cells was determined by DNA gel electrophoresis in 34 cases of astrocytoma. Apoptotic index (AI), mitotic index (MI) and AI/MI ratio were calculated by microscope. Results DNA ladder was demonstrated in 26 cases. AI and MI gradually increased with the malignant degrees of astrocytoma respectively, but AI/MI ratio decreased. There was a positive correlation between the apoptotic and MI. Conclusion Mitotic activity in malignant tumors prevails over apoptosis. The behavior of the AI/MI ratio suggests a relationship between apoptosis and cell proliferation.
, 百拇医药
KEY WORDS glioma; apoptosis; apoptotic index; mitotic index
肿瘤的发生是细胞增殖的结果，同时与细胞凋亡的丧失有关。研究细胞凋亡是从细胞增殖的反面探讨生命活动中细胞死亡的方式和机制〔1〕。本文作者利用体视学及生物化学方法对星形胶质细胞瘤中的细胞凋亡、细胞增殖进行观察，以探讨星形胶质细胞瘤中细胞群体的生长状态，确定肿瘤的发生与细胞增殖、凋亡的相关性。
1 材料和方法
1.1 材料 提取DNA所用34例新鲜组织，均取自我校附属同济医院1996～1997年神经外科手术切除肿瘤，-70℃冻存备用，其中2例经2.5%戊二醛固定，锇酸染色，常规电镜包埋制片，Opton EM 10C型透射电镜观察。
相应手术标本的部分组织，经FAA固定，石蜡包埋，切片厚4 μm，HE染色，经病理检查证实为星形胶质细胞瘤。Ⅰ～Ⅱ级星形胶质细胞瘤19例，Ⅲ级间变型星形胶质细胞瘤7例，Ⅳ级多形性胶质母细胞瘤8例。
, 百拇医药
1.2 DNA的提取和DNA凝胶电泳 取100 mg冻存的新鲜组织，在冰浴条件下用消毒剪刀充分剪碎，置于匀浆器中，注入10倍体积的裂解液和蛋白酶K(终浓度为120 mg.L-1)，55 ℃过夜，DNA按常规酚-氯仿-异丙醇法提取，并用无水乙醇沉淀总量DNA。取样品DNA 10 μl，点样于1.5%的琼脂糖凝胶电泳，EB显色观察。
1.3 凋亡细胞形态学观察及AI、MI的计数 根据凋亡细胞的形态学特点，应用光镜和电镜观察凋亡细胞的细胞核、胞浆及细胞器的变化和凋亡小体，并利用10 mm×10 mm的接目测微器在光学显微镜下计数，每张切片凋亡细胞分布不均，有明显的区域性，凋亡细胞计数排除坏死区、坏死周边及肿瘤附近的正常组织中的凋亡细胞和凋亡小体，凡肿瘤区的凋亡细胞和凋亡小体均参与评估，累计10个高倍视野(40×10倍)的凋亡细胞、凋亡小体、分裂细胞、总的细胞数。
, 百拇医药
1.4 统计学方法 采用相关系数分析
2 结果
2.1 DNA凝胶电泳 DNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB显色，紫外光检测仪检测。26例标本可见到明显的DNA梯带，而7例Ⅰ～Ⅱ级星形胶质细胞瘤标本及1例Ⅲ级间变型星形胶质细胞瘤标本未见DNA梯带。
2.2 凋亡细胞的光镜检查 光镜下观察的凋亡细胞胞体皱缩，核内染色质呈浓缩的新月形和不规则的串珠状，伴有强嗜伊红的胞浆，与肿瘤细胞分开，周边有明显的空晕环绕(图1)，凋亡小体含有崩解的浓缩的染色质，有强嗜伊红的胞浆包绕。而肿瘤组织中核分裂象多为病理核分裂象，其染色质分布不均，周边不整齐(图2)，籍此可与凋亡细胞区分。
图1 凋亡细胞(↑)强嗜伊红的胞浆,与肿瘤细胞分开,周边有明显的空晕环绕,核染色质断裂成圆形小体.HE×400
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图2 核分裂后期细胞.HE×400
2.3 凋亡细胞的电镜检查 电镜观察凋亡细胞体积缩小，微绒毛消失，胞核内染色质浓缩，边集于核膜下，呈帽状、新月状，胞浆紧实，细胞器集中，线粒体完整呈正常状态，凋亡小体内含有完整的细胞器和核碎片(图3)。
图3 凋亡细胞体积缩小,核染色体浓缩,边集于核膜下,胞浆紧实,细胞器集中.EM×10 000
2.4 凋亡细胞的计数 计数凋亡细胞、凋亡小体、分裂细胞和总的细胞数，得出AI、MI、AI/MI。结果见表1。
表1 星形胶质细胞瘤中AI、MI、AI/MI 肿瘤分组
n
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AI(%)
MI(%)
AI/MI
Ⅰ～Ⅱ级星形胶质细胞瘤
19
0.03(0～0.08)
0.14
0.21
间变型星形胶质细胞瘤
7
0.07(0～0.11)
1.82
, 百拇医药
0.04
多形性胶质母细胞瘤
8
0.12(0～0.20)
2.1
0.06
r=0.898，P<0.013 讨论
肿瘤组织的细胞凋亡是细胞主动死亡过程，在整个过程中发生一系列特殊基因的表达以及生化和形态学改变，对其检测的手段已经从单纯形态学辨认发展到形态与生化的结合，直至目前的形态、生化与分子生物学技术相结合的各种手段〔2〕。而形态学判断是凋亡检测的经典标准，也是其他各种检测方法的基础。测定细胞凋亡的同时必须检测该细胞群体细胞增殖状态，对照该细胞群体的增殖指数和凋亡指数，从而确定肿瘤与被检测细胞群体细胞增殖、凋亡的相关性〔3〕。
, 百拇医药
3.1 肿瘤的发生与细胞凋亡的相关性 在肿瘤组织中，细胞凋亡既是机体抗恶变的防御机制，又是限制肿瘤生长的因素，细胞恶变可以通过细胞凋亡来阻止。肿瘤的发生是细胞增殖的结果，也与自发性凋亡的丧失有关。现在普遍认为细胞凋亡与细胞增殖能力密切相关。恶变细胞被凋亡信号致敏，在适当刺激下此恶变细胞对死亡敏感，从而导致恶变细胞死亡〔1〕。
细胞发生凋亡，内源性核酸内切酶激活而发生DNA断裂，断裂点都有规律地发生在核小体之间，因此出现180～200 bp及其倍数的DNA片断，在凝胶电泳中出现特征性的DNA梯带，而坏死细胞的DNA断裂为无特征的杂乱片断。利用此特征，既可以确定群体细胞的凋亡，又可与细胞坏死区别〔4，5〕。本组病变电泳结果显示26例星形胶质细胞瘤出现特征性的DNA梯带，8例阴性，此可能与组织中凋亡细胞数少有关。虽然电泳方法缺乏定位特性，在病理形态学中价值不大，但可以确定群体细胞凋亡的存在，以便进一步分析细胞的凋亡。
, http://www.100md.com 3.2 星形胶质细胞瘤良、恶性与细胞群体AI、MI的相关性 34例胶质细胞瘤根据WHO分级标准分为Ⅰ～Ⅱ级星形胶质细胞瘤、Ⅲ级间变型星形胶质细胞瘤、Ⅳ级多形性胶质母细胞瘤。表1显示细胞群体AI、MI及AI/MI比率，AI高的肿瘤其MI也高，并且MI一般高于AI。将AI、MI进行相关系数分析，r=0.898，P<0.01，两者之间正相关，与Kiberu等〔7〕对非霍奇金淋巴瘤的AI、MI相关系数分析(r=0.606)的结果基本一致。Ⅰ～Ⅱ级星形胶质细胞瘤AI低，AI/MI高，而多形性胶质母细胞瘤AI高，AI/MI低，说明随着肿瘤恶性程度的增加，细胞凋亡和细胞增殖同时增多，而且恶性肿瘤中细胞增殖远远活跃于细胞凋亡。AI/MI比率揭示了细胞凋亡与增殖的关系，本实验结果与在非霍奇金淋巴瘤中评估AI、AI/MI得出的结论基本一致〔1〕。
本文计数AI、AI/MI比率，为评价肿瘤细胞动力学及生物学行为提供一个新的检测手段，作者以10 mm×10 mm接目测微器下40×10倍视野单位面积的总细胞数为基数，既提高了分辨率，又对计数的凋亡细胞数和分裂细胞数进行校正，提高了AI及MI的准确率，减少误差，有人提出用20×10倍视野下计数，增加总细胞数，但对凋亡细胞的分辨率差，增加了人为因素造成的误差。
, 百拇医药
总之，星形胶质细胞瘤中控制细胞凋亡和增殖的分子生物学机制是复杂的，细胞恶变可以通过细胞凋亡来阻止。作者利用光学显微镜计数AI、AI/MI比率，客观地评价肿瘤细胞的增殖状态，从而确定肿瘤的生物学行为，为病理诊断和临床治疗、预后评估提供一个新的科学而有意义的检测途径。
作者简介：刘鹏
，女，32岁，硕士
吴克兰，女，60岁，教授。研究方向：中枢神经系统疾病的病理诊断和发病机制
参考文献
1，Schiffer D, Cavalla P, Migheli A et al. Apoptosis and cell proliferation in human neuroepithelial tumors. Neuroscience Letters,1995;195:81～84
, 百拇医药
2，吴 波. 细胞凋亡检测技术进展及其应用. 临床与实验病理学杂志，1997；13(3)：262
3，Chandler D, EL-Naggar AK, Brisbag S et al. Apoptosis and expression of the bcl-2 protooncogene in the fetal adult human kidney. Hum Pathol,1994;25:789
4，Gerschenson LE, Rotello RJ. Apoptosis: A different type of cell death. FASEB,1992;6:2454
5，Cummigs MC, Winterford CM, Walker NI. Apoptosis. Am J Surg Pathol,1997;21:88
, 百拇医药
6，Majno G, Joris I. Apoptosis, oncosis and necrosis: An overview of cell death. Am J Pathol,1995;146:3
7，Kiberx SW, Pringle JH, Sobolewski S et al. Correlation between apoptosis, proliferation and bcl-2 expression in malignant non-Hodgkins lymphoma. J Clin Pathol, Mol Pathol,1996;49:M268～M272
收稿日期：1998-06-02, 百拇医药
单位：刘鹏翀 吴克兰(同济医科大学病理学教研室，武汉 430030)；刘砚(辽宁省锦州医学院附属医院内科，锦州 121000)
关键词：神经胶质瘤；细胞凋亡；凋亡指数；增殖指数
临床与实验病理学杂志990406摘要 目的：探讨星形胶质细胞瘤的恶性程度与细胞凋亡、细胞增殖的相关性。方法：利用DNA凝胶电泳确定34例肿瘤细胞群体中细胞凋亡的存在，使用体视学方法计数凋亡指数(AI)、增殖指数(MI)、AI/MI比率。结果：DNA凝胶电泳26例显示特征性的DNA梯带， AI、MI分别随肿瘤恶性程度增加而递增，且AI与MI呈正相关，但AI/MI随恶性度增高而降低。结论：肿瘤细胞群体中存在细胞凋亡，恶性肿瘤中细胞的增殖远活跃于细胞凋亡。AI/MI比率提示了细胞凋亡与增殖的关系。
分类号 R739.41 文献标识码 A
, 百拇医药
文章编号 1001-7399(1999)04-0298-03
Correlation among apoptosis、cell proliferation and the degrees of malignancy in astrocytoma
Liu Pengchong, Liu Yan, Wu Kelan
(Dept of Pathol, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
ABSTRACT Purpose To study the correlation among apoptosis, proliferation and the degrees of malignancy in astrocytoma. Methods The existence of apoptotic cells was determined by DNA gel electrophoresis in 34 cases of astrocytoma. Apoptotic index (AI), mitotic index (MI) and AI/MI ratio were calculated by microscope. Results DNA ladder was demonstrated in 26 cases. AI and MI gradually increased with the malignant degrees of astrocytoma respectively, but AI/MI ratio decreased. There was a positive correlation between the apoptotic and MI. Conclusion Mitotic activity in malignant tumors prevails over apoptosis. The behavior of the AI/MI ratio suggests a relationship between apoptosis and cell proliferation.
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KEY WORDS glioma; apoptosis; apoptotic index; mitotic index
肿瘤的发生是细胞增殖的结果，同时与细胞凋亡的丧失有关。研究细胞凋亡是从细胞增殖的反面探讨生命活动中细胞死亡的方式和机制〔1〕。本文作者利用体视学及生物化学方法对星形胶质细胞瘤中的细胞凋亡、细胞增殖进行观察，以探讨星形胶质细胞瘤中细胞群体的生长状态，确定肿瘤的发生与细胞增殖、凋亡的相关性。
1 材料和方法
1.1 材料 提取DNA所用34例新鲜组织，均取自我校附属同济医院1996～1997年神经外科手术切除肿瘤，-70℃冻存备用，其中2例经2.5%戊二醛固定，锇酸染色，常规电镜包埋制片，Opton EM 10C型透射电镜观察。
相应手术标本的部分组织，经FAA固定，石蜡包埋，切片厚4 μm，HE染色，经病理检查证实为星形胶质细胞瘤。Ⅰ～Ⅱ级星形胶质细胞瘤19例，Ⅲ级间变型星形胶质细胞瘤7例，Ⅳ级多形性胶质母细胞瘤8例。
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1.2 DNA的提取和DNA凝胶电泳 取100 mg冻存的新鲜组织，在冰浴条件下用消毒剪刀充分剪碎，置于匀浆器中，注入10倍体积的裂解液和蛋白酶K(终浓度为120 mg.L-1)，55 ℃过夜，DNA按常规酚-氯仿-异丙醇法提取，并用无水乙醇沉淀总量DNA。取样品DNA 10 μl，点样于1.5%的琼脂糖凝胶电泳，EB显色观察。
1.3 凋亡细胞形态学观察及AI、MI的计数 根据凋亡细胞的形态学特点，应用光镜和电镜观察凋亡细胞的细胞核、胞浆及细胞器的变化和凋亡小体，并利用10 mm×10 mm的接目测微器在光学显微镜下计数，每张切片凋亡细胞分布不均，有明显的区域性，凋亡细胞计数排除坏死区、坏死周边及肿瘤附近的正常组织中的凋亡细胞和凋亡小体，凡肿瘤区的凋亡细胞和凋亡小体均参与评估，累计10个高倍视野(40×10倍)的凋亡细胞、凋亡小体、分裂细胞、总的细胞数。
, 百拇医药
1.4 统计学方法 采用相关系数分析
2 结果
2.1 DNA凝胶电泳 DNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB显色，紫外光检测仪检测。26例标本可见到明显的DNA梯带，而7例Ⅰ～Ⅱ级星形胶质细胞瘤标本及1例Ⅲ级间变型星形胶质细胞瘤标本未见DNA梯带。
2.2 凋亡细胞的光镜检查 光镜下观察的凋亡细胞胞体皱缩，核内染色质呈浓缩的新月形和不规则的串珠状，伴有强嗜伊红的胞浆，与肿瘤细胞分开，周边有明显的空晕环绕(图1)，凋亡小体含有崩解的浓缩的染色质，有强嗜伊红的胞浆包绕。而肿瘤组织中核分裂象多为病理核分裂象，其染色质分布不均，周边不整齐(图2)，籍此可与凋亡细胞区分。
图1 凋亡细胞(↑)强嗜伊红的胞浆,与肿瘤细胞分开,周边有明显的空晕环绕,核染色质断裂成圆形小体.HE×400
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图2 核分裂后期细胞.HE×400
2.3 凋亡细胞的电镜检查 电镜观察凋亡细胞体积缩小，微绒毛消失，胞核内染色质浓缩，边集于核膜下，呈帽状、新月状，胞浆紧实，细胞器集中，线粒体完整呈正常状态，凋亡小体内含有完整的细胞器和核碎片(图3)。
图3 凋亡细胞体积缩小,核染色体浓缩,边集于核膜下,胞浆紧实,细胞器集中.EM×10 000
2.4 凋亡细胞的计数 计数凋亡细胞、凋亡小体、分裂细胞和总的细胞数，得出AI、MI、AI/MI。结果见表1。
表1 星形胶质细胞瘤中AI、MI、AI/MI 肿瘤分组
n
, http://www.100md.com
AI(%)
MI(%)
AI/MI
Ⅰ～Ⅱ级星形胶质细胞瘤
19
0.03(0～0.08)
0.14
0.21
间变型星形胶质细胞瘤
7
0.07(0～0.11)
1.82
, 百拇医药
0.04
多形性胶质母细胞瘤
8
0.12(0～0.20)
2.1
0.06
r=0.898，P<0.013 讨论
肿瘤组织的细胞凋亡是细胞主动死亡过程，在整个过程中发生一系列特殊基因的表达以及生化和形态学改变，对其检测的手段已经从单纯形态学辨认发展到形态与生化的结合，直至目前的形态、生化与分子生物学技术相结合的各种手段〔2〕。而形态学判断是凋亡检测的经典标准，也是其他各种检测方法的基础。测定细胞凋亡的同时必须检测该细胞群体细胞增殖状态，对照该细胞群体的增殖指数和凋亡指数，从而确定肿瘤与被检测细胞群体细胞增殖、凋亡的相关性〔3〕。
, 百拇医药
3.1 肿瘤的发生与细胞凋亡的相关性 在肿瘤组织中，细胞凋亡既是机体抗恶变的防御机制，又是限制肿瘤生长的因素，细胞恶变可以通过细胞凋亡来阻止。肿瘤的发生是细胞增殖的结果，也与自发性凋亡的丧失有关。现在普遍认为细胞凋亡与细胞增殖能力密切相关。恶变细胞被凋亡信号致敏，在适当刺激下此恶变细胞对死亡敏感，从而导致恶变细胞死亡〔1〕。
细胞发生凋亡，内源性核酸内切酶激活而发生DNA断裂，断裂点都有规律地发生在核小体之间，因此出现180～200 bp及其倍数的DNA片断，在凝胶电泳中出现特征性的DNA梯带，而坏死细胞的DNA断裂为无特征的杂乱片断。利用此特征，既可以确定群体细胞的凋亡，又可与细胞坏死区别〔4，5〕。本组病变电泳结果显示26例星形胶质细胞瘤出现特征性的DNA梯带，8例阴性，此可能与组织中凋亡细胞数少有关。虽然电泳方法缺乏定位特性，在病理形态学中价值不大，但可以确定群体细胞凋亡的存在，以便进一步分析细胞的凋亡。
, http://www.100md.com 3.2 星形胶质细胞瘤良、恶性与细胞群体AI、MI的相关性 34例胶质细胞瘤根据WHO分级标准分为Ⅰ～Ⅱ级星形胶质细胞瘤、Ⅲ级间变型星形胶质细胞瘤、Ⅳ级多形性胶质母细胞瘤。表1显示细胞群体AI、MI及AI/MI比率，AI高的肿瘤其MI也高，并且MI一般高于AI。将AI、MI进行相关系数分析，r=0.898，P<0.01，两者之间正相关，与Kiberu等〔7〕对非霍奇金淋巴瘤的AI、MI相关系数分析(r=0.606)的结果基本一致。Ⅰ～Ⅱ级星形胶质细胞瘤AI低，AI/MI高，而多形性胶质母细胞瘤AI高，AI/MI低，说明随着肿瘤恶性程度的增加，细胞凋亡和细胞增殖同时增多，而且恶性肿瘤中细胞增殖远远活跃于细胞凋亡。AI/MI比率揭示了细胞凋亡与增殖的关系，本实验结果与在非霍奇金淋巴瘤中评估AI、AI/MI得出的结论基本一致〔1〕。
本文计数AI、AI/MI比率，为评价肿瘤细胞动力学及生物学行为提供一个新的检测手段，作者以10 mm×10 mm接目测微器下40×10倍视野单位面积的总细胞数为基数，既提高了分辨率，又对计数的凋亡细胞数和分裂细胞数进行校正，提高了AI及MI的准确率，减少误差，有人提出用20×10倍视野下计数，增加总细胞数，但对凋亡细胞的分辨率差，增加了人为因素造成的误差。
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总之，星形胶质细胞瘤中控制细胞凋亡和增殖的分子生物学机制是复杂的，细胞恶变可以通过细胞凋亡来阻止。作者利用光学显微镜计数AI、AI/MI比率，客观地评价肿瘤细胞的增殖状态，从而确定肿瘤的生物学行为，为病理诊断和临床治疗、预后评估提供一个新的科学而有意义的检测途径。
作者简介：刘鹏
，女，32岁，硕士吴克兰，女，60岁，教授。研究方向：中枢神经系统疾病的病理诊断和发病机制
参考文献
1，Schiffer D, Cavalla P, Migheli A et al. Apoptosis and cell proliferation in human neuroepithelial tumors. Neuroscience Letters,1995;195:81～84
, 百拇医药
2，吴 波. 细胞凋亡检测技术进展及其应用. 临床与实验病理学杂志，1997；13(3)：262
3，Chandler D, EL-Naggar AK, Brisbag S et al. Apoptosis and expression of the bcl-2 protooncogene in the fetal adult human kidney. Hum Pathol,1994;25:789
4，Gerschenson LE, Rotello RJ. Apoptosis: A different type of cell death. FASEB,1992;6:2454
5，Cummigs MC, Winterford CM, Walker NI. Apoptosis. Am J Surg Pathol,1997;21:88
, 百拇医药
6，Majno G, Joris I. Apoptosis, oncosis and necrosis: An overview of cell death. Am J Pathol,1995;146:3
7，Kiberx SW, Pringle JH, Sobolewski S et al. Correlation between apoptosis, proliferation and bcl-2 expression in malignant non-Hodgkins lymphoma. J Clin Pathol, Mol Pathol,1996;49:M268～M272
收稿日期：1998-06-02, 百拇医药