识别人类白血病白细胞的生物传感器研究
作者：蔡豪斌
单位：桂林医学院生物工程研究所 广西桂林市 541004
关键词：细胞识别生物传感器；半微分循环伏安法；白血病；白细胞
华夏医学990401 摘要 本文介绍一种以平面热解石墨电极为工作电极,用于识别人类白血病白细胞的半微分伏安型生物传感器。综合使用作者提出的四个电化学识别指标(氧化峰电位Ep,不同扫描电位下氧化峰电位的差值ΔEp,膜上单位细胞数的氧化峰电流Ip/cells以及氧化扫描与还原扫描相应的出峰情况),实现了对人类正常与异常白细胞、各种临床分型白血病白细胞的识别。
中图分类号 R318.6
Research on the Biosensor Which Can Discriminate Human Leukemia Leucocyte
, 百拇医药
Cai Haobin
Institute of Bioengineering,Guilin Medical College (541001)
Abstract A Biosensor which can discriminate human leukemia leukocyte is reported.With the four discrimination indexes:the anodic peak potential(Ep),the difference of anodic peak potential between two rates of voltage-scan(ΔEp),the currants at anodic peak potential to a constant cell numbers (Ip/cells) and the cathodic peak in inverse voltage-scan,the researcher had successfully discriminated normal and abnormal leukocyte,and had even identified the clinical types of leukemia.
, 百拇医药
Key words cell-discrimination biosensor;semi-differential voltammetry;leukemia;leukocyte
正常人淋巴细胞和粒细胞由于其生理代谢水平及细胞膜结构的差异,使其在石墨平面热解电极上的循环伏安响应存在差异,据此作者已报道了一种能识别健康人淋巴细胞和粒细胞的生物传感器[1]。病理状态下如白血病和某些贫血,其白细胞的膜结构及生理代谢水平的差异远远高于正常人[2]。基于此原理,本文进行了正常和异常白细胞、各种临床分型白血病白细胞识别的生物传感器研究。
1 材料与方法
1.1 仪器与实验装置 以自制的平面热解石墨电极(电极圆盘面积0.196cm2,热解石墨块由中国科学院沈阳金属研究所提供)为基础电极,借助于一个膜支架与阻留在硝酸纤维滤膜上的白细胞紧密相接构成电化学细胞传感器,其与铂电极和银/氯化银参比电极组成传统的三电极伏安测量体系。此电极体系与HS-1型微机化极谱仪(福建三明无线电厂)相联以实现半微分伏安测量。另用CR3A型谱图处理仪(Shimadzu,Japan)记录伏安信号并对峰位置、峰高等峰值进行自动处理。整个生物传感器系统示意图参见文献1。
, 百拇医药
1.2 材料与试剂 配制磷酸缓冲生理盐水(PBS,KH2PO4:1.5mmol/L,Na2HPO4:6.2mmol/L,KCl:2.7mmol/L,NaCl:137mmol/L,pH=7.00)，所用的试剂均为分析纯,所有实验用水均为超纯水,系由一台UHQ超级纯水器(Elgastat,Eng-
land)在临用时制备。硝酸纤维滤膜(孔径0.45μ)购自美国Gibeco公司。实验用的人白细胞均由哈尔滨医科大学第一临床医学院血液病研究室提供并作细胞形态学鉴定。
1.3 白细胞伏安检测的一般步骤 从健康人或患者血样中分离出的白细胞(可能及必要时,也进一步地从白细胞中分离出淋巴细胞和粒细胞)经PBS溶液反复离心洗涤后,重悬浮在PBS溶液中制成一定浓度的细胞悬液,定量吸取此细胞悬液50～200μl滴加到硝酸纤维滤膜上,迅速抽滤制成细胞阻留膜,然后立即将此细胞阻留膜附着在平面热解石墨电极上,以PBS溶液为底液，(37±0.05)℃的环境中,在0.000～1.000伏(vs.Ag/AgCl)电压范围内以一定的电位扫描速率进行半微分循环伏安扫描分析。
, 百拇医药
2 结果与讨论
2.1 恶性病变白细胞的识别 将实验细胞分为三组，分别是健康人白细胞A组(分离淋巴细胞和粒细胞)、恶性病变患者白细胞B组(包括各类白血病、淋巴瘤和癌转移患者白细胞)和一般病变患者白细胞C组(包括贫血、炎症等患者的淋巴细胞和粒细胞)。表1列出了这三组细胞的ΔEp值(100mv/sec电位扫描速率下氧化峰电位与10mv/sec电位扫描速率下氧化峰电位的差值),并进行了统计学处理。从表1所列A、B和C各组的ΔEp值来看,恶性病变白细胞的B组最小,而正常白细胞的A组最大,一般病变白细胞的C组居于二者之间。各组间ΔEp的差异均具高度显著性意义。ΔEp值的大小与电极活性物质向电极传递电子的速率快慢,以及电极上发生的电化学反应速率常数的大小有关[3]。人白细胞与石墨电极间的电子传递媒介(电极活性物质)是细胞膜结构上的辅酶A，已为多位研究者所证实[1，4]。本实验中健康人白细胞(包括淋巴细胞和粒细胞)的ΔEp值均在60mv以上,显著地高于恶性病变患者(小于10mv)及一般病变患者白细胞的ΔEp值,表明在健康人白细胞中辅酶A的电化学反应速率常数和/或电子传递速率均维持在一个较低的水平。换言之,具有正常质膜结构和正常代谢水平的健康人白细胞在平面热解石墨电极上具有较低的电化学活性。众所周知,恶性肿瘤细胞具有结构及代谢的高度异常性,据此可以推测:恶性病变患者白细胞由于质膜结构的异型使得辅酶A向平面热解石墨电极传递电子的速率大大加快;而辅酶A在平面热解石墨电极上反应速率常数的增大则正是恶性肿瘤细胞代谢高度异常的结果。一般病变患者估计仅仅是细胞代谢水平的增加而无质膜结构的异常故其ΔEp值居于健康人和恶性病变患者之间。因此,ΔEp是识别恶性病变患者白细胞的一个重要指标。
, http://www.100md.com
表1 健康人、恶性病变患者和一般病变患者白细胞ΔEp值比较
(V1=10mv/sec,V2=100mv/sec,ΔEp=ΔEpV2-ΔEpV1) 组别
样本数
范围
平均值
健康人A组
20
62～96mv
82mv
恶性病变患者B组
, http://www.100md.com
34
2～8mv
5.7mv
一般病变患者C组
20
22～45mv
35.8mv
tA-B=11.535, P<0.01; tA-C=4.2764， P<0.01;
tB-C=4.1575, P<0.01
A、B和C三组的部分血样每十万个白细胞数所产生的峰电流值的比较见表2。
, 百拇医药
表2 A、B和C组白细胞的Ip/cells比较
(V=100mv/sec,Unit=μA/105cells) 健康人
白细胞
A组
恶性病变白细胞B组
一般病变白细胞C组
急性
白血病
慢性
白血病
再障性
, 百拇医药 贫血
溶血性、缺铁性
贫血
发热
2.2
74.0
1.1
0.08
422.5
10.9
1.8
65.6
1.8
, http://www.100md.com
0.02
2190.8
16.9
3.3
200.8
3.2
0.17
321.4
9.7
3.5
41.3
657.1
6.9
, 百拇医药
3.2
401.8
14.0
2.3
41760.0
表2结果明显地表明Ip/cells这一指标反映了细胞的代谢水平:健康人白细胞的Ip/cells维持在一个相对一致的低值;急性白血病及急性炎症患者的Ip/cells数倍甚至数万倍于健康人,这显然是急性病变患者代谢活动极其旺盛的结果。值得注意的是再生障碍性贫血患者白细胞的Ip/cells显著的低于健康人，而失血性缺铁性贫血患者白细胞的Ip/cells则数百甚至数千倍于健康人,这与再障性贫血是由于骨髓功能的原发性受抑制，而缺铁性贫血和溶血性贫血的骨髓造血功能代偿性增强这一事实是相符合的。
2.2 临床分型白血病白细胞的识别 在临床上主要将白血病分为四型,即急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病。由于这四型白血病的化疗用药及预后均不相同,正确识别之具有重要的临床意义。表3是以本生物传感器系统对从临床获得的16份经细胞形态学确诊的白血病患者白细胞进行识别实验的结果。表3 白血病白细胞的识别实验结果 序号
, 百拇医药
Ep
(mv)
Ip/cells
(μA/105cells)
ΔEp
(mv)
还原峰
传感器
识别
临床
诊断
1
564
, 百拇医药
243.0
5
无
急淋白
急淋白
2
566
304.0
4
无
急淋白
急淋白
3
582
, 百拇医药
379.0
7
无
急淋白
急淋白
4
589
21.1
8
无
急淋白
急淋白
5
588
, 百拇医药
25.6
5
无
急淋白
急淋白
6
601
21.7
4
无
急淋白
急淋白
7
622
, http://www.100md.com
4457.6
3
有
急粒白
急粒白
8
630
41760.0
2
有
急粒白
急粒白
9
, http://www.100md.com 650
17075.0
6
有
急粒白
急粒白
10
632
28.4
7
有
急粒白
急粒白
11
, http://www.100md.com
630
200.8
6
有
急粒白
急粒白
12
623
65.6
4
有
急粒白
急粒白
, 百拇医药 13
626
74.0
7
有
急粒白
急粒白
14
601
3.2
5
无
慢淋白
慢淋白
, http://www.100md.com
15
634
1.8
3
有
慢粒白
慢粒白
16
616
11.1
6
有
慢粒白
慢粒白
, 百拇医药
结果表明,所有白血病患者的ΔEp值均小于10mv,反映了白血病的恶性病变性质,而急性白血病的Ip/cells数十、数百甚至数千倍于慢性白血病,这估计与急性白血病多为原始、幼稚型白细胞而慢性白血病多为成熟型白细胞,两者的代谢水平差异悬殊有关;粒细胞性白血病白细胞的氧化峰电位略高于淋巴细胞性白血病白细胞。另从回扫有无还原峰的情况看,粒细胞性白血病白细胞见一明显的还原峰。这些恰恰反映了这两种癌细胞分别源于粒系及淋系血细胞这样一个事实。
3 结论
初步的研究已经表明用本生物传感器系统可以识别人类正常与异常白细胞,甚至已能识别白血病的临床分型。进一步的研究将是深入探索细胞在电极上的响应机理,进而拓展到其他肿瘤细胞的识别研究,以及直接应用于细胞生物学及细胞遗传毒理的研究。
参考文献
1 蔡豪斌,许春向.白细胞识别与计量生物传感器的研究.广西科学,1998,5(4):304～307
2 L.C.Jungueira.Basic Histology.3rd Edition.Lange Medical Publications.1980
3 F.Anson.电化学和电分析化学.黄蔚曾译.北京大学出版社,1980
4 T.Matsunage.Detection of Microbial Cells by Cyclic Voltamme-
try.Anal.Chem,1984,5(6):798～801
(收稿 1999-05-20), http://www.100md.com
单位：桂林医学院生物工程研究所 广西桂林市 541004
关键词：细胞识别生物传感器；半微分循环伏安法；白血病；白细胞
华夏医学990401 摘要 本文介绍一种以平面热解石墨电极为工作电极,用于识别人类白血病白细胞的半微分伏安型生物传感器。综合使用作者提出的四个电化学识别指标(氧化峰电位Ep,不同扫描电位下氧化峰电位的差值ΔEp,膜上单位细胞数的氧化峰电流Ip/cells以及氧化扫描与还原扫描相应的出峰情况),实现了对人类正常与异常白细胞、各种临床分型白血病白细胞的识别。
中图分类号 R318.6
Research on the Biosensor Which Can Discriminate Human Leukemia Leucocyte
, 百拇医药
Cai Haobin
Institute of Bioengineering,Guilin Medical College (541001)
Abstract A Biosensor which can discriminate human leukemia leukocyte is reported.With the four discrimination indexes:the anodic peak potential(Ep),the difference of anodic peak potential between two rates of voltage-scan(ΔEp),the currants at anodic peak potential to a constant cell numbers (Ip/cells) and the cathodic peak in inverse voltage-scan,the researcher had successfully discriminated normal and abnormal leukocyte,and had even identified the clinical types of leukemia.
, 百拇医药
Key words cell-discrimination biosensor;semi-differential voltammetry;leukemia;leukocyte
正常人淋巴细胞和粒细胞由于其生理代谢水平及细胞膜结构的差异,使其在石墨平面热解电极上的循环伏安响应存在差异,据此作者已报道了一种能识别健康人淋巴细胞和粒细胞的生物传感器[1]。病理状态下如白血病和某些贫血,其白细胞的膜结构及生理代谢水平的差异远远高于正常人[2]。基于此原理,本文进行了正常和异常白细胞、各种临床分型白血病白细胞识别的生物传感器研究。
1 材料与方法
1.1 仪器与实验装置 以自制的平面热解石墨电极(电极圆盘面积0.196cm2,热解石墨块由中国科学院沈阳金属研究所提供)为基础电极,借助于一个膜支架与阻留在硝酸纤维滤膜上的白细胞紧密相接构成电化学细胞传感器,其与铂电极和银/氯化银参比电极组成传统的三电极伏安测量体系。此电极体系与HS-1型微机化极谱仪(福建三明无线电厂)相联以实现半微分伏安测量。另用CR3A型谱图处理仪(Shimadzu,Japan)记录伏安信号并对峰位置、峰高等峰值进行自动处理。整个生物传感器系统示意图参见文献1。
, 百拇医药
1.2 材料与试剂 配制磷酸缓冲生理盐水(PBS,KH2PO4:1.5mmol/L,Na2HPO4:6.2mmol/L,KCl:2.7mmol/L,NaCl:137mmol/L,pH=7.00)，所用的试剂均为分析纯,所有实验用水均为超纯水,系由一台UHQ超级纯水器(Elgastat,Eng-
land)在临用时制备。硝酸纤维滤膜(孔径0.45μ)购自美国Gibeco公司。实验用的人白细胞均由哈尔滨医科大学第一临床医学院血液病研究室提供并作细胞形态学鉴定。
1.3 白细胞伏安检测的一般步骤 从健康人或患者血样中分离出的白细胞(可能及必要时,也进一步地从白细胞中分离出淋巴细胞和粒细胞)经PBS溶液反复离心洗涤后,重悬浮在PBS溶液中制成一定浓度的细胞悬液,定量吸取此细胞悬液50～200μl滴加到硝酸纤维滤膜上,迅速抽滤制成细胞阻留膜,然后立即将此细胞阻留膜附着在平面热解石墨电极上,以PBS溶液为底液，(37±0.05)℃的环境中,在0.000～1.000伏(vs.Ag/AgCl)电压范围内以一定的电位扫描速率进行半微分循环伏安扫描分析。
, 百拇医药
2 结果与讨论
2.1 恶性病变白细胞的识别 将实验细胞分为三组，分别是健康人白细胞A组(分离淋巴细胞和粒细胞)、恶性病变患者白细胞B组(包括各类白血病、淋巴瘤和癌转移患者白细胞)和一般病变患者白细胞C组(包括贫血、炎症等患者的淋巴细胞和粒细胞)。表1列出了这三组细胞的ΔEp值(100mv/sec电位扫描速率下氧化峰电位与10mv/sec电位扫描速率下氧化峰电位的差值),并进行了统计学处理。从表1所列A、B和C各组的ΔEp值来看,恶性病变白细胞的B组最小,而正常白细胞的A组最大,一般病变白细胞的C组居于二者之间。各组间ΔEp的差异均具高度显著性意义。ΔEp值的大小与电极活性物质向电极传递电子的速率快慢,以及电极上发生的电化学反应速率常数的大小有关[3]。人白细胞与石墨电极间的电子传递媒介(电极活性物质)是细胞膜结构上的辅酶A，已为多位研究者所证实[1，4]。本实验中健康人白细胞(包括淋巴细胞和粒细胞)的ΔEp值均在60mv以上,显著地高于恶性病变患者(小于10mv)及一般病变患者白细胞的ΔEp值,表明在健康人白细胞中辅酶A的电化学反应速率常数和/或电子传递速率均维持在一个较低的水平。换言之,具有正常质膜结构和正常代谢水平的健康人白细胞在平面热解石墨电极上具有较低的电化学活性。众所周知,恶性肿瘤细胞具有结构及代谢的高度异常性,据此可以推测:恶性病变患者白细胞由于质膜结构的异型使得辅酶A向平面热解石墨电极传递电子的速率大大加快;而辅酶A在平面热解石墨电极上反应速率常数的增大则正是恶性肿瘤细胞代谢高度异常的结果。一般病变患者估计仅仅是细胞代谢水平的增加而无质膜结构的异常故其ΔEp值居于健康人和恶性病变患者之间。因此,ΔEp是识别恶性病变患者白细胞的一个重要指标。
, http://www.100md.com
表1 健康人、恶性病变患者和一般病变患者白细胞ΔEp值比较
(V1=10mv/sec,V2=100mv/sec,ΔEp=ΔEpV2-ΔEpV1) 组别
样本数
范围
平均值
健康人A组
20
62～96mv
82mv
恶性病变患者B组
, http://www.100md.com
34
2～8mv
5.7mv
一般病变患者C组
20
22～45mv
35.8mv
tA-B=11.535, P<0.01; tA-C=4.2764， P<0.01;
tB-C=4.1575, P<0.01
A、B和C三组的部分血样每十万个白细胞数所产生的峰电流值的比较见表2。
, 百拇医药
表2 A、B和C组白细胞的Ip/cells比较
(V=100mv/sec,Unit=μA/105cells) 健康人
白细胞
A组
恶性病变白细胞B组
一般病变白细胞C组
急性
白血病
慢性
白血病
再障性
, 百拇医药 贫血
溶血性、缺铁性
贫血
发热
2.2
74.0
1.1
0.08
422.5
10.9
1.8
65.6
1.8
, http://www.100md.com
0.02
2190.8
16.9
3.3
200.8
3.2
0.17
321.4
9.7
3.5
41.3
657.1
6.9
, 百拇医药
3.2
401.8
14.0
2.3
41760.0
表2结果明显地表明Ip/cells这一指标反映了细胞的代谢水平:健康人白细胞的Ip/cells维持在一个相对一致的低值;急性白血病及急性炎症患者的Ip/cells数倍甚至数万倍于健康人,这显然是急性病变患者代谢活动极其旺盛的结果。值得注意的是再生障碍性贫血患者白细胞的Ip/cells显著的低于健康人，而失血性缺铁性贫血患者白细胞的Ip/cells则数百甚至数千倍于健康人,这与再障性贫血是由于骨髓功能的原发性受抑制，而缺铁性贫血和溶血性贫血的骨髓造血功能代偿性增强这一事实是相符合的。
2.2 临床分型白血病白细胞的识别 在临床上主要将白血病分为四型,即急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病。由于这四型白血病的化疗用药及预后均不相同,正确识别之具有重要的临床意义。表3是以本生物传感器系统对从临床获得的16份经细胞形态学确诊的白血病患者白细胞进行识别实验的结果。表3 白血病白细胞的识别实验结果 序号
, 百拇医药
Ep
(mv)
Ip/cells
(μA/105cells)
ΔEp
(mv)
还原峰
传感器
识别
临床
诊断
1
564
, 百拇医药
243.0
5
无
急淋白
急淋白
2
566
304.0
4
无
急淋白
急淋白
3
582
, 百拇医药
379.0
7
无
急淋白
急淋白
4
589
21.1
8
无
急淋白
急淋白
5
588
, 百拇医药
25.6
5
无
急淋白
急淋白
6
601
21.7
4
无
急淋白
急淋白
7
622
, http://www.100md.com
4457.6
3
有
急粒白
急粒白
8
630
41760.0
2
有
急粒白
急粒白
9
, http://www.100md.com 650
17075.0
6
有
急粒白
急粒白
10
632
28.4
7
有
急粒白
急粒白
11
, http://www.100md.com
630
200.8
6
有
急粒白
急粒白
12
623
65.6
4
有
急粒白
急粒白
, 百拇医药 13
626
74.0
7
有
急粒白
急粒白
14
601
3.2
5
无
慢淋白
慢淋白
, http://www.100md.com
15
634
1.8
3
有
慢粒白
慢粒白
16
616
11.1
6
有
慢粒白
慢粒白
, 百拇医药
结果表明,所有白血病患者的ΔEp值均小于10mv,反映了白血病的恶性病变性质,而急性白血病的Ip/cells数十、数百甚至数千倍于慢性白血病,这估计与急性白血病多为原始、幼稚型白细胞而慢性白血病多为成熟型白细胞,两者的代谢水平差异悬殊有关;粒细胞性白血病白细胞的氧化峰电位略高于淋巴细胞性白血病白细胞。另从回扫有无还原峰的情况看,粒细胞性白血病白细胞见一明显的还原峰。这些恰恰反映了这两种癌细胞分别源于粒系及淋系血细胞这样一个事实。
3 结论
初步的研究已经表明用本生物传感器系统可以识别人类正常与异常白细胞,甚至已能识别白血病的临床分型。进一步的研究将是深入探索细胞在电极上的响应机理,进而拓展到其他肿瘤细胞的识别研究,以及直接应用于细胞生物学及细胞遗传毒理的研究。
参考文献
1 蔡豪斌,许春向.白细胞识别与计量生物传感器的研究.广西科学,1998,5(4):304～307
2 L.C.Jungueira.Basic Histology.3rd Edition.Lange Medical Publications.1980
3 F.Anson.电化学和电分析化学.黄蔚曾译.北京大学出版社,1980
4 T.Matsunage.Detection of Microbial Cells by Cyclic Voltamme-
try.Anal.Chem,1984,5(6):798～801
(收稿 1999-05-20), http://www.100md.com