应用PTCA导管制作大鼠颈总动脉新生内膜增殖模型
作者：欧阳平 刘伊丽 许顶立 黄洪莲 侯玉清 王煊 戴云 李进
单位：欧阳平 刘伊丽 许顶立 黄洪莲 侯玉清 王煊 (第一军医大学南方医院心内科，广州，510515)；戴云 李进 (第一军医大学组织胚胎学教研室，广州，510515)
关键词：颈动脉；内皮剥脱；新生内膜
第一军医大学学报990407 摘要：应用PTCA导管建立了SD大鼠颈总动脉球囊损伤后新生内膜增殖模型，通过光镜、电镜及α-actin免疫组化证明用PTCA导管建立的大鼠颈总动脉新生内膜增殖模型与国外用2F Fogarty 导管制作的大鼠颈总动脉模型的一致性，满足了研究血管损伤反应和PTCA术后再狭窄的需要。
Development of rat carotid artery model for neointimal hyperplasia by PTCA balloon catheter
, 百拇医药
Ouyang Ping，Liu Yili，Xu Dingli，Huang Honglian，Hou Yuqing，Wang Xuan
(Department of Cardiology，Nanfang Hospital，First Military Medical University，Guangzhou，510515)
Dai Yun，Li Jin
(Department of Histoembryology，First Military Medical University，Guangzhou，510515) Abstract：The rat carotid artery models for neointimal hyperplasia were made by PTCA balloon catheter.Light microscope，electron microscope and α-actin immunohistochemistry methods were applied.The study showed that the models of rat carotid artery by PTCA balloon catheter were similar to the models by 2F Fogarty catheter.
, 百拇医药
Key words：carotid artery;endothelium denudation;neointimal hyperplasia
经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)是目前临床治疗冠状动脉狭窄的主要方法之一。但术后6个月内30%～50%的再狭窄发生率是影响其远期疗效的主要因素[1]。建立再狭窄动物模型的目的是模仿人类再狭窄的血管生物学，探讨其发生机制和预防措施。根据Schwartz提出的再狭窄动物模型实验选择的策略，大鼠颈动脉损伤模型是目前应用最多的再狭窄动物模型。国外常规使用2F Fogarty导管制作该模型，国内因没有此种导管，故此模型的应用受到限制。我们利用PTCA导管成功制作了大鼠颈总动脉损伤模型,为再狭窄的研究提供了基础。
1 材料和方法
1.1 材料来源 2.0F PTCA球囊导管：Cordis公司产品。SD大鼠由第一军医大学动物中心提供。α-actin单抗、LSAB Kit购自DAKO公司。
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1.2 雄性SD大鼠，体质量300～400 g，腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg，麻醉后取颈部正中切口，从颈外静脉注射肝素钠100 U/kg，在左侧气管旁寻找到左颈总动脉和颈外、颈内动脉分叉处，钝性分离。在左总颈动脉近心端用血管夹暂时阻断血流，从颈外动脉处行动脉切开术，将2.0 F PTCA球囊导管从切口插入至颈总动脉约1.5 cm，来回抽动3次以剥脱内膜，将导管撤出后，结扎颈外动脉，恢复血流，缝合伤口，术后禁食8 h。
1.3 术后3周，将SD大鼠腹腔注射过量的戊巴比妥钠，开胸后，从心脏左室插管，灌注生理盐水肝素液(10000 U/L) 15 min，用10%福尔马林液灌注固定20 min，取出损伤部位的左颈总动脉约1.0 cm，经固定脱水，石蜡包埋后行病理切片，用HE染色，在光镜下观察血管内膜增生情况，每份标本非连续取4处切片。
1.4 制备电镜标本 将正常大鼠及用球囊导管损伤后即刻的大鼠左颈总动脉分别取0.5 cm，PBS漂洗数次，标本放入2.5%戊二醛中固定，再于4℃在1%锇酸中固定90 min，酒精脱水干燥，喷镀碳和金后，用HITACHI S-450扫描电镜观察拍照。
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1.5 免疫组化检测 切片，0.3%过氧化氢甲醇真空负压处理5 min；加1%正常兔血清，真空负压处理5 min；加入小鼠抗人的α-actin单抗，真空负压处理5 min，PBS洗数次;加入生物素标记的兔抗小鼠的免疫球蛋白，真空负压处理5 min;加入过氧化物酶偶联的链霉亲合素后，真空负压处理5 min；DAB-H2O2显色5 min;明矾苏木素染核1 min；分化、返蓝、脱水、透明、中性树胶封固，Olympus显微镜观察、照相。
1.6 计算内膜/中层面积比及统计分析 利用Quan-timent 520型计算机图象分析仪分别测量血管内膜和中膜横断面的面积，以内弹力膜区别内膜和中膜。数据统计采用统计软件包INSTAT，运用非配对t检验。
2 结果
正常的大鼠颈动脉血管壁有完整的内皮细胞覆盖，扫描电镜观察可见内皮细胞呈扁平细长形，长轴与血管方向一致，核微微隆向管腔。而球囊损伤后，可见内皮细胞脱落，暴露内皮下的网状结构。球囊损伤后，血管内皮细胞和内皮下层剥脱，暴露内弹力膜。大鼠颈动脉损伤3周后，可见血管内膜明显增厚，迁移至内膜的血管平滑肌细胞(VSMC)过度增殖，使内膜/中层比达1:1以上(图1、2)。内膜的增厚造成血管箁腔狭窄。动脉中层无明显变化。大鼠颈动脉损伤21 d后，在光镜下，可见损伤组动脉血管新生内膜明显向管腔内增厚，造成管腔狭窄，测量正常动脉组(n＝6条动脉)、损伤组(n＝5条动脉)的新生内膜和中膜面积，计算新生内膜与中膜的面积比值，结果有非常显著性差异。
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图1 正常大鼠颈动脉的中层平滑肌细胞
Fig.1 α-actin was detected in medial vascular smooth muscle cells of normal rat carotid artery wall.×200
图2 大鼠颈动脉损伤后21 d
Fig.2 Rat carotid arterial segment obstained at 21 d after balloon injury
Neointimal formation was observed in rat carotid artery.α-actin was detected in intimal and medial cells of rat carotid artery wall.×200
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3 讨论
VSMC在正常情况下以收缩表型存在，呈静止状态，VSMC在收缩表型时主要表达平滑肌α-actin，占细胞总actin的70%以上。其与心肌和骨骼肌细胞不同的是，成熟的VSMC具有高度可塑性，在促有丝分裂原刺激下，能重新进入细胞分裂周期进行增殖，并转化成合成表型,丢失了有规律排列的肌原纤维，合成及分泌生长因子和细胞外基质，并且平滑肌α-actin的表达明显减少，类似于胚胎期的平滑肌细胞[2-4]。我们用小鼠抗人的α-actin单抗分别检测正常大鼠颈动脉和损伤后3周的大鼠颈动脉血管壁中VSMC的α-actin表达情况。结果表明，在正常颈动脉的中层，VSMC明显表达α-actin，但在损伤后3周，中层的VSMC虽然仍表达α-actin，但迁移至内膜并增殖的VSMC由于表型的变化，已成为合成表型，故表达α-actin明显减少，同时丢失了有规律排列的肌原纤维(图1、2)。该结果与血管平滑肌细胞在血管受到损伤后从静止的收缩表型转换成增殖的合成表型的结论相一致，说明本实验建立的大鼠颈动脉损伤的再狭窄动物模型是成功的。
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目前国内尚未见有利用 PTCA球囊导管成功制作大鼠颈动脉损伤模型来进行再狭窄研究的研究报道。本研究在国内率先报道用PTCA球囊导管成功制作了大鼠颈动脉损伤模型，该模型是目前国际上应用最广泛的再狭窄模型，也是筛选抗血管平滑肌细胞增殖制剂包括基因治疗方法的首选模型。
作者简介：欧阳平，男，1965年出生,1987年毕业于第一军医大学,博士,主治医生
参考文献
1 Levine GD,Chodos AP，Loscalzo J.Restenosis following coronary angioplasty: Clinical presentations and therapeutic options.Clin Cardiol,1995，18:693
2 Katoh Y，Periasamy M.Growth and differentiation of smooth muscle cells during vascular development.Trends Cardiovac Med，1996，6:100
3 Owen Gk.Regulation of differentiation of vascular smooth muscle cells.Physiol Rev.1995，3:487
4 Patrick CW，Mcintire LV.Bioengineering contributions in vascular biology at the cellular and molecular level.Trends Cardiovasc Med,1996，6:122
(收稿日期：1998-04-08), http://www.100md.com
单位：欧阳平 刘伊丽 许顶立 黄洪莲 侯玉清 王煊 (第一军医大学南方医院心内科，广州，510515)；戴云 李进 (第一军医大学组织胚胎学教研室，广州，510515)
关键词：颈动脉；内皮剥脱；新生内膜
第一军医大学学报990407 摘要：应用PTCA导管建立了SD大鼠颈总动脉球囊损伤后新生内膜增殖模型，通过光镜、电镜及α-actin免疫组化证明用PTCA导管建立的大鼠颈总动脉新生内膜增殖模型与国外用2F Fogarty 导管制作的大鼠颈总动脉模型的一致性，满足了研究血管损伤反应和PTCA术后再狭窄的需要。
Development of rat carotid artery model for neointimal hyperplasia by PTCA balloon catheter
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Ouyang Ping，Liu Yili，Xu Dingli，Huang Honglian，Hou Yuqing，Wang Xuan
(Department of Cardiology，Nanfang Hospital，First Military Medical University，Guangzhou，510515)
Dai Yun，Li Jin
(Department of Histoembryology，First Military Medical University，Guangzhou，510515) Abstract：The rat carotid artery models for neointimal hyperplasia were made by PTCA balloon catheter.Light microscope，electron microscope and α-actin immunohistochemistry methods were applied.The study showed that the models of rat carotid artery by PTCA balloon catheter were similar to the models by 2F Fogarty catheter.
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Key words：carotid artery;endothelium denudation;neointimal hyperplasia
经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)是目前临床治疗冠状动脉狭窄的主要方法之一。但术后6个月内30%～50%的再狭窄发生率是影响其远期疗效的主要因素[1]。建立再狭窄动物模型的目的是模仿人类再狭窄的血管生物学，探讨其发生机制和预防措施。根据Schwartz提出的再狭窄动物模型实验选择的策略，大鼠颈动脉损伤模型是目前应用最多的再狭窄动物模型。国外常规使用2F Fogarty导管制作该模型，国内因没有此种导管，故此模型的应用受到限制。我们利用PTCA导管成功制作了大鼠颈总动脉损伤模型,为再狭窄的研究提供了基础。
1 材料和方法
1.1 材料来源 2.0F PTCA球囊导管：Cordis公司产品。SD大鼠由第一军医大学动物中心提供。α-actin单抗、LSAB Kit购自DAKO公司。
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1.2 雄性SD大鼠，体质量300～400 g，腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg，麻醉后取颈部正中切口，从颈外静脉注射肝素钠100 U/kg，在左侧气管旁寻找到左颈总动脉和颈外、颈内动脉分叉处，钝性分离。在左总颈动脉近心端用血管夹暂时阻断血流，从颈外动脉处行动脉切开术，将2.0 F PTCA球囊导管从切口插入至颈总动脉约1.5 cm，来回抽动3次以剥脱内膜，将导管撤出后，结扎颈外动脉，恢复血流，缝合伤口，术后禁食8 h。
1.3 术后3周，将SD大鼠腹腔注射过量的戊巴比妥钠，开胸后，从心脏左室插管，灌注生理盐水肝素液(10000 U/L) 15 min，用10%福尔马林液灌注固定20 min，取出损伤部位的左颈总动脉约1.0 cm，经固定脱水，石蜡包埋后行病理切片，用HE染色，在光镜下观察血管内膜增生情况，每份标本非连续取4处切片。
1.4 制备电镜标本 将正常大鼠及用球囊导管损伤后即刻的大鼠左颈总动脉分别取0.5 cm，PBS漂洗数次，标本放入2.5%戊二醛中固定，再于4℃在1%锇酸中固定90 min，酒精脱水干燥，喷镀碳和金后，用HITACHI S-450扫描电镜观察拍照。
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1.5 免疫组化检测 切片，0.3%过氧化氢甲醇真空负压处理5 min；加1%正常兔血清，真空负压处理5 min；加入小鼠抗人的α-actin单抗，真空负压处理5 min，PBS洗数次;加入生物素标记的兔抗小鼠的免疫球蛋白，真空负压处理5 min;加入过氧化物酶偶联的链霉亲合素后，真空负压处理5 min；DAB-H2O2显色5 min;明矾苏木素染核1 min；分化、返蓝、脱水、透明、中性树胶封固，Olympus显微镜观察、照相。
1.6 计算内膜/中层面积比及统计分析 利用Quan-timent 520型计算机图象分析仪分别测量血管内膜和中膜横断面的面积，以内弹力膜区别内膜和中膜。数据统计采用统计软件包INSTAT，运用非配对t检验。
2 结果
正常的大鼠颈动脉血管壁有完整的内皮细胞覆盖，扫描电镜观察可见内皮细胞呈扁平细长形，长轴与血管方向一致，核微微隆向管腔。而球囊损伤后，可见内皮细胞脱落，暴露内皮下的网状结构。球囊损伤后，血管内皮细胞和内皮下层剥脱，暴露内弹力膜。大鼠颈动脉损伤3周后，可见血管内膜明显增厚，迁移至内膜的血管平滑肌细胞(VSMC)过度增殖，使内膜/中层比达1:1以上(图1、2)。内膜的增厚造成血管箁腔狭窄。动脉中层无明显变化。大鼠颈动脉损伤21 d后，在光镜下，可见损伤组动脉血管新生内膜明显向管腔内增厚，造成管腔狭窄，测量正常动脉组(n＝6条动脉)、损伤组(n＝5条动脉)的新生内膜和中膜面积，计算新生内膜与中膜的面积比值，结果有非常显著性差异。
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图1 正常大鼠颈动脉的中层平滑肌细胞
Fig.1 α-actin was detected in medial vascular smooth muscle cells of normal rat carotid artery wall.×200
图2 大鼠颈动脉损伤后21 d
Fig.2 Rat carotid arterial segment obstained at 21 d after balloon injury
Neointimal formation was observed in rat carotid artery.α-actin was detected in intimal and medial cells of rat carotid artery wall.×200
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3 讨论
VSMC在正常情况下以收缩表型存在，呈静止状态，VSMC在收缩表型时主要表达平滑肌α-actin，占细胞总actin的70%以上。其与心肌和骨骼肌细胞不同的是，成熟的VSMC具有高度可塑性，在促有丝分裂原刺激下，能重新进入细胞分裂周期进行增殖，并转化成合成表型,丢失了有规律排列的肌原纤维，合成及分泌生长因子和细胞外基质，并且平滑肌α-actin的表达明显减少，类似于胚胎期的平滑肌细胞[2-4]。我们用小鼠抗人的α-actin单抗分别检测正常大鼠颈动脉和损伤后3周的大鼠颈动脉血管壁中VSMC的α-actin表达情况。结果表明，在正常颈动脉的中层，VSMC明显表达α-actin，但在损伤后3周，中层的VSMC虽然仍表达α-actin，但迁移至内膜并增殖的VSMC由于表型的变化，已成为合成表型，故表达α-actin明显减少，同时丢失了有规律排列的肌原纤维(图1、2)。该结果与血管平滑肌细胞在血管受到损伤后从静止的收缩表型转换成增殖的合成表型的结论相一致，说明本实验建立的大鼠颈动脉损伤的再狭窄动物模型是成功的。
, http://www.100md.com
目前国内尚未见有利用 PTCA球囊导管成功制作大鼠颈动脉损伤模型来进行再狭窄研究的研究报道。本研究在国内率先报道用PTCA球囊导管成功制作了大鼠颈动脉损伤模型，该模型是目前国际上应用最广泛的再狭窄模型，也是筛选抗血管平滑肌细胞增殖制剂包括基因治疗方法的首选模型。
作者简介：欧阳平，男，1965年出生,1987年毕业于第一军医大学,博士,主治医生
参考文献
1 Levine GD,Chodos AP，Loscalzo J.Restenosis following coronary angioplasty: Clinical presentations and therapeutic options.Clin Cardiol,1995，18:693
2 Katoh Y，Periasamy M.Growth and differentiation of smooth muscle cells during vascular development.Trends Cardiovac Med，1996，6:100
3 Owen Gk.Regulation of differentiation of vascular smooth muscle cells.Physiol Rev.1995，3:487
4 Patrick CW，Mcintire LV.Bioengineering contributions in vascular biology at the cellular and molecular level.Trends Cardiovasc Med,1996，6:122
(收稿日期：1998-04-08), http://www.100md.com