原位PCR技术在检测非小细胞肺癌p16基因中的应用
作者：冯久贤 包国良 时梅萍 董强刚 沙慧芳 江晓丰
单位：冯久贤 包国良 时梅萍 董强刚 沙慧芳 江晓丰(上海市胸科医院、上海市胸部肿瘤研究所 200030)
关键词：肺肿瘤；基因；抑制；肿瘤；聚合酶链反应
临床与实验病理学杂志990428
分类号 R734.3；R394.2 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)04-0351-02
原位PCR是近年来建立的新技术，我们应用该技术在非小细胞肺癌中检测抑癌基因p16的表达，取得较满意的结果。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 组织标本 收集本院胸外科手术切除标本835例，均经病理证实，其中腺癌21例，鳞癌14例。男23例，女12例，年龄为43～75岁，平均60.7岁。手术标本在恒冷切片机上制备5 μm厚冷冻切片，贴于多聚赖氨酸处理的载玻片上，然后以4%多聚甲醛固定10 min，空气干燥后保存在-20℃。
1.2 试剂和仪器 p16基因exon2引物由美国Cybersyn BJ合成，引物序列为〔1〕5′-TGGCTCTGACCATTCTGT(S)；5′-AGCTTTGGAAGCTCTCAG(AS)。Taq DNA聚合酶，标记物地高辛(Dig-11-DUTP)及检测试剂盒为Boenringer Mannhein公司产品，PCR扩增仪为PE-TC1。。
1.3 实验方法 冷冻切片室温干燥后用0.1 mol.L-1 Tris、0.3% Tween-20、0.5% NP-40温育，蛋白酶K溶液(10 mg.L-1)37℃消化10 min，缓冲液洗涤，用1×PCR缓冲液洗3次，用滤纸吸取切片上多余缓冲液。应用原位盖片(HYBAID公司产品)把PCR反应液密封于组织切片上。PCR反应液含p16引物Taq DNA酶，Dig labeliming Mix和PCR缓冲液共50 μl。PCR反应条件为94℃ 5 min后，按94℃ 2 min，37℃ 2 min，72℃ 3 min共10个循环，72℃延伸10 min。原位扩增后洗片，封闭，Anti-DigAP亲和再洗片，NBT-BCIP显色均按检测试剂盒说明书操作，显色良好后水洗中止反应，封片镜检。
, 百拇医药
1.4 对照组 (1)一般对照，抽提所检标本DNA作p16基因液相PCR。(2)原位PCR中设置无引物对照和无DNA聚合酶对照。(3)原位PCR循环次数设30个对照。
2 结果
2.1 方法特异性 无引物对照组除切片边缘因组织损伤有少许紫蓝色颗粒外，其余无阳性信号。无DNA聚合酶对照组切片中均无阳性信号。
2.2 非小细胞肺癌中p16基因的表达 用原位PCR检测35例标本中p16基因阳性表达的有27例(77.2%)，阳性信号为紫蓝色呈块状或颗粒网状，主要定位于细胞核。在阳性病例中p16基因表达的癌细胞约占总细胞数的5%～30%，并非所有癌细胞均有表达。用同一标本作液相PCR检测，在8例阴性病例为p16纯合性缺失。1例原位PCR阳性但阳性细胞分布局限，液相PCR检测结果亦为阴性。液相PCR检测有2例点突变，但在原位PCR中仍可见阳性细胞。在原位PCR检测中，当循环次数增加到30次时，则PCR产物弥散导致非特性背景，并使阳性细胞连成块状。当循环次数为10个时，原位PCR扩增后反应液在2%琼脂糖电泳时未见阳性条带。
, 百拇医药
3 讨论
原位PCR技术由Haase等〔2〕于1990年首先报道，该方法将PCR技术的高效扩增与原位杂交技术的细胞定位相结合，在组织细胞原位检测靶DNA，同时还可对含靶序列的组织细胞进行形态学分析。由于常规PCR需在液相中进行，在进行PCR扩增前必须将细胞破坏，从中抽提核酸作为模板，因此不能将PCR结果与组织细胞形态结构特征联系起来，故原位PCR的建立为同时研究基因信息和细胞的形态信息提供了有力的工具。
与常规PCR相比较，直接法原位PCR在技术操作上复杂得多，为了减少其假阳性，本文采取以下措施：(1)优化蛋白酶K的消化时间和浓度，这样可以防止与核酸交联组蛋白破坏而产生内源性核酸片段，并能保持形态学结构。(2)退火温度低于常规PCR的55℃，采用37℃(原位杂交温度)，这样可以防止引物与模板错配。(3)PCR循环次数减少到10次，当PCR循环数大于30个时容易引起原位扩增后的PCR产物游离模板位置及弥散至模板以外位置充当模板而被扩增，从而产生假阳性结果。本文采用低循环次数，并在原位PCR中掺入地高辛标记的核苷酸，从而产生带有复杂大分子的PCR产物，这样，阳性信号定位良好，背景干扰少。p16基因位于9q21区域，由3个外显子和2个内含子组成，它编码p16蛋白的主要作用是抑制周期蛋白依赖性激酶的活性与cyclinD竞争CDK4，使CDK4-cyclinD复合物的形成受阻，控制细胞进入合成期。一旦p16基因发生改变而不能正常表达，细胞增殖的负调控机制失败，从而为癌细胞失控性增殖提供了有利条件。在非小细胞肺癌中，国内外报道p16基因的改变频率为30%，主要为纯合性缺失和点突变。本文原位PCR检测p16基因阴性表达为8例(22.8%)，主要反映了纯合性缺失的情况。而对内源性基因重排，因为在所有细胞内都有未重排的靶序列存在，而引物也会与相应的模板发生特异性结合，并在DNA聚合酶作用下延伸，这样就给基因重排检测带来了困难〔4〕。通过原位PCR检测p16基因，结果表明在非小细胞肺癌中大部分癌细胞均有p16基因纯合性缺失。
, 百拇医药
图1 肺腺癌,部分癌细胞及间质细胞p16阳性.原位PCR×200
作者简介：冯久贤，男，50岁，副主任医师
参考文献
1，Washimi O, Nagatake M, Osada H et al. In vivo occurrence of p16 (NST1)and p15 (MST2) alterations preferentially in non small cell lung cancer. Cancer Res,1994;55(3):514
2，Haase AT, Reazel EF, Staskus KA. Amplification detection of lentivival DNA inside cell. Proc Sci USA,1990;87:4971～4975
3，李立家，宋运淳. 原位PCR技术及其应用. 国外医学分子生物学分册，1998；20：91
4，苏慧慈，刘彦仿主编. 原位PCR. 北京：科学出版社，1995：85
收稿日期：1998-10-21
修回日期：1999-02-01, 百拇医药
单位：冯久贤 包国良 时梅萍 董强刚 沙慧芳 江晓丰(上海市胸科医院、上海市胸部肿瘤研究所 200030)
关键词：肺肿瘤；基因；抑制；肿瘤；聚合酶链反应
临床与实验病理学杂志990428
分类号 R734.3；R394.2 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)04-0351-02
原位PCR是近年来建立的新技术，我们应用该技术在非小细胞肺癌中检测抑癌基因p16的表达，取得较满意的结果。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 组织标本 收集本院胸外科手术切除标本835例，均经病理证实，其中腺癌21例，鳞癌14例。男23例，女12例，年龄为43～75岁，平均60.7岁。手术标本在恒冷切片机上制备5 μm厚冷冻切片，贴于多聚赖氨酸处理的载玻片上，然后以4%多聚甲醛固定10 min，空气干燥后保存在-20℃。
1.2 试剂和仪器 p16基因exon2引物由美国Cybersyn BJ合成，引物序列为〔1〕5′-TGGCTCTGACCATTCTGT(S)；5′-AGCTTTGGAAGCTCTCAG(AS)。Taq DNA聚合酶，标记物地高辛(Dig-11-DUTP)及检测试剂盒为Boenringer Mannhein公司产品，PCR扩增仪为PE-TC1。。
1.3 实验方法 冷冻切片室温干燥后用0.1 mol.L-1 Tris、0.3% Tween-20、0.5% NP-40温育，蛋白酶K溶液(10 mg.L-1)37℃消化10 min，缓冲液洗涤，用1×PCR缓冲液洗3次，用滤纸吸取切片上多余缓冲液。应用原位盖片(HYBAID公司产品)把PCR反应液密封于组织切片上。PCR反应液含p16引物Taq DNA酶，Dig labeliming Mix和PCR缓冲液共50 μl。PCR反应条件为94℃ 5 min后，按94℃ 2 min，37℃ 2 min，72℃ 3 min共10个循环，72℃延伸10 min。原位扩增后洗片，封闭，Anti-DigAP亲和再洗片，NBT-BCIP显色均按检测试剂盒说明书操作，显色良好后水洗中止反应，封片镜检。
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1.4 对照组 (1)一般对照，抽提所检标本DNA作p16基因液相PCR。(2)原位PCR中设置无引物对照和无DNA聚合酶对照。(3)原位PCR循环次数设30个对照。
2 结果
2.1 方法特异性 无引物对照组除切片边缘因组织损伤有少许紫蓝色颗粒外，其余无阳性信号。无DNA聚合酶对照组切片中均无阳性信号。
2.2 非小细胞肺癌中p16基因的表达 用原位PCR检测35例标本中p16基因阳性表达的有27例(77.2%)，阳性信号为紫蓝色呈块状或颗粒网状，主要定位于细胞核。在阳性病例中p16基因表达的癌细胞约占总细胞数的5%～30%，并非所有癌细胞均有表达。用同一标本作液相PCR检测，在8例阴性病例为p16纯合性缺失。1例原位PCR阳性但阳性细胞分布局限，液相PCR检测结果亦为阴性。液相PCR检测有2例点突变，但在原位PCR中仍可见阳性细胞。在原位PCR检测中，当循环次数增加到30次时，则PCR产物弥散导致非特性背景，并使阳性细胞连成块状。当循环次数为10个时，原位PCR扩增后反应液在2%琼脂糖电泳时未见阳性条带。
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3 讨论
原位PCR技术由Haase等〔2〕于1990年首先报道，该方法将PCR技术的高效扩增与原位杂交技术的细胞定位相结合，在组织细胞原位检测靶DNA，同时还可对含靶序列的组织细胞进行形态学分析。由于常规PCR需在液相中进行，在进行PCR扩增前必须将细胞破坏，从中抽提核酸作为模板，因此不能将PCR结果与组织细胞形态结构特征联系起来，故原位PCR的建立为同时研究基因信息和细胞的形态信息提供了有力的工具。
与常规PCR相比较，直接法原位PCR在技术操作上复杂得多，为了减少其假阳性，本文采取以下措施：(1)优化蛋白酶K的消化时间和浓度，这样可以防止与核酸交联组蛋白破坏而产生内源性核酸片段，并能保持形态学结构。(2)退火温度低于常规PCR的55℃，采用37℃(原位杂交温度)，这样可以防止引物与模板错配。(3)PCR循环次数减少到10次，当PCR循环数大于30个时容易引起原位扩增后的PCR产物游离模板位置及弥散至模板以外位置充当模板而被扩增，从而产生假阳性结果。本文采用低循环次数，并在原位PCR中掺入地高辛标记的核苷酸，从而产生带有复杂大分子的PCR产物，这样，阳性信号定位良好，背景干扰少。p16基因位于9q21区域，由3个外显子和2个内含子组成，它编码p16蛋白的主要作用是抑制周期蛋白依赖性激酶的活性与cyclinD竞争CDK4，使CDK4-cyclinD复合物的形成受阻，控制细胞进入合成期。一旦p16基因发生改变而不能正常表达，细胞增殖的负调控机制失败，从而为癌细胞失控性增殖提供了有利条件。在非小细胞肺癌中，国内外报道p16基因的改变频率为30%，主要为纯合性缺失和点突变。本文原位PCR检测p16基因阴性表达为8例(22.8%)，主要反映了纯合性缺失的情况。而对内源性基因重排，因为在所有细胞内都有未重排的靶序列存在，而引物也会与相应的模板发生特异性结合，并在DNA聚合酶作用下延伸，这样就给基因重排检测带来了困难〔4〕。通过原位PCR检测p16基因，结果表明在非小细胞肺癌中大部分癌细胞均有p16基因纯合性缺失。
, 百拇医药
图1 肺腺癌,部分癌细胞及间质细胞p16阳性.原位PCR×200
作者简介：冯久贤，男，50岁，副主任医师
参考文献
1，Washimi O, Nagatake M, Osada H et al. In vivo occurrence of p16 (NST1)and p15 (MST2) alterations preferentially in non small cell lung cancer. Cancer Res,1994;55(3):514
2，Haase AT, Reazel EF, Staskus KA. Amplification detection of lentivival DNA inside cell. Proc Sci USA,1990;87:4971～4975
3，李立家，宋运淳. 原位PCR技术及其应用. 国外医学分子生物学分册，1998；20：91
4，苏慧慈，刘彦仿主编. 原位PCR. 北京：科学出版社，1995：85
收稿日期：1998-10-21
修回日期：1999-02-01, 百拇医药