抗氧化剂抑制缺血后再灌注损伤相关的心肌细胞凋亡1
作者：胡向阳 黄晓明 张运生 刘歧山
单位：南京铁道医学院医学科学研究所，南京 210009
关键词：缺血再灌注；凋亡；N-乙酰-L-半胱氨酸
中国老年学杂志/990406 摘 要 目的 研究抗氧化剂对缺血后再灌注引起的心肌细胞凋亡的作用。方法 利用缺血再灌注损伤的动物模型，通过末端转移酶介导的原位缺口标记法(TUNEL)检测有或无药物保护时心肌细胞的凋亡程度。结果 与非缺血心肌比较，缺血再灌注的心肌组织出现显著的凋亡细胞，而经抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)预处理的缺血再灌注大鼠心肌组织凋亡细胞数较未处理组显著减少。结论 NAC可有效抑制缺血再灌注损伤相关的心肌细胞凋亡。
缺血性心肌的早期冠状动脉再灌注在临床治疗中有重要的意义，但再灌注本身也会引起新的心肌细胞损伤即再灌注损伤。近年来的实验研究表明，心肌细胞的凋亡可能在缺血心肌再灌注后的损伤形成机制中起重要的作用〔1，2〕。因此，影响细胞凋亡的许多因素对再灌注心肌细胞损伤可能具有促进或抑制的作用。本文研究抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)对缺血后再灌注损伤相关的心肌细胞凋亡的作用，以探讨通过干预细胞凋亡过程而实现预防或减少再灌注损伤的可能性。
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1 材料与方法
1.1 材料 MI/R动物模型〔3〕：取体重约250g的雄性SD大鼠，乙醚麻醉后手术结扎左冠状动脉，维持缺血状态20min，然后开始再灌注，24h后切除心脏，用冷生理盐水灌洗2min再用4%多聚甲醛外固定，然后常规制备左心室壁的5μm厚石蜡切片。
实验动物分组：8只SD大鼠随机分为3组。A组为假手术(sham)组，不结扎左冠状动脉，其余操作相同；另外两组于MI手术前1h经腹腔注射0.5ml生理盐水(B组)或20μgN-乙酰-L-半胱氨酸(溶于0.5ml生理盐水，C组)。
1.2 光镜观察 组织切片脱石蜡后，常规HE染色、光镜下观察。
1.3 原位缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡 组织切片常规脱蜡、水合，用蛋白酶K20μg/ml(10mmol/LTris-HCl，pH7.4)于37℃保温15min，然后每片加50μl标记反应混合物(含100mmol/L砷酸盐，0.1mmol/LDTT，4μmol/L地高辛-ll-dUTP和10U末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，在37℃湿盒中保温1h，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗后，与抗-Dig-抗体复合物(37.5mU/ml)保温30min，PBS液洗，再于显色缓冲液(0.1mol/LTris-HCl，pH9.5，0.1mol/LNaCl，50mmol/LMgCl2)中用碱性磷酸酶的显色底物NBT/BCIP显色，显色完全后用TE缓冲液中止反应。伊红复染、封片，显微镜下观察并拍摄。TUNEL检测阴性对照为在标记反应混合物中不加TdT，余操作步骤相同。
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1.4 统计分析 利用测微网测量计算每一样品的凋亡指数，每一切片观察10个独立视野，计算凋亡的心肌细胞(核被染色)数，凋亡指数＝(核着色的心肌细胞数/总心肌细胞数)×100%，并以此进行组间比较。
2 结 果
2.1 HE染色 缺血20min/再灌注24h后(B和C组)，光镜下可观察到心肌细胞出现典型的凋亡形态：细胞皱缩、细胞核固缩、核碎片和凋亡小体形成。但经NAC处理组(C)较未处理组(B)具备上述凋亡特征的细胞数明显减少。Sham组(A)细胞基本未见凋亡形态特征。
2.2 TUNEL法检测结果 组织切片中的凋亡细胞经TUNEL法染色后可见细胞核呈蓝紫色。Sham组(A)和TUENL阴性对照均无显著阳性细胞核(凋亡指数<5%)，未经药物处理组(B)凋亡显著(心肌细胞凋亡指数67%±5%，与A组比较P<0.01)，而经NAC处理组(C)阳性细胞核数明显减少(38%±3%，与B组比较P<0.01)(见图1)。
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Sham组(A) 缺血再灌注组(B)无药物保护 缺血再灌注组(C)，经NAC预处理
图1 TUNEL染色结果(目镜×20)
3 讨 论
缺血再灌注损伤的形成机制一直是心血管领域的重要研究课题，近年来由于分子生物学和细胞生物学技术的发展和应用，已证明细胞凋亡在MI/R损伤机制中起重要作用。因此，研究是否可通过抑制心肌细胞凋亡来保护缺血再灌注心肌，减少损伤，对于指导临床治疗和预后以及寻找新的更有效的治疗药物，均有十分重要的意义。
本研究的结果表明NAC可有效抑制缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡，其机制可能与NAC的抗氧化作用有关。大量研究已经证明氧化张力可诱导细胞发生凋亡，在生理状态下细胞内的氧化和抗氧化机制间处于一种平衡状态，但在许多病理状态下，细胞内会产生大量的氧自由基，使这种平衡被破坏，从而导致氧化张力。有大量研究表明氧自由基的爆发形成在缺血再灌注损伤中起重要作用〔4，5〕。N-乙酰-L-半胱氨酸本身是一种氧自由基清除剂，可直接起作用，同时它又是谷胱甘肽的前体，后者在维持胞内氧化还原平衡以及保护细胞不受氧化损伤中有重要的作用。有证据表明氧自由基清除剂如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶、维生素E等均可有效抑制氧化张力诱导的细胞凋亡〔6，7〕。本文的研究结果进一步证明缺血再灌注损伤相关的细胞凋亡与氧化张力有重要的关系，而抗氧化剂如NAC可促进损伤条件下心肌细胞的存活，对这类化合物在缺血再灌注损伤中的保护作用进行深入的研究，不仅有助于揭示缺血再灌注损伤的分子和细胞机制，也将为寻找新的临床治疗药物打下良好的基础。
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1 本课题为铁道部科技发展基金资助
作者简介：胡向阳，女，35岁，讲师，研究方向：心血管分子生物学
参考文献
1 Gottlieb RA, Burleson KO, Kloner RA et al.Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes.J Clin Invest，1994；94：1621
2 Colucci WS.Apoptosis in the heart.N Engl J Med，1996；335：1224
3 Buerke M, Murohara T, Skurk C et al.Cardioprotective effects of insulin-like growth factor I in myocardial ischemia followed by reperfusion.Proc Natl Acad Sci USA，1995；92：8031
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4 McCord JM.Oxygen-derived radicals:a link between reperfusion injury and inflammation.Fed Proc，1994；46：2402
5 Zweier JL, Flaherty JT，Weisfeldt ML.Direct measurement of free radical generation following reperfusion of ischemic myocardium.Proc Natl Acad Sci USA，1987；84：1404
6 Buttke TM.Oxidative stress as a mediator of apoptosis.Immunol，1994；15：7
7 Kayanoki Y.The protective role of glutathione peroxidase in apoptosis induced by reactive oxygen species.J Biochem(Tokyo)，1996；119：817
〔1998-09-25收稿 1999-01-18修回〕, http://www.100md.com
单位：南京铁道医学院医学科学研究所，南京 210009
关键词：缺血再灌注；凋亡；N-乙酰-L-半胱氨酸
中国老年学杂志/990406 摘 要 目的 研究抗氧化剂对缺血后再灌注引起的心肌细胞凋亡的作用。方法 利用缺血再灌注损伤的动物模型，通过末端转移酶介导的原位缺口标记法(TUNEL)检测有或无药物保护时心肌细胞的凋亡程度。结果 与非缺血心肌比较，缺血再灌注的心肌组织出现显著的凋亡细胞，而经抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)预处理的缺血再灌注大鼠心肌组织凋亡细胞数较未处理组显著减少。结论 NAC可有效抑制缺血再灌注损伤相关的心肌细胞凋亡。
缺血性心肌的早期冠状动脉再灌注在临床治疗中有重要的意义，但再灌注本身也会引起新的心肌细胞损伤即再灌注损伤。近年来的实验研究表明，心肌细胞的凋亡可能在缺血心肌再灌注后的损伤形成机制中起重要的作用〔1，2〕。因此，影响细胞凋亡的许多因素对再灌注心肌细胞损伤可能具有促进或抑制的作用。本文研究抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)对缺血后再灌注损伤相关的心肌细胞凋亡的作用，以探讨通过干预细胞凋亡过程而实现预防或减少再灌注损伤的可能性。
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1 材料与方法
1.1 材料 MI/R动物模型〔3〕：取体重约250g的雄性SD大鼠，乙醚麻醉后手术结扎左冠状动脉，维持缺血状态20min，然后开始再灌注，24h后切除心脏，用冷生理盐水灌洗2min再用4%多聚甲醛外固定，然后常规制备左心室壁的5μm厚石蜡切片。
实验动物分组：8只SD大鼠随机分为3组。A组为假手术(sham)组，不结扎左冠状动脉，其余操作相同；另外两组于MI手术前1h经腹腔注射0.5ml生理盐水(B组)或20μgN-乙酰-L-半胱氨酸(溶于0.5ml生理盐水，C组)。
1.2 光镜观察 组织切片脱石蜡后，常规HE染色、光镜下观察。
1.3 原位缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡 组织切片常规脱蜡、水合，用蛋白酶K20μg/ml(10mmol/LTris-HCl，pH7.4)于37℃保温15min，然后每片加50μl标记反应混合物(含100mmol/L砷酸盐，0.1mmol/LDTT，4μmol/L地高辛-ll-dUTP和10U末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，在37℃湿盒中保温1h，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗后，与抗-Dig-抗体复合物(37.5mU/ml)保温30min，PBS液洗，再于显色缓冲液(0.1mol/LTris-HCl，pH9.5，0.1mol/LNaCl，50mmol/LMgCl2)中用碱性磷酸酶的显色底物NBT/BCIP显色，显色完全后用TE缓冲液中止反应。伊红复染、封片，显微镜下观察并拍摄。TUNEL检测阴性对照为在标记反应混合物中不加TdT，余操作步骤相同。
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1.4 统计分析 利用测微网测量计算每一样品的凋亡指数，每一切片观察10个独立视野，计算凋亡的心肌细胞(核被染色)数，凋亡指数＝(核着色的心肌细胞数/总心肌细胞数)×100%，并以此进行组间比较。
2 结 果
2.1 HE染色 缺血20min/再灌注24h后(B和C组)，光镜下可观察到心肌细胞出现典型的凋亡形态：细胞皱缩、细胞核固缩、核碎片和凋亡小体形成。但经NAC处理组(C)较未处理组(B)具备上述凋亡特征的细胞数明显减少。Sham组(A)细胞基本未见凋亡形态特征。
2.2 TUNEL法检测结果 组织切片中的凋亡细胞经TUNEL法染色后可见细胞核呈蓝紫色。Sham组(A)和TUENL阴性对照均无显著阳性细胞核(凋亡指数<5%)，未经药物处理组(B)凋亡显著(心肌细胞凋亡指数67%±5%，与A组比较P<0.01)，而经NAC处理组(C)阳性细胞核数明显减少(38%±3%，与B组比较P<0.01)(见图1)。
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Sham组(A) 缺血再灌注组(B)无药物保护 缺血再灌注组(C)，经NAC预处理
图1 TUNEL染色结果(目镜×20)
3 讨 论
缺血再灌注损伤的形成机制一直是心血管领域的重要研究课题，近年来由于分子生物学和细胞生物学技术的发展和应用，已证明细胞凋亡在MI/R损伤机制中起重要作用。因此，研究是否可通过抑制心肌细胞凋亡来保护缺血再灌注心肌，减少损伤，对于指导临床治疗和预后以及寻找新的更有效的治疗药物，均有十分重要的意义。
本研究的结果表明NAC可有效抑制缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡，其机制可能与NAC的抗氧化作用有关。大量研究已经证明氧化张力可诱导细胞发生凋亡，在生理状态下细胞内的氧化和抗氧化机制间处于一种平衡状态，但在许多病理状态下，细胞内会产生大量的氧自由基，使这种平衡被破坏，从而导致氧化张力。有大量研究表明氧自由基的爆发形成在缺血再灌注损伤中起重要作用〔4，5〕。N-乙酰-L-半胱氨酸本身是一种氧自由基清除剂，可直接起作用，同时它又是谷胱甘肽的前体，后者在维持胞内氧化还原平衡以及保护细胞不受氧化损伤中有重要的作用。有证据表明氧自由基清除剂如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶、维生素E等均可有效抑制氧化张力诱导的细胞凋亡〔6，7〕。本文的研究结果进一步证明缺血再灌注损伤相关的细胞凋亡与氧化张力有重要的关系，而抗氧化剂如NAC可促进损伤条件下心肌细胞的存活，对这类化合物在缺血再灌注损伤中的保护作用进行深入的研究，不仅有助于揭示缺血再灌注损伤的分子和细胞机制，也将为寻找新的临床治疗药物打下良好的基础。
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1 本课题为铁道部科技发展基金资助
作者简介：胡向阳，女，35岁，讲师，研究方向：心血管分子生物学
参考文献
1 Gottlieb RA, Burleson KO, Kloner RA et al.Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes.J Clin Invest，1994；94：1621
2 Colucci WS.Apoptosis in the heart.N Engl J Med，1996；335：1224
3 Buerke M, Murohara T, Skurk C et al.Cardioprotective effects of insulin-like growth factor I in myocardial ischemia followed by reperfusion.Proc Natl Acad Sci USA，1995；92：8031
, 百拇医药
4 McCord JM.Oxygen-derived radicals:a link between reperfusion injury and inflammation.Fed Proc，1994；46：2402
5 Zweier JL, Flaherty JT，Weisfeldt ML.Direct measurement of free radical generation following reperfusion of ischemic myocardium.Proc Natl Acad Sci USA，1987；84：1404
6 Buttke TM.Oxidative stress as a mediator of apoptosis.Immunol，1994；15：7
7 Kayanoki Y.The protective role of glutathione peroxidase in apoptosis induced by reactive oxygen species.J Biochem(Tokyo)，1996；119：817
〔1998-09-25收稿 1999-01-18修回〕, http://www.100md.com