单链抗体及其应用
作者：陈小红 邹毅
单位：浙江省中医院血液病研究室(310006)
关键词：
实用医学杂志990441 自从Kohler，Milstein首先创立杂交瘤技术以来，人们对抗体在理论和实践应用上都取得了极大的进展。抗体是四链结构的，由二条220个氨基酸残基的轻链和二条约440个氨基酸残基的重链构成，这些链中，每110个氨基酸折叠成一个三维构象上保守的结构域，这些结构域缔合成为不连续的结构域串。抗体中，抗原结合的那个片段能从变性的状态下复制出来，并达到和天然构象大致相当的结合活力。而且人们知道，保持抗原结合活力的最小部分是由重链可变区和轻链可变区组成的约25 000 Da的Fv。八十年代以来，人们开始试探仅用重链可变区和轻链可变区片段来组成抗原结合分子。起先，抗体基因从杂交瘤细胞中克隆到以后，装入载体中以整体的形式得到表达产物。1988年Skerra等首先用细菌表达的重链可变区和轻链可变区在体外重组出有功能的非共价结合的重组分子，这为在基因工程水平上改造抗体开创了先河。但因为非共价结合的重链可变区和轻链可变区片段很容易分离，在同一年，Bird和Huston先后发表了由一条连接肽把重链可变区和轻链可变区连接起来的小分子肽，称为ScFv(single chain variable fragment)。它由一条连接肽把重链可变区和轻链可变区连接起来，使它更容易地在体外重组成为有活性的分子[1]。至此，人们从基因水平上操作抗体已开始变得成熟。
, 百拇医药
1 ScFv的结构
ScFv是由重链可变区和轻链可变区构成的小分子，它仍然保持着天然抗体的特异性和大致相似亲和力。重链可变区和轻链可变区折叠成相对独立的结构域，由一条亲水性的柔软的连接肽相连，从而形成和天然抗体中抗原结合位点相似的结构。重链可变区和轻链可变区都可以成为ScFv的N-端[2]。重链可变区和轻链可变区的可变性是相对于轻链和重链的恒定区而言的。它们的氨基酸变化频率在不同的抗体中比较大，但就轻链或重链的可变区本身而言，它们的氨基酸变化率在不同的位置有明显的不同。对可变区的序列比较后发现，有的区域比较保守，在不同的抗体中大致相似，称它们为框架区。轻链和重链中都有四个框架区：FR1，FR2，FR3和FR4。另外一些区域，它们的变化率在不同的抗体中比较大，称它们为超变区。又因为它们与抗体的特异性有关，即与抗原相匹配，因而人们称它们为互补决定区(complementary determined region，CDR)。轻链有三个超变区：CDR1，CDR2，CDR3。具有刚性的β-折叠片的框架区和环形的互补决定区构成整个轻链和重链可变区。这种区域的结构，非常适合于蛋白的改造。例如改造成Fv、Fab等带结合部位的分子，或把结合部位从一个抗体转移到另一个抗体上。
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值得一提的是Orlandi等[3]对Kabat data base进行分析后得出一组万用引物，现在被许多人引用，可作克隆重链可变区和轻链可变区的大部分家属成员的引物。因为在引物中设计了酶切位点等原因造成突变，Froyen等[4]证明，这种突变对ScFv的结合能力没有影响。
根据单体Fv的构象，连接肽要跨越从一个可变区的C-端到另一个可变区的N-端的约35～40A的距离[1]，连接肽的选择十分关键，它的要求是有柔软性，不干扰轻重链的折叠，不降低产物的可溶性。1996年，Tang等[5]用噬菌体展示技术(Phage display)的方法，对一个连接肽库作了筛选，结果得到很多结合能力较强的ScFv的连接肽。这些连接肽的共同特征是第2位的氨基酸是脯氨酸，另一端精氨酸和脯氨酸丰富，其它无明显的特征。第2位的脯氨酸可能与大角度的旋转有关，而带电的精氨酸的聚集，则和连接肽的柔软性和亲水性相关。
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ScFv的低聚物表现出浓度依赖性。双价ScFv是由一条ScFv的可变区相互断开并重接到另一ScFv的可变区上形成的，而更多的ScFv的可变区的重排和重接形成了3价或多价聚合物。在双价或多价聚合物中的Fv，是一条Fv的轻链和另一条Fv的重链组成的。
2 ScFv的表达系统
大部分用于基因工程的表达载体已被用于表达ScFv，而且因为ScFv的分子量小，组装和折叠的条件温和，能适应比其它大部分分子更广谱的表达载体[6]。
2.1 细菌 因为大肠杆菌价廉、表达量大、操作方便，至今报道的大部分是在大肠杆菌中表达的。值得指出的是，从八十年代中期出现一种叫做噬菌体展示技术(Phage display)的方法，Clackson等[7]首先把它用到ScFv的表达中来。它是用基因工程改造的噬菌体载体，再用辅助者(Helper)噬菌体的帮助，结果使ScFv在噬菌体的衣壳蛋白G3P的顶部表达。这种ScFv已具有结合活性，因此能很方便地从一个库中筛选出需要的ScFv噬菌粒(Phagemid)来。又因为ScFv后有一个琥珀型的终止子，因此在非抑制型的菌株中能表达出游离的ScFv。在细菌中建立ScFv的表达系统有着极为广泛的新应用，可为研究结构和功能之间的关系提供大量高质量的抗原结合蛋白，而且成本低廉。
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2.2 酵母 酵母作为真核生物有它的优点，如糖基化，又有原核生物的优点。实验表明，在酵母中表达的抗体能产生ADCC(除人的补体外)。最近，有人报道了在酵母系统中能表达出250 mg/L的表达量[8]。
2.3 植物 1992年，Weran等[9]报道了在转基因的烟草中表达了ScFv，并且子代中也受到了ScFv的影响。
2.4 杆状病毒 杆状病毒表达系统是利用病毒极晚期的核多角体基因的启动子，在昆虫细胞或昆虫体内表达。因为核多角体基因是非必须的极晚期基因，它被外源基因取代后，不会影响病毒的复制等生命活动。而且即使表达的蛋白是毒性的，也不会发生明显的影响。
3 ScFv的理论和应用上的地位
ScFv是分子生物学应用到抗体工程上的产物，为人们提供了一种极其理想的具有抗原结合活力的分子。
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3.1 基础理论上的极好模型 因为ScFv只含有重链可变区-连接肽-轻链可变区，它的背景比其它天然分子更清晰，因此它能提供更明确的信息。1994年Zdanov等[10]报道了一个结合三糖[Gal(1→2)Abe(1→3)Man→Ome]的SE155-4sFv1.7A的结构，从构象图上推测出一个突变的苏氨酸(Ile→Thr)不和抗原接触。
3.2 提供可控制的“基因敲除” 常规的基因敲除(Gene knock out)，尽管有许多不可替代的优点，但是也有许多不足之处。例如，如要控制表达的基因对细胞的生长和分化是必须的，那么，就不能敲除它。很早就有人用胞内表达的抗体去抑制一个靶蛋白的活性[11]，以后一系列的工作都表明胞内表达ScFv是一种简捷、可控制、高效的特定蛋白活性抑制的手段。1996年，Greenman等[12]报道了胞内表达的ScFv抑制CD2在分子细胞表面的表达。最近，Persic等[13]报道了在ScFv前接上不同的信号肽序列，可控制ScFv定位在预定的亚细胞位置上，产生对特定抗原的抑制。
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3.2 应用 从与抗原结合的抗体衍生物来看，单链Fv可适用于任何分子识别和结合的应用，包括生物分离、分析或感应技术等。在结合识别的去除毒素(如地高辛)或在血浆分离法中血液不纯等方面也具有很大的应用潜力。抗Hg2+抗体的发现暗示了ScFv可用于重金属中毒的患者。ScFv融合到碱性磷酸酶或虫荧光素酶可做为ELISA试剂盒。这种试剂能够快速分布可节省测试时间。因为快速消除，碘化的ScFv可用于各方面的诊断。ScFv融合蛋白大部分可形成各种治疗剂，可替代TNF、IL-2等治疗剂避免对正常组织产生毒性且使用剂量减少[14]。
因为ScFv的分子小，因此它能比整体抗体更容易地穿过组织，实体瘤，并且比完整抗体更快地从血液中被清除[15]。而且ScFv没有功能性的Fc部分，因此不会跟无关细胞上的Fc受体结合，使ScFv的靶组织对正常组织的比例很高[16]，这种组织高度特异的分布性，使得ScFv在肿瘤治疗，造影中有十分广阔的前景。ScFv出现使传统抗体本无法应用的生物治疗也成为可能。如细胞内直接表达ScFv即可直接干扰AIDS病毒组建，并且降低了细胞感染力和杀伤力。
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目前，人们一般是以ScFv为抗原结合部分，而在后面接上一个细菌外毒素，发挥巨大的威力。Retter等[17]1996年报道了用ScFv-免疫毒素使人的结肠癌在裸鼠中完全消退。1997年Francisco等[18]报道将抑制核糖体活性的蛋白的活性部位接到ScFv上后，取得了良好的效果。
双特异性的ScFv是指把两个不同特异性的ScFv用连接肽连接而成，能同时针对不同的抗原，Schmidt等[19]报道了一个能同时针对肿瘤细胞上两个不同抗原的双特异性ScFv，从而提高了ScFv-免疫毒素的杀伤肿瘤的活力。因为TCR的α、β链属于Ig超家属，也能把α、β链改造成为ScFv后起作用，最近Fitzer-Attas等用这种ScFv的TCR研究了T-细胞激活的信号通路[20]。
4 展望
回顾ScFv的十年，可以清楚地看到基因工程对抗体的改造已达到一个新的高度。由于抗体本身的重要特点，及近年来出现的噬菌体展示技术，可变区可以被万用引物(universal primer)以RT-PCR的方式克隆，并建立一个库。这使人们已经可部分或全部地绕开免疫动物和杂交瘤技术，而直接从一个库中筛选到理想的抗原结合分子。这技术将变得十分普及，人们也会建立更多的双特异性的抗体，以期达到预期的目的。ScFv在大部分将推广到临床上去的同时，也将成为基础研究中十分重要的工具。
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5 参考文献
1 Bird RE,Hardaman KD,Jacobson JW,et al. Single chain antigen binding proteins. Science,1988,240(4877):423～426.
2 Buchner J,Pastan I,Brinkmann U. A method for increasing the yield of properly folded recombinant fusion proteins:single chain immunotoxins from renaturation of bacterial inclusion bodies. Anal Biochem,1992,205(2):263～270.
3 Orlandi R,Gussow DH，Jones PT,et al. Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA,1989,86(10):3833～3837.
, 百拇医药
4 Froyen G,Hendrix D,Ronsse I,et al. Effect of VH and VL consensus sequence-specific primers on the binding and neutralizing potential of a single chain FV directed towards HuIFN-gamma. Molecular Immunology,1995,32(7):515～521.
5 Tang, Y, Jiang N,Parakh C,et al. Selection of linkers for a catalytic single chain antibody using phage display technology. J Biol Chem,1996,271(26):15682～15686.
6 Colcher D,Bird R,Roselli M,et al. In vivo tumor targeting of arecombinant single chain antigen binding protein. J Natl Cancer Inst,1990,82(14):1191～1197.
, 百拇医药
7 Clackson T,Hoogenboom HR,Griffiths AD,et al. Making antibody fragments using phage display libraries. Nature,1991,352(6336):624～628.
8 Eldin P,Pauza ME，Hieda Y,et al. High-level secretion oftwo antibody single chain Fv fragments by Pichia pastoris. J Immunol Meth,1997,201(1):67～75.
9 Owen M,Gandecha A,Cockburn B,et al. Synthesis of a functional antiphytochrome single chain Fv protein in transgenic tobacco. Biotechnology N Y,1992,10(7):790～794.
, http://www.100md.com
10 Zdanov A,Li Y,Bundle DR,et al. Structure of a single-chain antibody variable domain(Fv)fragment complexed with a carbohydrate antigen at 1.7-A resolution. PNAS,1994,91(14):6423～6427.
11 Carlson JR. A New means of inducibly inactivating a cellular protein. Mol Cell Biol,1988,8:2638.
12 Greenman J,Jones E,Wright MD,et al. The use of intracellular single chain antibody fragments to inhibit specifically the expression of cell surface molecules. J Immunol Meth,1996,194(2):169～180.
, 百拇医药
13 Persic L,Righi M,Roberts A,et al. Targeting vectors for intracellular immunisation. Gene,1997,187(1):1～8.
14 Raag R,Whitlow M. Single chain Fvs. FASEB J，1995,9(1):73～80.
15 Yokota T，Milenic DE,Whitlow M,et al. Rapid tumor penetration of a single-chain Fv and comparison with other immunoglobulin forms. Cancer Res,1992,52(12):3402～3408.
16 Milenic DE,Yokota T,Filpula DR,et al. Construction,binding properties,metabolism,and tumor targeting of a single chain Fv derived from the pancarcinoma monoclonal antibody CC49. Cancer Research,1991,51(23 Pt 1):6363～6371.
, 百拇医药
17 Reiter Y,Wright AF,Tonge DW,et al. Recombinant single-chain and disulfide-stabilized Fv-immunotoxins that cause complete regression of a human colon cancer xenograft in nude mice. Int J Cancer,1996,67(1):113～123.
18 Francisco JA,Gawlak SL,Siegall CB. Construction,expression,and characterization of BD1-G28-5 sFv,a single-chain anti-CD40 immunotoxin containing the ribosome-inactivating protein bryodin 1. J Biol Chem,1997,272(39):24165～24169.
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19 Schmidt M,Hynes NE,Groner B,et al. A bivalent single chain antibody toxin specific for ErbB-2 and the EGF receptor. Int J Cancer,1996,65:538～546.
20 Fitzer Attas CJ,Schindler DG,Waks T,et al. Direct T cell activation by chimeric single chain Fv-Syk promotes Syk-Cbl association and Cbl phosphorylation. J Biol Chem,1997,272(13):8551～8557., http://www.100md.com
单位：浙江省中医院血液病研究室(310006)
关键词：
实用医学杂志990441 自从Kohler，Milstein首先创立杂交瘤技术以来，人们对抗体在理论和实践应用上都取得了极大的进展。抗体是四链结构的，由二条220个氨基酸残基的轻链和二条约440个氨基酸残基的重链构成，这些链中，每110个氨基酸折叠成一个三维构象上保守的结构域，这些结构域缔合成为不连续的结构域串。抗体中，抗原结合的那个片段能从变性的状态下复制出来，并达到和天然构象大致相当的结合活力。而且人们知道，保持抗原结合活力的最小部分是由重链可变区和轻链可变区组成的约25 000 Da的Fv。八十年代以来，人们开始试探仅用重链可变区和轻链可变区片段来组成抗原结合分子。起先，抗体基因从杂交瘤细胞中克隆到以后，装入载体中以整体的形式得到表达产物。1988年Skerra等首先用细菌表达的重链可变区和轻链可变区在体外重组出有功能的非共价结合的重组分子，这为在基因工程水平上改造抗体开创了先河。但因为非共价结合的重链可变区和轻链可变区片段很容易分离，在同一年，Bird和Huston先后发表了由一条连接肽把重链可变区和轻链可变区连接起来的小分子肽，称为ScFv(single chain variable fragment)。它由一条连接肽把重链可变区和轻链可变区连接起来，使它更容易地在体外重组成为有活性的分子[1]。至此，人们从基因水平上操作抗体已开始变得成熟。
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1 ScFv的结构
ScFv是由重链可变区和轻链可变区构成的小分子，它仍然保持着天然抗体的特异性和大致相似亲和力。重链可变区和轻链可变区折叠成相对独立的结构域，由一条亲水性的柔软的连接肽相连，从而形成和天然抗体中抗原结合位点相似的结构。重链可变区和轻链可变区都可以成为ScFv的N-端[2]。重链可变区和轻链可变区的可变性是相对于轻链和重链的恒定区而言的。它们的氨基酸变化频率在不同的抗体中比较大，但就轻链或重链的可变区本身而言，它们的氨基酸变化率在不同的位置有明显的不同。对可变区的序列比较后发现，有的区域比较保守，在不同的抗体中大致相似，称它们为框架区。轻链和重链中都有四个框架区：FR1，FR2，FR3和FR4。另外一些区域，它们的变化率在不同的抗体中比较大，称它们为超变区。又因为它们与抗体的特异性有关，即与抗原相匹配，因而人们称它们为互补决定区(complementary determined region，CDR)。轻链有三个超变区：CDR1，CDR2，CDR3。具有刚性的β-折叠片的框架区和环形的互补决定区构成整个轻链和重链可变区。这种区域的结构，非常适合于蛋白的改造。例如改造成Fv、Fab等带结合部位的分子，或把结合部位从一个抗体转移到另一个抗体上。
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值得一提的是Orlandi等[3]对Kabat data base进行分析后得出一组万用引物，现在被许多人引用，可作克隆重链可变区和轻链可变区的大部分家属成员的引物。因为在引物中设计了酶切位点等原因造成突变，Froyen等[4]证明，这种突变对ScFv的结合能力没有影响。
根据单体Fv的构象，连接肽要跨越从一个可变区的C-端到另一个可变区的N-端的约35～40A的距离[1]，连接肽的选择十分关键，它的要求是有柔软性，不干扰轻重链的折叠，不降低产物的可溶性。1996年，Tang等[5]用噬菌体展示技术(Phage display)的方法，对一个连接肽库作了筛选，结果得到很多结合能力较强的ScFv的连接肽。这些连接肽的共同特征是第2位的氨基酸是脯氨酸，另一端精氨酸和脯氨酸丰富，其它无明显的特征。第2位的脯氨酸可能与大角度的旋转有关，而带电的精氨酸的聚集，则和连接肽的柔软性和亲水性相关。
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ScFv的低聚物表现出浓度依赖性。双价ScFv是由一条ScFv的可变区相互断开并重接到另一ScFv的可变区上形成的，而更多的ScFv的可变区的重排和重接形成了3价或多价聚合物。在双价或多价聚合物中的Fv，是一条Fv的轻链和另一条Fv的重链组成的。
2 ScFv的表达系统
大部分用于基因工程的表达载体已被用于表达ScFv，而且因为ScFv的分子量小，组装和折叠的条件温和，能适应比其它大部分分子更广谱的表达载体[6]。
2.1 细菌 因为大肠杆菌价廉、表达量大、操作方便，至今报道的大部分是在大肠杆菌中表达的。值得指出的是，从八十年代中期出现一种叫做噬菌体展示技术(Phage display)的方法，Clackson等[7]首先把它用到ScFv的表达中来。它是用基因工程改造的噬菌体载体，再用辅助者(Helper)噬菌体的帮助，结果使ScFv在噬菌体的衣壳蛋白G3P的顶部表达。这种ScFv已具有结合活性，因此能很方便地从一个库中筛选出需要的ScFv噬菌粒(Phagemid)来。又因为ScFv后有一个琥珀型的终止子，因此在非抑制型的菌株中能表达出游离的ScFv。在细菌中建立ScFv的表达系统有着极为广泛的新应用，可为研究结构和功能之间的关系提供大量高质量的抗原结合蛋白，而且成本低廉。
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2.2 酵母 酵母作为真核生物有它的优点，如糖基化，又有原核生物的优点。实验表明，在酵母中表达的抗体能产生ADCC(除人的补体外)。最近，有人报道了在酵母系统中能表达出250 mg/L的表达量[8]。
2.3 植物 1992年，Weran等[9]报道了在转基因的烟草中表达了ScFv，并且子代中也受到了ScFv的影响。
2.4 杆状病毒 杆状病毒表达系统是利用病毒极晚期的核多角体基因的启动子，在昆虫细胞或昆虫体内表达。因为核多角体基因是非必须的极晚期基因，它被外源基因取代后，不会影响病毒的复制等生命活动。而且即使表达的蛋白是毒性的，也不会发生明显的影响。
3 ScFv的理论和应用上的地位
ScFv是分子生物学应用到抗体工程上的产物，为人们提供了一种极其理想的具有抗原结合活力的分子。
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3.1 基础理论上的极好模型 因为ScFv只含有重链可变区-连接肽-轻链可变区，它的背景比其它天然分子更清晰，因此它能提供更明确的信息。1994年Zdanov等[10]报道了一个结合三糖[Gal(1→2)Abe(1→3)Man→Ome]的SE155-4sFv1.7A的结构，从构象图上推测出一个突变的苏氨酸(Ile→Thr)不和抗原接触。
3.2 提供可控制的“基因敲除” 常规的基因敲除(Gene knock out)，尽管有许多不可替代的优点，但是也有许多不足之处。例如，如要控制表达的基因对细胞的生长和分化是必须的，那么，就不能敲除它。很早就有人用胞内表达的抗体去抑制一个靶蛋白的活性[11]，以后一系列的工作都表明胞内表达ScFv是一种简捷、可控制、高效的特定蛋白活性抑制的手段。1996年，Greenman等[12]报道了胞内表达的ScFv抑制CD2在分子细胞表面的表达。最近，Persic等[13]报道了在ScFv前接上不同的信号肽序列，可控制ScFv定位在预定的亚细胞位置上，产生对特定抗原的抑制。
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3.2 应用 从与抗原结合的抗体衍生物来看，单链Fv可适用于任何分子识别和结合的应用，包括生物分离、分析或感应技术等。在结合识别的去除毒素(如地高辛)或在血浆分离法中血液不纯等方面也具有很大的应用潜力。抗Hg2+抗体的发现暗示了ScFv可用于重金属中毒的患者。ScFv融合到碱性磷酸酶或虫荧光素酶可做为ELISA试剂盒。这种试剂能够快速分布可节省测试时间。因为快速消除，碘化的ScFv可用于各方面的诊断。ScFv融合蛋白大部分可形成各种治疗剂，可替代TNF、IL-2等治疗剂避免对正常组织产生毒性且使用剂量减少[14]。
因为ScFv的分子小，因此它能比整体抗体更容易地穿过组织，实体瘤，并且比完整抗体更快地从血液中被清除[15]。而且ScFv没有功能性的Fc部分，因此不会跟无关细胞上的Fc受体结合，使ScFv的靶组织对正常组织的比例很高[16]，这种组织高度特异的分布性，使得ScFv在肿瘤治疗，造影中有十分广阔的前景。ScFv出现使传统抗体本无法应用的生物治疗也成为可能。如细胞内直接表达ScFv即可直接干扰AIDS病毒组建，并且降低了细胞感染力和杀伤力。
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目前，人们一般是以ScFv为抗原结合部分，而在后面接上一个细菌外毒素，发挥巨大的威力。Retter等[17]1996年报道了用ScFv-免疫毒素使人的结肠癌在裸鼠中完全消退。1997年Francisco等[18]报道将抑制核糖体活性的蛋白的活性部位接到ScFv上后，取得了良好的效果。
双特异性的ScFv是指把两个不同特异性的ScFv用连接肽连接而成，能同时针对不同的抗原，Schmidt等[19]报道了一个能同时针对肿瘤细胞上两个不同抗原的双特异性ScFv，从而提高了ScFv-免疫毒素的杀伤肿瘤的活力。因为TCR的α、β链属于Ig超家属，也能把α、β链改造成为ScFv后起作用，最近Fitzer-Attas等用这种ScFv的TCR研究了T-细胞激活的信号通路[20]。
4 展望
回顾ScFv的十年，可以清楚地看到基因工程对抗体的改造已达到一个新的高度。由于抗体本身的重要特点，及近年来出现的噬菌体展示技术，可变区可以被万用引物(universal primer)以RT-PCR的方式克隆，并建立一个库。这使人们已经可部分或全部地绕开免疫动物和杂交瘤技术，而直接从一个库中筛选到理想的抗原结合分子。这技术将变得十分普及，人们也会建立更多的双特异性的抗体，以期达到预期的目的。ScFv在大部分将推广到临床上去的同时，也将成为基础研究中十分重要的工具。
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5 参考文献
1 Bird RE,Hardaman KD,Jacobson JW,et al. Single chain antigen binding proteins. Science,1988,240(4877):423～426.
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3 Orlandi R,Gussow DH，Jones PT,et al. Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA,1989,86(10):3833～3837.
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8 Eldin P,Pauza ME，Hieda Y,et al. High-level secretion oftwo antibody single chain Fv fragments by Pichia pastoris. J Immunol Meth,1997,201(1):67～75.
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10 Zdanov A,Li Y,Bundle DR,et al. Structure of a single-chain antibody variable domain(Fv)fragment complexed with a carbohydrate antigen at 1.7-A resolution. PNAS,1994,91(14):6423～6427.
11 Carlson JR. A New means of inducibly inactivating a cellular protein. Mol Cell Biol,1988,8:2638.
12 Greenman J,Jones E,Wright MD,et al. The use of intracellular single chain antibody fragments to inhibit specifically the expression of cell surface molecules. J Immunol Meth,1996,194(2):169～180.
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13 Persic L,Righi M,Roberts A,et al. Targeting vectors for intracellular immunisation. Gene,1997,187(1):1～8.
14 Raag R,Whitlow M. Single chain Fvs. FASEB J，1995,9(1):73～80.
15 Yokota T，Milenic DE,Whitlow M,et al. Rapid tumor penetration of a single-chain Fv and comparison with other immunoglobulin forms. Cancer Res,1992,52(12):3402～3408.
16 Milenic DE,Yokota T,Filpula DR,et al. Construction,binding properties,metabolism,and tumor targeting of a single chain Fv derived from the pancarcinoma monoclonal antibody CC49. Cancer Research,1991,51(23 Pt 1):6363～6371.
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17 Reiter Y,Wright AF,Tonge DW,et al. Recombinant single-chain and disulfide-stabilized Fv-immunotoxins that cause complete regression of a human colon cancer xenograft in nude mice. Int J Cancer,1996,67(1):113～123.
18 Francisco JA,Gawlak SL,Siegall CB. Construction,expression,and characterization of BD1-G28-5 sFv,a single-chain anti-CD40 immunotoxin containing the ribosome-inactivating protein bryodin 1. J Biol Chem,1997,272(39):24165～24169.
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19 Schmidt M,Hynes NE,Groner B,et al. A bivalent single chain antibody toxin specific for ErbB-2 and the EGF receptor. Int J Cancer,1996,65:538～546.
20 Fitzer Attas CJ,Schindler DG,Waks T,et al. Direct T cell activation by chimeric single chain Fv-Syk promotes Syk-Cbl association and Cbl phosphorylation. J Biol Chem,1997,272(13):8551～8557., http://www.100md.com