清热解毒中药对小鼠免疫功能的调节作用
作者：高素君 王冠军 刘大同 郭京丽 姜一强 易永林
单位：高素君 王冠军 易永林(白求恩医科大学第一临床学院，长春 130021)；刘大同 郭京丽 姜一强 吉林省人民医院中医科
关键词：中药；IL-1；IL-2
中国老年学杂志/990430 摘 要 目的 探讨清热解毒中药对老龄小鼠免疫功能的影响。方法 采用微孔板培养同位素掺入法、夹心ELISA法、依赖细胞株法，分别检测用药后小鼠淋巴细胞转化率、IL-1、IL-2水平。结果 该药在一定剂量范围内增强淋巴细胞转化率，使小鼠脾细胞产生IL-1α、IL-1β的量增加。结论 清热解毒中药对老龄小鼠免疫功能具有多方面的调节作用。
Modulation of Immunologic function of the
, http://www.100md.com mice by drugs which can dissipating heat and detoxifying
Gao Sujun, Wang Guanjun, Liu Datong et al
The First Teaching Hospital, Normane Bethune
University of Medical Scicences, Changchun 130021
Objective To study the effect of dissipating Heat and Detoxifying drugs on immunological system in elderly mice.Methods The methods of microporous culture plates 3H-TdR mix, sandwich ELISA, dependent cell strain were used to detect the frequency of Lymphocytic transformation and the levels of IL-1, IL-2 after taking the medicine.Results The drugs can intense the frequency of Lymphocytic transformation in a certain extent of doses and enhance the amount of IL-1α and IL-1β and IL-2 of spleen cells in elderly mice.Conclusions The drugs have regulative effect on immunological function in many aspect in elderly mice.
, http://www.100md.com
Key words Chinese herbs Interleukin-1 Interleukin-2
老年人由于随年龄增长骨髓造血功能衰减、睾丸酮分泌不足以及免疫器官及免疫功能趋向衰退，所以老年人再生障碍性贫血的治疗效果差，病死率高〔1〕，因而其治疗用药必须兼顾促进造血与免疫调节双重作用。我们根据中医理论应用以紫草、漏芦、柴胡、虎杖等为主组成的清热解毒方剂(暂定名为血泉)治疗老年人再生障碍性贫血取得了较好疗效。为探讨该方剂对免疫系统的影响，我们以老龄小鼠为模型，检测用药后小鼠的淋巴细胞转化率、IL-1、IL-2水平，结果如下。
1 材料和方法
1.1 动物及给药方法 取体重40～50g，18月龄昆明小鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，每组10只，3个实验组，每日每组小鼠灌胃给予不同浓度的血泉蒸馏水混悬液一次，给药的剂量：实验Ⅰ组550 mg/kg，实验Ⅱ组2 750 mg/kg，实验Ⅲ组5 500 mg/kg，对照组每日用等量生理盐水灌胃，连续21 d，最后一次给药24 h后，拉颈处死小鼠，做所需项目的检测。
, http://www.100md.com
1.2 淋巴细胞转化率测定 采用微孔板培养同位素掺入法测定淋巴细胞转化率〔2〕，无菌制备小鼠脾脏单细胞悬液，用含10%小牛血清的1 640培养液调成5×106/ml浓度，加入96孔板，每孔0.1 ml，每份脾细胞加9孔，刀豆蛋白A(Con-A，Sigma)，细菌脂多糖(LPS，Sigma)刺激和对照各三复孔，每一转化孔分别加入Con-A1.0 μg(终浓度5 μg/ml)或LPS10 μg(终浓度50 μg/ml)，5%CO237℃培养70 h，收获前6 h每孔加0.5 μci3H-TdR，液闪计数仪测定cpm值。
1.3 白细胞介素Ⅰ(IL-1)检测 首先将各组小鼠脾脏制成1×107/ml浓度的单细胞悬液，在含有5%小牛血清，Con-A 5 μg/ml的1 640培养液中经37℃，5%CO2及饱和湿度条件下孵育48 h，离心收获上清待测。测定小鼠脾细胞IL-1α和IL-1β的含量采用夹心ELISA方法〔3〕，全部试剂、抗体及标准品均由日本大橼制药会社提供。
, 百拇医药
1.4 白细胞介素2(IL-1)检测 小鼠脾细胞上清液的制备与前述IL-1检测相同。IL-2依赖性MTH细胞株由中国医学科学院血液学研究所提供，培养于含rhIL-2纯品60 μ/ml，小牛血清10%的1 640培养液中，实验前用不含IL-2的1 640培养液洗涤两次后调细胞浓度至1×105/ml备用。根据待测脾细胞上清刺激IL-2依赖细胞增殖的能力来判断检测上清中所含IL-2活性的强度。具体方法为：将每份脾细胞上清分别按1∶4，1∶8，1∶16及1∶32的稀释度加入96孔板中，每份标本设3复孔，每孔100 μl，再加入MTH细胞悬液100 μl，置37℃，5%CO2培养箱中孵育24 h，每孔中加入0.5 μci3H-TdR(中科院原子能所)再培养30 h，多头细胞收集器收集细胞，液闪计数仪测定cpm值。
2 结 果
2.1 药物对小鼠淋巴细胞转化率的影响 见图1。Con-A和LPS刺激组的3H掺入率是用每分钟平均净脉冲数(ncpm)值来表示。从该图中可以看到在自发转化率检测中(空白)，3个实验组均低于对照组，但经Con-A刺激后，实验Ⅰ组和实验Ⅱ组的掺入率增加了大约12倍，而对照组只增加了2倍，经LPS刺激后，实验Ⅱ组的ncpm值与明显增高，与对照组相比有显著差异。
, 百拇医药
图1 药物对小鼠淋巴细胞转化率的影响
2.2 药物对小鼠脾细胞产生IL-1的影响 经灌胃给予一定剂量的血泉后，可使小鼠脾细胞IL-1α和IL-1β的产生量都有不同程度的增加(表1)，其中IL-1β的升高程度尤其显著，大剂量给药组(实验Ⅲ组)脾细胞产生IL-1β的均值是对照组的2.7倍。
表1 体内用药对小鼠脾细胞产生IL-1的影响(pg/ml,
±s)
例数
IL-1α
IL-1β
对照组
8
, 百拇医药
50.26±9.66
84.75±16.33
实验Ⅰ组
7
57.20±2.16
98.20±7.98
实验Ⅱ组
8
71.80±12.961)
169.00±61.881)
实验Ⅲ组
, 百拇医药 8
85.60±7.702)
232.80±31.252)
与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.001
2.3 药物对小鼠脾细胞产生IL-2的影响 MTH细胞受到实验组及对照组不同浓度脾细胞上清液刺激后的3H掺入率(cpm值)，可以看到实验Ⅲ组的小鼠脾细胞上清液在作1∶16，和1∶32倍稀释后，IL-2活性显著增强(表2)。
表2 血泉体内用药对小鼠细胞产生IL-2活性的影响(cpm±s)
例数
, 百拇医药
1∶4
1∶8
1∶16
1∶32
对照组
8
2 110.5±312.0
2 300.0±329.8
2 244.3±528.7
1 677.2±213.4
实验Ⅰ组
7
, 百拇医药
2 248.0±582.9
2 484.8±681.9
2 788.8±896.0
2 124.3±784.0
实验Ⅱ组
8
2 492.0±280.1
2 699.2±204.0
2 803.2±527.9
1 896.0±299.7
实验Ⅲ组
, http://www.100md.com
8
2 670.4±860.0
3 791.2±1 604.0
4 144.5±1 012.01)
5 592.4±1 345.82)
与对照组比较：1)P<0.05；2)P<0.001
3 讨 论
动物与人一样都有生长、发育和衰老的过程，一般认为小鼠的免疫机能相对稳定，根据中医理论“肾主骨生髓”，再障本质为肾虚，故本实验用18月龄小鼠来研究清热解毒中药复方对肾虚时免疫机能的作用，结果表明该药在一定剂量范围内能够增加淋巴细胞转化率，增强了淋巴细胞对外源刺激的反应能力。一般认为Con-A主要作用于T淋巴细胞，而LPS主要作用于B淋巴细胞，用药组小鼠脾细胞经Con-A和LPS刺激后3H掺入率都明显增高，说明该药对T、B淋巴细胞都有很强的调节作用。淋巴细胞转化率还与剂量有明显关系，剂量太大时(实验Ⅲ组)对淋转的促进作用反而消失。同时IL-1产生量明显增加，IL-1主要由单核巨噬细胞产生，除了它的免疫调节作用外，还能够与其他细胞因子协同刺激造血。采用ELISA方法，定量检测IL-1α和IL-1β的产生都增加，这是该药对免疫系统起作用的重要环节，也可能是该药能够刺激造血的原因之一。在IL-2检测中发现IL-2的最大活性只表现在经过16倍和32倍稀释的脾细胞上清中，而浓度较高的脾细胞上清中IL-2活性反而较低。上述结果说明，清热解毒中药可能有效的作用于免疫系统，使其发生多方面的生物学反应，通过多种途径完成复杂的免疫调节过程，为该药用于老年人再生障碍性贫血的治疗提供理论依据。
, 百拇医药
作者简介：高素君，女，36岁，硕士，主要从事造血调控方面的研究
参考文献
1 刘润生，王瑞英，任金海 et al.老年人再生障碍性贫血35例临床分析.中华老年医学杂志，1994，13(4)：90
2 杨贵贞主编.免疫学新进展专题讲座.长春：白求恩医科大学出版社，1987：180
3 Tanaka K,Ishikawa E,Ohmoto Y et al.In vitro production of human interleukin 1α and interleukin 1β by peripheral blood mononuclear cells examined by sensitive sandwich enzyma immunoassay .Eur J Immunol，1987；17：1527
4 刘斌清.白细胞介素Ⅰ(IL-1)对造血细胞的调节作用.国外医学.输血与血液学分册，1991；14(2)：95
〔1998-03-01收稿 1998-12-30修回〕, http://www.100md.com
单位：高素君 王冠军 易永林(白求恩医科大学第一临床学院，长春 130021)；刘大同 郭京丽 姜一强 吉林省人民医院中医科
关键词：中药；IL-1；IL-2
中国老年学杂志/990430 摘 要 目的 探讨清热解毒中药对老龄小鼠免疫功能的影响。方法 采用微孔板培养同位素掺入法、夹心ELISA法、依赖细胞株法，分别检测用药后小鼠淋巴细胞转化率、IL-1、IL-2水平。结果 该药在一定剂量范围内增强淋巴细胞转化率，使小鼠脾细胞产生IL-1α、IL-1β的量增加。结论 清热解毒中药对老龄小鼠免疫功能具有多方面的调节作用。
Modulation of Immunologic function of the
, http://www.100md.com mice by drugs which can dissipating heat and detoxifying
Gao Sujun, Wang Guanjun, Liu Datong et al
The First Teaching Hospital, Normane Bethune
University of Medical Scicences, Changchun 130021
Objective To study the effect of dissipating Heat and Detoxifying drugs on immunological system in elderly mice.Methods The methods of microporous culture plates 3H-TdR mix, sandwich ELISA, dependent cell strain were used to detect the frequency of Lymphocytic transformation and the levels of IL-1, IL-2 after taking the medicine.Results The drugs can intense the frequency of Lymphocytic transformation in a certain extent of doses and enhance the amount of IL-1α and IL-1β and IL-2 of spleen cells in elderly mice.Conclusions The drugs have regulative effect on immunological function in many aspect in elderly mice.
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Key words Chinese herbs Interleukin-1 Interleukin-2
老年人由于随年龄增长骨髓造血功能衰减、睾丸酮分泌不足以及免疫器官及免疫功能趋向衰退，所以老年人再生障碍性贫血的治疗效果差，病死率高〔1〕，因而其治疗用药必须兼顾促进造血与免疫调节双重作用。我们根据中医理论应用以紫草、漏芦、柴胡、虎杖等为主组成的清热解毒方剂(暂定名为血泉)治疗老年人再生障碍性贫血取得了较好疗效。为探讨该方剂对免疫系统的影响，我们以老龄小鼠为模型，检测用药后小鼠的淋巴细胞转化率、IL-1、IL-2水平，结果如下。
1 材料和方法
1.1 动物及给药方法 取体重40～50g，18月龄昆明小鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，每组10只，3个实验组，每日每组小鼠灌胃给予不同浓度的血泉蒸馏水混悬液一次，给药的剂量：实验Ⅰ组550 mg/kg，实验Ⅱ组2 750 mg/kg，实验Ⅲ组5 500 mg/kg，对照组每日用等量生理盐水灌胃，连续21 d，最后一次给药24 h后，拉颈处死小鼠，做所需项目的检测。
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1.2 淋巴细胞转化率测定 采用微孔板培养同位素掺入法测定淋巴细胞转化率〔2〕，无菌制备小鼠脾脏单细胞悬液，用含10%小牛血清的1 640培养液调成5×106/ml浓度，加入96孔板，每孔0.1 ml，每份脾细胞加9孔，刀豆蛋白A(Con-A，Sigma)，细菌脂多糖(LPS，Sigma)刺激和对照各三复孔，每一转化孔分别加入Con-A1.0 μg(终浓度5 μg/ml)或LPS10 μg(终浓度50 μg/ml)，5%CO237℃培养70 h，收获前6 h每孔加0.5 μci3H-TdR，液闪计数仪测定cpm值。
1.3 白细胞介素Ⅰ(IL-1)检测 首先将各组小鼠脾脏制成1×107/ml浓度的单细胞悬液，在含有5%小牛血清，Con-A 5 μg/ml的1 640培养液中经37℃，5%CO2及饱和湿度条件下孵育48 h，离心收获上清待测。测定小鼠脾细胞IL-1α和IL-1β的含量采用夹心ELISA方法〔3〕，全部试剂、抗体及标准品均由日本大橼制药会社提供。
, 百拇医药
1.4 白细胞介素2(IL-1)检测 小鼠脾细胞上清液的制备与前述IL-1检测相同。IL-2依赖性MTH细胞株由中国医学科学院血液学研究所提供，培养于含rhIL-2纯品60 μ/ml，小牛血清10%的1 640培养液中，实验前用不含IL-2的1 640培养液洗涤两次后调细胞浓度至1×105/ml备用。根据待测脾细胞上清刺激IL-2依赖细胞增殖的能力来判断检测上清中所含IL-2活性的强度。具体方法为：将每份脾细胞上清分别按1∶4，1∶8，1∶16及1∶32的稀释度加入96孔板中，每份标本设3复孔，每孔100 μl，再加入MTH细胞悬液100 μl，置37℃，5%CO2培养箱中孵育24 h，每孔中加入0.5 μci3H-TdR(中科院原子能所)再培养30 h，多头细胞收集器收集细胞，液闪计数仪测定cpm值。
2 结 果
2.1 药物对小鼠淋巴细胞转化率的影响 见图1。Con-A和LPS刺激组的3H掺入率是用每分钟平均净脉冲数(ncpm)值来表示。从该图中可以看到在自发转化率检测中(空白)，3个实验组均低于对照组，但经Con-A刺激后，实验Ⅰ组和实验Ⅱ组的掺入率增加了大约12倍，而对照组只增加了2倍，经LPS刺激后，实验Ⅱ组的ncpm值与明显增高，与对照组相比有显著差异。
, 百拇医药
图1 药物对小鼠淋巴细胞转化率的影响
2.2 药物对小鼠脾细胞产生IL-1的影响 经灌胃给予一定剂量的血泉后，可使小鼠脾细胞IL-1α和IL-1β的产生量都有不同程度的增加(表1)，其中IL-1β的升高程度尤其显著，大剂量给药组(实验Ⅲ组)脾细胞产生IL-1β的均值是对照组的2.7倍。
表1 体内用药对小鼠脾细胞产生IL-1的影响(pg/ml,
±s)例数
IL-1α
IL-1β
对照组
8
, 百拇医药
50.26±9.66
84.75±16.33
实验Ⅰ组
7
57.20±2.16
98.20±7.98
实验Ⅱ组
8
71.80±12.961)
169.00±61.881)
实验Ⅲ组
, 百拇医药 8
85.60±7.702)
232.80±31.252)
与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.001
2.3 药物对小鼠脾细胞产生IL-2的影响 MTH细胞受到实验组及对照组不同浓度脾细胞上清液刺激后的3H掺入率(cpm值)，可以看到实验Ⅲ组的小鼠脾细胞上清液在作1∶16，和1∶32倍稀释后，IL-2活性显著增强(表2)。
表2 血泉体内用药对小鼠细胞产生IL-2活性的影响(cpm
±s)例数
, 百拇医药
1∶4
1∶8
1∶16
1∶32
对照组
8
2 110.5±312.0
2 300.0±329.8
2 244.3±528.7
1 677.2±213.4
实验Ⅰ组
7
, 百拇医药
2 248.0±582.9
2 484.8±681.9
2 788.8±896.0
2 124.3±784.0
实验Ⅱ组
8
2 492.0±280.1
2 699.2±204.0
2 803.2±527.9
1 896.0±299.7
实验Ⅲ组
, http://www.100md.com
8
2 670.4±860.0
3 791.2±1 604.0
4 144.5±1 012.01)
5 592.4±1 345.82)
与对照组比较：1)P<0.05；2)P<0.001
3 讨 论
动物与人一样都有生长、发育和衰老的过程，一般认为小鼠的免疫机能相对稳定，根据中医理论“肾主骨生髓”，再障本质为肾虚，故本实验用18月龄小鼠来研究清热解毒中药复方对肾虚时免疫机能的作用，结果表明该药在一定剂量范围内能够增加淋巴细胞转化率，增强了淋巴细胞对外源刺激的反应能力。一般认为Con-A主要作用于T淋巴细胞，而LPS主要作用于B淋巴细胞，用药组小鼠脾细胞经Con-A和LPS刺激后3H掺入率都明显增高，说明该药对T、B淋巴细胞都有很强的调节作用。淋巴细胞转化率还与剂量有明显关系，剂量太大时(实验Ⅲ组)对淋转的促进作用反而消失。同时IL-1产生量明显增加，IL-1主要由单核巨噬细胞产生，除了它的免疫调节作用外，还能够与其他细胞因子协同刺激造血。采用ELISA方法，定量检测IL-1α和IL-1β的产生都增加，这是该药对免疫系统起作用的重要环节，也可能是该药能够刺激造血的原因之一。在IL-2检测中发现IL-2的最大活性只表现在经过16倍和32倍稀释的脾细胞上清中，而浓度较高的脾细胞上清中IL-2活性反而较低。上述结果说明，清热解毒中药可能有效的作用于免疫系统，使其发生多方面的生物学反应，通过多种途径完成复杂的免疫调节过程，为该药用于老年人再生障碍性贫血的治疗提供理论依据。
, 百拇医药
作者简介：高素君，女，36岁，硕士，主要从事造血调控方面的研究
参考文献
1 刘润生，王瑞英，任金海 et al.老年人再生障碍性贫血35例临床分析.中华老年医学杂志，1994，13(4)：90
2 杨贵贞主编.免疫学新进展专题讲座.长春：白求恩医科大学出版社，1987：180
3 Tanaka K,Ishikawa E,Ohmoto Y et al.In vitro production of human interleukin 1α and interleukin 1β by peripheral blood mononuclear cells examined by sensitive sandwich enzyma immunoassay .Eur J Immunol，1987；17：1527
4 刘斌清.白细胞介素Ⅰ(IL-1)对造血细胞的调节作用.国外医学.输血与血液学分册，1991；14(2)：95
〔1998-03-01收稿 1998-12-30修回〕, http://www.100md.com