急性低温低氧对大鼠下丘脑NOS及c-fos表达的影响

http://www.100md.com 《第三军医大学学报》 1999年第4期

     作者：范晓棠 阮怀珍 张金海 吴喜贵 袁碧波

    单位：范晓棠 阮怀珍 张金海 吴喜贵 袁碧波 第三军医大学基础医学部神经生物学教研室 重庆，400038

    关键词：急性低温低氧；NOS；c-fos；下丘脑；大鼠

    提要 目的

    提要 目的：探讨急性低温低氧对大鼠下丘脑NOS及c-fos表达的影响。方法：用c-fos免疫组化技术和NADPH-d组化法研究急性低温低氧大鼠下丘脑内c-fos原癌基因的表达、一氧化氮合酶(NOS)的分布及两者的共存。结果：急性低温低氧组大鼠：①下丘脑内c-fos表达明显增加，在许多核团呈恒定的核特异定位分布，其中室旁核、弓状核、腹内侧核、背内侧核表达最为强烈，乳头体前核、下丘脑后核有中等强度的表达，视上核偶有表达。②室旁核的大细胞部和视上核可见密集深染的NOS阳性大细胞。③在室旁核的小细胞部及其附近的区域约有10%～20%的中小型NOS阳性细胞同时表达c-fos蛋白，其它部位偶见双染细胞。以上结果与对照组比较差异显著，而1 d组和3 d组之间无明显变化。结论：下丘脑内的特定核团可能参与低氧反应的整合。一氧化氮(NO)作为一种非经典的新型神经递质和信息分子可能与低氧反应有关。

    中图法分类号 R345.44;R394.2

    Effects of acute hypoxia and hypothermia on expression of c-fos and NOS in the hypothalamus in rats^*

    Fan Xiaotang, Ruan Huaizhen, Zhang Jinhai, Wu Xigui, Yuan Bibo

    Department of Neurobiology, Third Military Medical University, Chongqing,400038

    Abstract Objective: To study the effects of acute hypoxia and hypothermia on the expression of c-fos and NOS in the hypothalamus in rats. Mehtods: The effects of acute hypoxia and hypothermia on the expression of c-fos and NOS were observed with c-fos immunohistochemical and NADPH-d histochemical staining. Results: The findings were as follows: ①c-fos expression in the hypothalamus was significantly increased with a nucleus specific distribution especially in the paraventricular nucleus, arcuate mucleus, ventromedial nucleus and dorsomedial nucleus. ②Dense and deeply stained NOS positive cells were seen in the magnocellular region of the paraventricular nucleus and supoptic nucleus. ③In the parvocellular region of the paraventricular nucleus and in the adjacent periventricular region, about 10%～20% NOS positive cells were also stained by c-fos immunohistochemistry. These findings were significantly different from those of the control but no evident difference was found between the One-day and 3-day groups. Conclusion: Specific nuclei in the hypothalamus might take part in the adjustement of and adaptation to hypoxia and nitric oxide, an atypical new neurotransmitter and message molecule, may be related to the adaptation to hypoxia.

    Key words acute hypoxia; acute hypothermia; NOS; c-fos; hypothalamus; rat

    高原是一种复杂的低温低氧环境，对机体多个系统产生影响。缺氧可引起下丘脑内TRHmRNA和AVPmRNA升高，并引起强烈的神经内分泌反应，说明下丘脑在低氧反应中起重要的中枢整合作用。NO作为一种信息分子参与众多与谷氨酸能相关的反应，NO是否参与了下丘脑的低氧适应反应尚未见报道。本研究运用模拟海拔6 000 m的高原缺氧模型，用c-fos免疫组化技术和NADPH-d组化法来观察下丘脑内一氧化氮合酶(NOS)和c-fos的表达及两者的共存，探讨高原缺氧在下丘脑内所作用的区域及NO是否参与下丘脑的低氧反应。

    1 材料与方法

    1.1 动物模型及分组

    实验用SD大鼠17只，体重为150～200 g，雌雄不拘。将大鼠随机分为正常对照组(n=5)和急性低温低氧组：1 d组(n=6)，3 d组(n=6)。将急性低温低氧组大鼠置于模拟海拔6 000 m的低压氧舱内(舱内温度为4℃)，每天6 h。

    1.2 免疫组化法

    实验毕，按常规进行大鼠组织灌流，固定，取出下丘脑，行冠状连续切片(35 μm)，然后进行ABC免疫组化染色：切片在1∶1000的c-fos抗血清(购自中山公司)中孵育48 h(4℃)，再依次进入生物素化羊抗兔血清(1∶200，Vector)及ABC(1∶200，Vector)于室温下各孵育3h，继之以DAB-H₂O₂呈色液显色。非特异对照和阴性对照分别采用正常兔血清和0.01 mol/L PBS代替一抗，随后的步骤完全相同，结果表明对照切片看不到免疫反应阳性细胞。

    1.3 NADPH-d组化法

    将切片放入含1mg/ml NADPH(Sigma,还原型)，0.1 mg/ml硝基四唑氮蓝(Sigma)，0.3% Triton X-100的0.1 mol/L PB缓冲液中(pH=7.4)37℃孵育40～60 min，然后将切片移至0.01 mol/L KPBS缓冲液中终止显色反应。

    1.4 NADPH-d组化和c-fos免疫组化的双重反应

    首先将切片进行c-fos免疫组化反应，显色后将切片充分漂洗进行NADPH-d组化反应。

    1.5 数据处理

    将每一动物同一部位的下丘脑切片随机抽取四张，作阳性细胞计数，取均数作为该动物的c-fos样免疫反应(c-fos-like immunoreactivity,FLI)数和NOS阳性细胞数。实验数据皆用微机经双样本t检验程序(PDA-2)进行统计学处理。结果以x±s表示。

    2 结果

    2.1 急性低温低氧大鼠下丘脑内NOS分布和表达

    光镜下可见急性低温低氧组大鼠下丘脑室旁核的大细胞部、视上核有密集深染的NOS阳性大细胞；室旁核的小细胞部、背内侧核、腹内侧核、弓状核、外侧区、室周区、乳头体前核可见深浅不一，疏密不等的NOS阳性细胞，1 d组与3 d组比较差异不显著，正常对照组在上述部位可见少量NOS阳性细胞，见图1，表1。

    2.2 急性低温低氧大鼠下丘脑c-fos的分布和表达

    光镜观察到急性低温低氧大鼠FLI在室旁核表达最为强烈，弓状核、腹内侧核、背内侧核均有强烈表达，乳头体前核、视前区、室周区有中等度的表达，视上核、下丘脑后核表达很少，1 d组与3 d组比较差异不显著。正常对照组在上述核团及区域仅有零星表达，见图2，表2。

    图1 下丘脑NOS神经元的显微照相

    Fig 1 Photomicrograph of NOS neurons in the hypothalamus

    A：NOS neurons in PMV were very sparse in control group (×130)

    B：One day after acute hypoxia and hypothermia, NOS neurons in PMV were densely labeled (×130)

    图2 下丘脑FIL神经元的显微照相

    Fig 2 Photomicrograph of FIL neurons in the hypothalamus

    A：FIL neurons of PMV were very sparse in control group(×260)

    B：One day after acute hypoxia and hypothermia, FIL neurons of PMV were densely labeled (×260)

    C：One day after acute hypoxia and hypothermia,FIL neurons of ARH were densely labeled (×260)

    D：One day after acute hypoxia and hypothermia,FIL neurons of VMH were densely labeled (×260)

    表1 急性低温低氧对下丘脑室旁核、视上核NOS表达的影响

    Tab 1 Effect of acute hypoxia and hypothermiaon NOS expression of PMV and SON

    Groups

    n

    Number of NOS neurons

    PMV

    SON

    Control

    5

    15.3±2.7

    22.5±2.1

    One day

    6

    135.5±5.2^{* *}

    75.0±5.4^{* *}

    Three days

    6

    133.2±6.0^{* *}

    76.8±5.5^{* *}

    * *：P<0.01 vs control

    表2 急性低温低氧对下丘脑c-fos表达的影响

    Tab 2 Effect of acute hypoxia and hypothermia on c-fosexpression in hypothalamus

    Groups

    n

    Number of FIL neurons

    PMV

    ARH

    VMH

    DMH

    Control

    5

    32.3±2.4

    27.2±2.7

    22.6±2.1

    17.6±1.6

    One day

    6

    254.7±6.8^{* *}

    122.8±5.1^{* *}

    82.6±2.7^{* *}

    70±1.3^{* *}

    Three days

    6

    250.6±5.1^{* *}

    118±6.5^{* *}

    88.4±4.6^{* *}

    70.2±1.6^{* *}

    * *：P<0.01 vs control

    2.3 FOS蛋白与NOS在下丘脑内的共存

    低温低氧1 d组和3 d组大鼠下丘脑室旁核的小细胞部及其附近的室周区，外侧区，背内侧区，乳头体前核的中小型NOS阳性细胞有10%～20%同时表达FOS蛋白，其他部位偶见双染细胞。

    3 讨论

    NO作为一种非典型的神经递质和信息分子，介导了许多与NMDA受体激活相关的生理、病理过程，如参与海马和皮层的长时程增强和抑制及脑缺血、脑损伤的毒性作用^[1]。据报道缺氧可引起谷氨酸的大量释放^[2]，谷氨酸兴奋NMDA受体激活NOS，使NO大量释放发挥作用。近年的研究表明，NO作为下丘脑的内源性物质对许多递质和激素的释放具有刺激或抑制性中介作用^[3]。在离体状态下已经证实与调节下丘脑神经元CRF和VP的释放^[4，5]。本研究应用高原低氧模型观察到NOS在下丘脑内的强烈表达说明NO参与了下丘脑的低氧反应，尽管其机制还不清楚，可能与其中介作用有关。

    FOS蛋白可作为神经元活动的标志物，用FOS功能图布法可清楚显示参与某一神经活动的神经元。本研究以免疫组化法观察到高原低氧大鼠下丘脑室旁核、弓状核、腹内侧核、背内侧核c-fos有强烈表达。以往文献报道，单纯系统中度缺氧可引起下丘脑室旁核、视上核、弓状核的c-fos表达^[6]。而在本研究模拟的高原低氧模型中c-fos表达范围较广，累及核团较多，但视上核表达较少。不同的缺氧方式可导致c-fos在下丘脑内表达不同，说明不同的缺氧方式可引起不同的生理功能的改变。本研究模拟的高原低温低氧模型可能比单纯系统缺氧对大鼠更为敏感，作用更为广泛。在两种不同的缺氧模型中，室旁核均为c-fos表达最强烈的核团，说明室旁核在缺氧反应中起非常重要的作用。缺氧条件下c-fos的强烈表达与谷氨酸大量释放作用于NMDA受体有关。Haxlin证实中度缺氧引起的c-fos表达可被NMDA受体阻滞剂明显抑制。FOS蛋白作为基因转录调节因子的作用尽管未完全阐明，近来的研究已经证实FOS蛋白对下丘脑室旁核的AVP基因和CRF基因的表达有重要的调节作用，并且NO发挥的中介作用与FOS表达密切相关。目前已经证实在大鼠的视网膜色素上皮细胞，纹状体神经元中，NO可通过对c-fos转录活性因子cAMP反应区结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)磷酸化引起该神经元内FOS的表达^[7，8]。在束缚应激模型中运用NOS的抑制剂可明显抑制c-fos的表达^[9]。研究也发现在下丘脑室旁核的小细胞部及附近的室周区、外侧区、背内侧区、乳头体前核约有10%～20%的中小型NOS阳性神经元同时表达c-fos。因此NO的中介作用可能是通过影响c-fos表达来影响CRF和AVP基因表达参与低温低氧反应。

    作者简介:庞学利,男,36岁,副主任医师,副教授,硕士

    参考文献

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    3 Moretto M, Lopez F J, Vilar A N. Nitric oxide regulates luteinizing hormone-releasing hormone secretion. Endocrinology,1993,133(5):2399

    4 Costa A, Trainer P, Besser M, et al. Nitric oxide modulates the release of corticotropin-releasing homone from the rat hypothalamus in vitro.Brain Res,1993,605(2):187

    5 Ota M, Crofton J, Festavan G T, et al. Evidence that nitric oxide can act centrally to stimulate vasopressin release. Neuroendocrinology,1993,57(5):955

    6 Hirooka Y, Polson J W, Potts P D, et al. Hypoxia-induced Fos expression in neurons projecting to the pressor region in the rostral ventrolateral medulla. Neuronscience,1997,80(4):1209

    7 Morris B J. Stimulation of immediate early gene expression in striatal neurons by nitric oxide. J Biol Chem,1995,270(42):24740

    8 Ohki K, Yoshida K, Hagiwara M, et al. Nitrix oxide induces c-fos gene expression via cyclic AMP response element binding protein (CREB) phosphorylation in rat retinal pigment epithelium. Brain Res,1995,696(1-2):140

    9 Amirs, Rackover M, Funx D. Blockers of nitric oxide synthase inhibit stress activation of c-fos expression in neurons of the hypothalamic paraventricular nucleus in the rat. Neuroscience,1997,77(3):623

    收稿：1998-09-05

    修回：1999-02-01

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