用Medimachine系统制备实体组织的单细胞悬液
作者：李宾 周春喜
单位：李宾 周春喜(解放军总医院医学实验测试中心流式细胞室，北京 100853)
关键词：单细胞悬液；medimachine系统；流式细胞术
临床与实验病理学杂志床990429分类号 R446.8 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)04-0352-02
流式细胞术(flow cytometry, FCM)作为一种可在单细胞水平上对大量细胞进行快速、准确、多参数定量分析和分选的高技术，在细胞生物学、免疫学、肿瘤学等方面的应用日趋广泛和深入。进行FCM分析的前提是样品为单细胞悬液，而大多数实体组织都难以制成高质量的单细胞悬液样本，因而大大限制了FCM对实体组织特别是实体瘤的分析和研究〔1〕。
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实体组织单细胞样本制备一般采用手工方法，主要有机械剪切法、酶消化法、去污剂化学处理法、针头抽吸法等〔2〕。但上述方法均存在组织用量多，制样过程繁琐耗时，细胞产率及实验重复性低等问题。我室采用Medimachine系统(丹麦Dako)，仅在数分钟内即完成了新鲜和冻存实体组织单细胞悬液的样本制备，样本完全适合FCM分析，结果满意。
1 Medimachine系统
1.1 结构和工作原理 Medimachine系统是采用机械剪切的方法将剪成小块的实体组织制备成单细
胞或单细胞核悬液的自动化系统。样品制备过程不需加任何消化酶或去污剂等，它由Medimachine、Medicon及Filcon 3部分组成。其中Medimachine为主机，后两者为配件。Medicon为一圆形聚乙烯元件，底部设有一个固定的不锈钢网筛，上有约100个正六边形筛孔(直径约为1 mm)，每个筛孔周围有6个经特殊设计的微型刀片以进行精细的组织切割，主机则可以每分钟100转的转速带动Medicon中轴的旋转片转动。Filcon为一直径1.5 cm的细胞过滤器，可按不同孔径对组织细胞混悬液进行过滤。
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1.2 使用方法 先将新鲜的组织冲洗干净或将冻存的组织解冻，去除脂肪及坏死组织，取一小块组织(约10 mm3)，与约1 ml PBS一起加入Medicon，将Medicon插入Medimachine中，把开关转向运行位置，运行5～30 s(时间因样品而定)，关机，取出Medicon,用注射器吸出混悬液，用相应孔径的Filcon过滤，400 g离心5 min，以PBS或细胞培养液悬浮即制得单细胞悬液。
1.3 技术关键 使用Medimachine系统时，除了要预先将组织块清洗干净，去除脂肪及坏死组织外，针对不同的组织，还要注意从以下几方面摸索实验的条件。1.3.1 为使细胞保持活性，操作应冰镇条件下进行。
1.3.2 采用Medimachine系统通常用数秒至数十秒的时间方可将组织块剪切成单细胞。由于不同的组织其组成及结构差异很大，且新鲜及冻存组织亦不同，要经过摸索选择合适的剪切时间。如新鲜胃癌组织的剪切时间(18 s)就长于新鲜肺癌组织(10 s)，时间太短则组织破碎不全，细胞产率低；时间太长则细胞碎片增多，不仅同样影响细胞产率，还会影响样本的质量。
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1.3.3 由于Medicon的总容积为2 ml，因而将剪碎的组织块加入Medicon时所用的缓冲液或培养液的体积不应超过2 ml，以0.5～1.5 ml为宜，体积过多或过少都不利于组织的完全剪切。
1.3.4 剪切后的组织细胞悬液用去针头的注射器由Medicon的侧孔吸出，经Filcon过滤。分离人体细胞应选择50 μm和70 μm孔径的Filcon。
1.3.5 用Filcon过滤后，细胞悬液中通常会有一些微小的细胞及组织碎片，可进一步采用缓速离心的方法(400～600 r.min-1)，通过控制离心力和离心的时间，使细胞沉降而使碎片悬浮在上清液中而将大部分碎片去除，从而进一步提高样本的质量。2 结果
我们利用B-D公司的FACSCalibur型流式细胞仪，对Medimachine系统制备的单细胞悬液进行了检验测试，结果显示(图1)，在FSC/SSC二维散射光图中，除小部分碎片外，所制备细胞形态均匀，集中成群，完全适合流式细胞术进一步进行表面标记或细胞周期等分析，结果满意。
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图1 Medimachine系统制备不同类型组织单细胞
悬液的流式二维散射光图
a：人肺癌新鲜组织，b：小鼠C57肺癌新鲜组织，c：人肺癌-80℃冻存组织，d：小鼠C57肺癌-80℃冻存组织
3 讨论
采用Medimachine系统制备单细胞悬液的最显著的特点是〔3〕：(1)操作简便快捷，大大缩短了FCM分析时间，对新鲜标本可在1 h内报告结果。(2)使样本制备过程标准化、程序化，减少人为因素的影响，变操作者依赖性为非操作者依赖性，也使各个实验室的方法能统一起来，便于相互间进行实验结果的比较及交流。(3)所需标本量少，一般有几个立方毫米大小的组织块就足够了，活检及镜检组织均可适用。(4)无需酶和化学试剂等的处理，不会损伤细胞膜表面的结构，这对于要进行免疫分析的标本特别重要。(5)所制备的细胞不仅适用于FCM，还可进行组化 分析及细胞培养等。 近年来肿瘤的各类生物分子标志物及癌基因、抑癌基因的研究进展迅速，并已开始应用于肿瘤的临床病理诊断、判定疗效、预测预后、转移等方面。流式细胞术则为上述研究及应用提供了先进有效的方法。然而传统的实体瘤组织单细胞悬液制备手段不能很好地满足FCM对样品分析的需要，Medimachine系统则为实体瘤的FCM分析提供了一项新的样品制备手段。
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作者简介：李 宾，32岁，硕士，助理研究员
参考文献
1，Visscher DW, Zarbo RJ, Jacobsen G et al. Multiparameter deoxyribouncleic acid and cell cycle analysis of breast carcinomas by flow cytometry. Lab Invest, 1990；62：370～378
2，Engelholm SA, Spang Thomsen M, Brunner M et al. Disaggregation of human solid tumor by combind mechanical and enzymatic methods. Br J Cancer,1985;51:93～98
3，Ottosen GL, Christensen IJ, Larsen JK et al. Tissue disaggregation for flow cytometric analysis: comparison of fine needle aspiration and an automated mechanical procedure. Cytometry,1996;26:65～68
收稿日期：1998-09-03, 百拇医药
单位：李宾 周春喜(解放军总医院医学实验测试中心流式细胞室，北京 100853)
关键词：单细胞悬液；medimachine系统；流式细胞术
临床与实验病理学杂志床990429分类号 R446.8 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)04-0352-02
流式细胞术(flow cytometry, FCM)作为一种可在单细胞水平上对大量细胞进行快速、准确、多参数定量分析和分选的高技术，在细胞生物学、免疫学、肿瘤学等方面的应用日趋广泛和深入。进行FCM分析的前提是样品为单细胞悬液，而大多数实体组织都难以制成高质量的单细胞悬液样本，因而大大限制了FCM对实体组织特别是实体瘤的分析和研究〔1〕。
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实体组织单细胞样本制备一般采用手工方法，主要有机械剪切法、酶消化法、去污剂化学处理法、针头抽吸法等〔2〕。但上述方法均存在组织用量多，制样过程繁琐耗时，细胞产率及实验重复性低等问题。我室采用Medimachine系统(丹麦Dako)，仅在数分钟内即完成了新鲜和冻存实体组织单细胞悬液的样本制备，样本完全适合FCM分析，结果满意。
1 Medimachine系统
1.1 结构和工作原理 Medimachine系统是采用机械剪切的方法将剪成小块的实体组织制备成单细
胞或单细胞核悬液的自动化系统。样品制备过程不需加任何消化酶或去污剂等，它由Medimachine、Medicon及Filcon 3部分组成。其中Medimachine为主机，后两者为配件。Medicon为一圆形聚乙烯元件，底部设有一个固定的不锈钢网筛，上有约100个正六边形筛孔(直径约为1 mm)，每个筛孔周围有6个经特殊设计的微型刀片以进行精细的组织切割，主机则可以每分钟100转的转速带动Medicon中轴的旋转片转动。Filcon为一直径1.5 cm的细胞过滤器，可按不同孔径对组织细胞混悬液进行过滤。
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1.2 使用方法 先将新鲜的组织冲洗干净或将冻存的组织解冻，去除脂肪及坏死组织，取一小块组织(约10 mm3)，与约1 ml PBS一起加入Medicon，将Medicon插入Medimachine中，把开关转向运行位置，运行5～30 s(时间因样品而定)，关机，取出Medicon,用注射器吸出混悬液，用相应孔径的Filcon过滤，400 g离心5 min，以PBS或细胞培养液悬浮即制得单细胞悬液。
1.3 技术关键 使用Medimachine系统时，除了要预先将组织块清洗干净，去除脂肪及坏死组织外，针对不同的组织，还要注意从以下几方面摸索实验的条件。1.3.1 为使细胞保持活性，操作应冰镇条件下进行。
1.3.2 采用Medimachine系统通常用数秒至数十秒的时间方可将组织块剪切成单细胞。由于不同的组织其组成及结构差异很大，且新鲜及冻存组织亦不同，要经过摸索选择合适的剪切时间。如新鲜胃癌组织的剪切时间(18 s)就长于新鲜肺癌组织(10 s)，时间太短则组织破碎不全，细胞产率低；时间太长则细胞碎片增多，不仅同样影响细胞产率，还会影响样本的质量。
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1.3.3 由于Medicon的总容积为2 ml，因而将剪碎的组织块加入Medicon时所用的缓冲液或培养液的体积不应超过2 ml，以0.5～1.5 ml为宜，体积过多或过少都不利于组织的完全剪切。
1.3.4 剪切后的组织细胞悬液用去针头的注射器由Medicon的侧孔吸出，经Filcon过滤。分离人体细胞应选择50 μm和70 μm孔径的Filcon。
1.3.5 用Filcon过滤后，细胞悬液中通常会有一些微小的细胞及组织碎片，可进一步采用缓速离心的方法(400～600 r.min-1)，通过控制离心力和离心的时间，使细胞沉降而使碎片悬浮在上清液中而将大部分碎片去除，从而进一步提高样本的质量。2 结果
我们利用B-D公司的FACSCalibur型流式细胞仪，对Medimachine系统制备的单细胞悬液进行了检验测试，结果显示(图1)，在FSC/SSC二维散射光图中，除小部分碎片外，所制备细胞形态均匀，集中成群，完全适合流式细胞术进一步进行表面标记或细胞周期等分析，结果满意。
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图1 Medimachine系统制备不同类型组织单细胞
悬液的流式二维散射光图
a：人肺癌新鲜组织，b：小鼠C57肺癌新鲜组织，c：人肺癌-80℃冻存组织，d：小鼠C57肺癌-80℃冻存组织
3 讨论
采用Medimachine系统制备单细胞悬液的最显著的特点是〔3〕：(1)操作简便快捷，大大缩短了FCM分析时间，对新鲜标本可在1 h内报告结果。(2)使样本制备过程标准化、程序化，减少人为因素的影响，变操作者依赖性为非操作者依赖性，也使各个实验室的方法能统一起来，便于相互间进行实验结果的比较及交流。(3)所需标本量少，一般有几个立方毫米大小的组织块就足够了，活检及镜检组织均可适用。(4)无需酶和化学试剂等的处理，不会损伤细胞膜表面的结构，这对于要进行免疫分析的标本特别重要。(5)所制备的细胞不仅适用于FCM，还可进行组化 分析及细胞培养等。 近年来肿瘤的各类生物分子标志物及癌基因、抑癌基因的研究进展迅速，并已开始应用于肿瘤的临床病理诊断、判定疗效、预测预后、转移等方面。流式细胞术则为上述研究及应用提供了先进有效的方法。然而传统的实体瘤组织单细胞悬液制备手段不能很好地满足FCM对样品分析的需要，Medimachine系统则为实体瘤的FCM分析提供了一项新的样品制备手段。
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作者简介：李 宾，32岁，硕士，助理研究员
参考文献
1，Visscher DW, Zarbo RJ, Jacobsen G et al. Multiparameter deoxyribouncleic acid and cell cycle analysis of breast carcinomas by flow cytometry. Lab Invest, 1990；62：370～378
2，Engelholm SA, Spang Thomsen M, Brunner M et al. Disaggregation of human solid tumor by combind mechanical and enzymatic methods. Br J Cancer,1985;51:93～98
3，Ottosen GL, Christensen IJ, Larsen JK et al. Tissue disaggregation for flow cytometric analysis: comparison of fine needle aspiration and an automated mechanical procedure. Cytometry,1996;26:65～68
收稿日期：1998-09-03, 百拇医药