原发性胆囊癌患者手术前后NK细胞活性及T细胞亚群的改变
作者：石景森 刘刚 于跃利 何平 康拖会 王敏
单位：西安医科大学第一附属医院肝胆外科研究室(710000)石景森 刘刚 于跃利 何平；山西省兴县人民医院外二科 康拖会；西安医科大学第一附属医院病理科 王敏
关键词：原发性胆囊癌；免疫
中国现代医学杂志990401 目的：探讨原发性胆囊癌患者手术前后机体自然免疫防御机能和后天获得性免疫机能的对比结果。方法：以15例手术前后的原发性胆囊癌患者及25例正常对照为研究对象，采用微量细胞毒试验-LDH释放法及碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶法(PAP)，对自然杀伤细胞(NK)活性和T细胞亚群变化进行了序列测定。结果：原发性胆囊癌患者的NK细胞活性和T细胞亚群中CD3+，CD4+细胞均明显低于正常对照组，而CD8+细胞增高，CD4+/CD8+细胞比值减小，胆囊癌术后患者几种细胞免疫功能指标在原有功能抑制基础上进一步降低，呈现出一个短暂的术后免疫抑制期，继而各项免疫指标均有不同程度的恢复，该抑制期持续时间长短与胆囊癌患者的预后密切相关。结论：胆囊癌根治术可消除这种肿瘤性免疫抑制，提高NK细胞活性和CD3+，CD4+细胞百分值，对原发性胆囊癌患者手术前后定期比较NK细胞活性和T细胞亚群的变化，有助于对患者的预后作出正确评估。
, http://www.100md.com
关键词 R735.8
胆囊癌作为较少见的恶性肿瘤，近年来其发病率有增高趋势，但其手术治疗效果仍不令人满意[1]。近年来许多学者在深入进行胆囊癌的基础研究，不断改进手术方法及各种综合治疗措施的同时，积极探索各种疗效监测及预后评估的有效手段，本研究以手术前后的原发性胆囊癌患者为研究对象，对其术后NK细胞活性及T细胞亚群的变化进行了动态观察，并结合临床资料探讨了术后患者细胞免疫功能的变化及其临床意义。
1 材料与方法
1.1 研究对象
原发性胆囊癌患者15例，年龄31～70岁，平均45岁，正常对照组为25例健康体检者，年龄20～60岁，平均43岁。
1.2 方法
, 百拇医药 所有受检者在实验前2周内均未接受化疗，血液制品及免疫调节剂，并于术晨空腹抽取肘静脉血2ml进行以下免疫学测定：
(1)NK细胞活性测定采用微量细胞毒试验-LDH释放法，以外周血淋巴细胞(PBL)为效应细胞，以K562细胞系为靶细胞，两者按10：1比例混合，以NP-40作用于靶细胞为最大释放，并以板式酶联检测仪测其杀伤孔，自然释放孔和最大释放孔OD值，求得NK细胞杀伤活性百分率。
(2)T细胞亚群测定采用碱性磷酸酶法(PAP)，取外周静脉血分离出单个核淋巴细胞并涂片(每片细胞数约1.0×105)，干燥及固定后依次滴加一抗(抗CD3+，抗CD4+，抗CD8+单克隆抗体，Becton Dickinson)、二抗(兔抗鼠IgG,Dakopatts),三抗(酶-抗酶复合体，Dakopatts)，每一抗体于室温下作用30min，用PBS冲洗3次后滴加酶底物溶液，室温下作用30min，苏木素复染15min，冲洗后用甘油明胶封片，油镜下计数200个细胞，以细胞周围一圈红染者为阳性。
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1.3 统计学处理
根据数据性质采用t检验。
2 结果
原发性胆囊癌患者手术前后外周血NK细胞活性及T细胞亚群变化见表1，2。
表1 原发性胆囊癌患者手术前后外周血NK细胞活性测定 组别
例数
时间
NK细胞杀伤活性百分率(%)
正常对照组
25
-
, 百拇医药
29.72±4.39
原发性胆囊癌
15
术前
16.70±1.401)
术后2周
15.02±1.622)
术后1月
27.34±3.223)
注：1)与正常对照组相比P<0.001
2)与术前相比P<0.01
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3)与正常对照组相比P>0.05
原发性胆囊癌患者术前NK细胞活性和T细胞亚群中CD3+，CD4+细胞均明显低于正常对照组(P<0.001)，而CD8+细胞增高(P<0.01)，CD4+/CD8+细胞比值减小(P<0.05)。术后2周NK细胞活性及CD3+，CD4+细胞值较术前进一步下降，CD8+细胞值升高(P<0.05)，CD4+/CD8+细胞比值虽较术前减小但无显著性差异(P>0.05)。术后1月，各项指标均有不同程度的回升(P>0.05)，而部分未能获得根治或术后复发的病例随着病程进展表现为进行性下降趋势。
表2 原发性胆囊癌患者手术前后T细胞亚群测定(%) 组别
, http://www.100md.com 例数
时间
CD3+
CD4+
CD8+
CD4+/CD8+
正常对照组
25
-
73.75±2.00
, 百拇医药
46.52±4.38
19.85±3.47
2.34±1.26
原发性胆囊癌组
15
术前
55.13±2.961)
33.78±1.551)
22.81±2.602)
1.48±0.593)
术后2周
, 百拇医药
52.64±2.644)
31.41±2.214)
25.39±3.324)
1.24±1.265)
术后1月
71.27±5.806)
44.14±1.756)
21.74±1.436)
2.03±1.226)
, 百拇医药
注：1) 与正常对照组相比 P<0.001
2) 与正常对照组相比 P<0.01
3) 与正常对照组相比P<0.05
4) 与术前相比 P<0.05
5) 与术前相比 P>0.05
6) 与正常对照组相比 P>0.05
3 讨论
机体抗肿瘤免疫以细胞免疫为主，除T细胞参与外，NK细胞在免疫监视、杀伤靶细胞与免疫调节方面起重要作用，近来发现NK细胞是LAK细胞的前驱细胞之一，NK细胞与T细胞在体外杀伤肿瘤细胞时具有协同效应[2]，已有研究表明乳癌、胃癌、结肠癌等实体瘤的患者外周血NK细胞活性较正常人低，本研究结果表明，在原发性胆囊癌患者中，机体自然免疫防御机能和后天获得性免疫机能呈平行关系，表现为NK细胞活性的降低和T细胞亚群中CD3+，CD4+细胞的减少，CD8+细胞的增高，而CD4+/CD8+细胞的比值减小，从而证明原发性胆囊癌患者的总体免疫机能低下，呈受抑制状态。此外，本研究术后不完全随访观察资料结果还表明，病期越晚，血NK细胞活性越低。而且不同分化程度的原发性胆囊癌患者其血NK细胞水平也有差异，表现为细胞分化程度越低，其血NK细胞活性水平越低，胆囊癌根治性切除术后患者几种细胞免疫功能指标在原有功能抑制基础上进一步降低，呈现出一个短暂的免疫抑制期，该抑制期持续时间的长短与根治切除的效果及术后复发密切相关。
, 百拇医药
洪鹤群等[3]通过对100例胃癌患者天然杀伤细胞活性监测发现，这种肿瘤性免疫抑制程度与肿瘤的大小、有无扩展及转移有关。本研究表明：胆囊癌根治术可消除这种肿瘤性免疫抑制，提高NK细胞活性和CD3+，CD4+细胞的百分值(术后1月)，而未能获得根治切除的患者，则仍表现为免疫机能低下(抑制状态)。提示肿瘤灶的去除是消除免疫抑制，恢复免疫功能的重要条件，但手术本身的创伤又加重原有的免疫抑制，在本组随访的患者中，有3例术后复发，而其各项免疫指标均呈明显低下且持续时间较长，由此可见原发性胆囊癌患者术后免疫功能能否迅速恢复不仅直接影响到手术效果，而且是影响预后的一个重要因素。
总之，我们认为，随着对原发性胆囊癌综合治疗的开展，各种放、化疗及肿瘤免疫治疗的应用及其防治和预后评估的开展，应重视对肿瘤病人的免疫监测，对术后接受化疗或放疗的患者，除注意观察其临床副反应外，也应重视定期的免疫机能检查，如手术前后定期比较其NK细胞活性和T细胞亚群的变化，不但有助于正确的预后评估，而且可作为一种可靠的监测手段，合理调整化疗药物或放疗的剂量和使用期，使术后各种辅佐性化疗、放疗和其它抗肿瘤疗法更加合理化。此外，对术后免疫功能进一步低下的患者应适时纠正并缩短其术后免疫抑制期，这对观察转归、进一步提高原发性胆囊癌的临床治疗效果和病人的生存率具有极其重要的意义。
, http://www.100md.com
参考文献
1 石景森，刘 刚，周连锁，等.原发性胆囊癌601例临床分析.中华肝胆外科杂志，1998；4(4)：216～218
2 王连聪，吴金明，郑 晓，等.鼻咽癌外周血NK细胞活性的分析研究.浙江医科大学学报，1996；25(4)：157～159
3 洪鹤群，李中华，朱正纲，等.胃癌病人天然杀伤细胞活性监测.上海第二医科大学学报，1990；10：131～134
1998-10-22收稿
, 百拇医药
单位：西安医科大学第一附属医院肝胆外科研究室(710000)石景森 刘刚 于跃利 何平；山西省兴县人民医院外二科 康拖会；西安医科大学第一附属医院病理科 王敏
关键词：原发性胆囊癌；免疫
中国现代医学杂志990401 目的：探讨原发性胆囊癌患者手术前后机体自然免疫防御机能和后天获得性免疫机能的对比结果。方法：以15例手术前后的原发性胆囊癌患者及25例正常对照为研究对象，采用微量细胞毒试验-LDH释放法及碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶法(PAP)，对自然杀伤细胞(NK)活性和T细胞亚群变化进行了序列测定。结果：原发性胆囊癌患者的NK细胞活性和T细胞亚群中CD3+，CD4+细胞均明显低于正常对照组，而CD8+细胞增高，CD4+/CD8+细胞比值减小，胆囊癌术后患者几种细胞免疫功能指标在原有功能抑制基础上进一步降低，呈现出一个短暂的术后免疫抑制期，继而各项免疫指标均有不同程度的恢复，该抑制期持续时间长短与胆囊癌患者的预后密切相关。结论：胆囊癌根治术可消除这种肿瘤性免疫抑制，提高NK细胞活性和CD3+，CD4+细胞百分值，对原发性胆囊癌患者手术前后定期比较NK细胞活性和T细胞亚群的变化，有助于对患者的预后作出正确评估。
, http://www.100md.com
关键词 R735.8
胆囊癌作为较少见的恶性肿瘤，近年来其发病率有增高趋势，但其手术治疗效果仍不令人满意[1]。近年来许多学者在深入进行胆囊癌的基础研究，不断改进手术方法及各种综合治疗措施的同时，积极探索各种疗效监测及预后评估的有效手段，本研究以手术前后的原发性胆囊癌患者为研究对象，对其术后NK细胞活性及T细胞亚群的变化进行了动态观察，并结合临床资料探讨了术后患者细胞免疫功能的变化及其临床意义。
1 材料与方法
1.1 研究对象
原发性胆囊癌患者15例，年龄31～70岁，平均45岁，正常对照组为25例健康体检者，年龄20～60岁，平均43岁。
1.2 方法
, 百拇医药 所有受检者在实验前2周内均未接受化疗，血液制品及免疫调节剂，并于术晨空腹抽取肘静脉血2ml进行以下免疫学测定：
(1)NK细胞活性测定采用微量细胞毒试验-LDH释放法，以外周血淋巴细胞(PBL)为效应细胞，以K562细胞系为靶细胞，两者按10：1比例混合，以NP-40作用于靶细胞为最大释放，并以板式酶联检测仪测其杀伤孔，自然释放孔和最大释放孔OD值，求得NK细胞杀伤活性百分率。
(2)T细胞亚群测定采用碱性磷酸酶法(PAP)，取外周静脉血分离出单个核淋巴细胞并涂片(每片细胞数约1.0×105)，干燥及固定后依次滴加一抗(抗CD3+，抗CD4+，抗CD8+单克隆抗体，Becton Dickinson)、二抗(兔抗鼠IgG,Dakopatts),三抗(酶-抗酶复合体，Dakopatts)，每一抗体于室温下作用30min，用PBS冲洗3次后滴加酶底物溶液，室温下作用30min，苏木素复染15min，冲洗后用甘油明胶封片，油镜下计数200个细胞，以细胞周围一圈红染者为阳性。
, http://www.100md.com
1.3 统计学处理
根据数据性质采用t检验。
2 结果
原发性胆囊癌患者手术前后外周血NK细胞活性及T细胞亚群变化见表1，2。
表1 原发性胆囊癌患者手术前后外周血NK细胞活性测定 组别
例数
时间
NK细胞杀伤活性百分率(%)
正常对照组
25
-
, 百拇医药
29.72±4.39
原发性胆囊癌
15
术前
16.70±1.401)
术后2周
15.02±1.622)
术后1月
27.34±3.223)
注：1)与正常对照组相比P<0.001
2)与术前相比P<0.01
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3)与正常对照组相比P>0.05
原发性胆囊癌患者术前NK细胞活性和T细胞亚群中CD3+，CD4+细胞均明显低于正常对照组(P<0.001)，而CD8+细胞增高(P<0.01)，CD4+/CD8+细胞比值减小(P<0.05)。术后2周NK细胞活性及CD3+，CD4+细胞值较术前进一步下降，CD8+细胞值升高(P<0.05)，CD4+/CD8+细胞比值虽较术前减小但无显著性差异(P>0.05)。术后1月，各项指标均有不同程度的回升(P>0.05)，而部分未能获得根治或术后复发的病例随着病程进展表现为进行性下降趋势。
表2 原发性胆囊癌患者手术前后T细胞亚群测定(%) 组别
, http://www.100md.com 例数
时间
CD3+
CD4+
CD8+
CD4+/CD8+
正常对照组
25
-
73.75±2.00
, 百拇医药
46.52±4.38
19.85±3.47
2.34±1.26
原发性胆囊癌组
15
术前
55.13±2.961)
33.78±1.551)
22.81±2.602)
1.48±0.593)
术后2周
, 百拇医药
52.64±2.644)
31.41±2.214)
25.39±3.324)
1.24±1.265)
术后1月
71.27±5.806)
44.14±1.756)
21.74±1.436)
2.03±1.226)
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注：1) 与正常对照组相比 P<0.001
2) 与正常对照组相比 P<0.01
3) 与正常对照组相比P<0.05
4) 与术前相比 P<0.05
5) 与术前相比 P>0.05
6) 与正常对照组相比 P>0.05
3 讨论
机体抗肿瘤免疫以细胞免疫为主，除T细胞参与外，NK细胞在免疫监视、杀伤靶细胞与免疫调节方面起重要作用，近来发现NK细胞是LAK细胞的前驱细胞之一，NK细胞与T细胞在体外杀伤肿瘤细胞时具有协同效应[2]，已有研究表明乳癌、胃癌、结肠癌等实体瘤的患者外周血NK细胞活性较正常人低，本研究结果表明，在原发性胆囊癌患者中，机体自然免疫防御机能和后天获得性免疫机能呈平行关系，表现为NK细胞活性的降低和T细胞亚群中CD3+，CD4+细胞的减少，CD8+细胞的增高，而CD4+/CD8+细胞的比值减小，从而证明原发性胆囊癌患者的总体免疫机能低下，呈受抑制状态。此外，本研究术后不完全随访观察资料结果还表明，病期越晚，血NK细胞活性越低。而且不同分化程度的原发性胆囊癌患者其血NK细胞水平也有差异，表现为细胞分化程度越低，其血NK细胞活性水平越低，胆囊癌根治性切除术后患者几种细胞免疫功能指标在原有功能抑制基础上进一步降低，呈现出一个短暂的免疫抑制期，该抑制期持续时间的长短与根治切除的效果及术后复发密切相关。
, 百拇医药
洪鹤群等[3]通过对100例胃癌患者天然杀伤细胞活性监测发现，这种肿瘤性免疫抑制程度与肿瘤的大小、有无扩展及转移有关。本研究表明：胆囊癌根治术可消除这种肿瘤性免疫抑制，提高NK细胞活性和CD3+，CD4+细胞的百分值(术后1月)，而未能获得根治切除的患者，则仍表现为免疫机能低下(抑制状态)。提示肿瘤灶的去除是消除免疫抑制，恢复免疫功能的重要条件，但手术本身的创伤又加重原有的免疫抑制，在本组随访的患者中，有3例术后复发，而其各项免疫指标均呈明显低下且持续时间较长，由此可见原发性胆囊癌患者术后免疫功能能否迅速恢复不仅直接影响到手术效果，而且是影响预后的一个重要因素。
总之，我们认为，随着对原发性胆囊癌综合治疗的开展，各种放、化疗及肿瘤免疫治疗的应用及其防治和预后评估的开展，应重视对肿瘤病人的免疫监测，对术后接受化疗或放疗的患者，除注意观察其临床副反应外，也应重视定期的免疫机能检查，如手术前后定期比较其NK细胞活性和T细胞亚群的变化，不但有助于正确的预后评估，而且可作为一种可靠的监测手段，合理调整化疗药物或放疗的剂量和使用期，使术后各种辅佐性化疗、放疗和其它抗肿瘤疗法更加合理化。此外，对术后免疫功能进一步低下的患者应适时纠正并缩短其术后免疫抑制期，这对观察转归、进一步提高原发性胆囊癌的临床治疗效果和病人的生存率具有极其重要的意义。
, http://www.100md.com
参考文献
1 石景森，刘 刚，周连锁，等.原发性胆囊癌601例临床分析.中华肝胆外科杂志，1998；4(4)：216～218
2 王连聪，吴金明，郑 晓，等.鼻咽癌外周血NK细胞活性的分析研究.浙江医科大学学报，1996；25(4)：157～159
3 洪鹤群，李中华，朱正纲，等.胃癌病人天然杀伤细胞活性监测.上海第二医科大学学报，1990；10：131～134
1998-10-22收稿
, 百拇医药