EBV感染对人鼻咽癌细胞株形态参数和DNA含量的影响
作者：李岩松 陈小毅 沈淑静 孙宁
单位：(李岩松)广东医学院附属医院病理科，湛江 524001；(陈小毅 沈淑静 孙宁)广东医学院病理学教研室，湛江 524023
关键词：鼻咽癌：Epstein-Barr病毒；图像分析
广东医学院学报990401 摘要 目的：观察EBV体外感染对不同分化状态鼻咽癌细胞株形态参数和DNA含量的影响。方法：应用PCR法检测EBV基因、免疫组化和图像分析仪分别检测了EBV和EBV+TPA对CNE-1和CNE-2Z细胞Ckpan表达及形态参数和DNA含量的影响。结果：(1)EBV在体外可感染CNE-1细胞；(2)EBV感染CNE-1细胞使其Ckpan表达降低，胞面积变小和核浆比升高及DNA含量明显减少(P<0.01or<0.05)，DNA倍体分布集中左移至10C附近，但对核面积没有影响。(3)EBV和EBV+TPA则使CNE-2Z的Ckpan表达升高，细胞面积和DNA含量增加及核浆比降低(P<0.01or<0.05)，且DNA倍体分布分散右移至9C处，但EBV对核面积影响不大。(4)TPA的作用较复杂。结论：EBV感染CNE-1细胞后，其形态趋向于向低分化的小细胞群体演变，而EBV则使CNE-2Z细胞形态趋向于高分化的大细胞群体演变。
, 百拇医药
The effect of EBV infection on the changes of cellular morphometric
and DNA content of NPC cell lines in vitro
Li Yansong
Department of Pathology，Affiliated Hospital of Guangdong
Medical College，Zhanjiang 524001；
Chen Xiaoyi Shen Shujing et al
Department of Pathology，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023
, 百拇医药
Abstract Objective：To observe the changes of cellular morphometric and DNA content of NPC cell lines by EBV combined TPA in vitro.Methods：PCR，immunohistochemical staining and cellular image analysis were performed on the cells and the smeats in all groups.Results：(1)In vitro EBV can infect CNE-1 cells.(2)EBV infection reduced distinctly Ckpan expresion，cellular area and DNA content，enhanced N/C ratio， but did not influence morphometric of nuclear on CNE-1.(3)EBV(EBV or EBV plus TPA) incrseased Ckpan expression，cellular ares and DNA content， but decreased N/C on CNE-2Z.(4)The effects of TPA on those cell lines were quite complex.It needs further investigation.Conclusions：EBV can promote CNE-1 proliferation and CNE-2Z differentiation in vitro.
, 百拇医药
Key Words：nasopharyngeal carcinoma；Epstein-Barr Virus；image analysis
EBV与鼻咽癌的关系十分密切，但EBV在鼻咽癌的发生、发展及演变过程中的作用与机制，目前仍不清楚。EBV对CNE-1和CNE-2Z细胞形态参数有何影响尚未见报道。我们采用细胞图像分析仪检测EBV和EBV加TPA处理后CNE-1和CNE-2Z细胞形态参数和DNA含量变化并观察不同分化程度的鼻咽癌细胞株的演进规律，从不同的角度探讨EBV在鼻咽癌的发生发展及演变过程中的作用与机制。
1 材料和方法
1.1材料 B95-8，CNE-1和CNE-2Z细胞株由我院病理教研室提供。IBMS图像分析系统(USA，MicroStarAO)。
1.2 试剂 RPMI1640(USA，Gibco)，小牛血清(杭州四季青生物材料工程公司)谷氨酰胺及TPA(USA Sigma)。兔抗人多克隆角蛋白抗体和S-P试剂盒(Maxim公司)，EBV-W片段特异性引物(北京医科大学病理教研室合成)。
, 百拇医药
1.3 EBV的制备 按Nemerow[1]等的方法。
1.4 EBV感染CNE-1和CNE-2Z细胞实验 参照Hedrick[2]等相关方法，实验分三组即EBV处理组(E组)：2×108/L细胞分别于培养的第2和第4d加入EBV上清2mL，37℃孵育1h后弃液，再加新鲜培养液常规培养5d，传代2次；EBV+TPA组(ET组)：于第二次EBV感染的当天加入TPA(终浓度1μmol/L)，培养1d，弃液换新鲜培养液继续培养5d传代2次；对照组(C组)：不加任何处理，最后搜集细胞涂片。
1.5 EBV基因检测 搜集各组细胞(约106细胞)，用9.0g/L Nacl溶液洗涤细胞1次，加1mL Lysis buffer液和30μl蛋白酶K，混匀，37℃水浴24h后加入饱和酚1mL，5000r/min离心5min×2，上清加1mL氯仿，混匀，5000r/min离心5min，取5μl上清作PCR。以EBV-W片段特异引物检测。用B 95-8 DNA作阳性对照，K562细胞作阴性对照，双蒸水(ddH2O)作空白对照。
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1.6 免疫组化染色 Ckpan染色严格按SP法操作步骤进行，用已知食道癌阳性切片为阳性对照，以PBS取代第一抗体作阴性对照，CKpan以胞浆及胞膜出现棕黄色颗粒为阳性标志。
1.7 细胞形态参数含量测定 涂片HE染色后，应用IBMS图像分析系统进行测定，在显微镜25×0.8(放大250倍，视野范围0.8)下，从涂片中随机选取150个细胞，通过高分辨电视摄像系统扫描，在图像监视器上显示图像，测定每个细胞的胞面积，核面积和核浆比。
1.8 细胞DNA含量测定 涂片经Feulgen染色后图像分析仪检测。通过光学显微镜摄像系统放大400倍摄取图像，对图像进行编辑，灰度主换，二值变换及分割，根据图像条件进行全自动、半自动或手动模拟测量，每组测100～110个细胞，同时测正常人淋巴细胞30个，取其DNA含量(积分光密度)平均值作为正常二倍体(2C)细胞的DNA标准值，换算肿瘤细胞的DNA含量倍体数(U值)。计算机作数值处理，绘出直方图。
, 百拇医药
计算每组细胞DNA相对倍体均值(U值)：
1.9 统计学处理 采用医学统计学程序作χ2检验，t 检验和t'检验。
2 结果
2.1EBV基因检测 用PCR法以EBV-W片段特异性引物检测上述各组细胞，其中对照组的脐带血淋巴细胞(LC组)和CNE-1(1C组)的基因阴性，而EBV感染的淋巴细胞(LCL组)、CNE-1(1E、1ET组)和CNE-2Z(2E、2ET，2C组)的EBV基因为阳性(图1)。
图1 PCP结果，示1E，1ET，2E，2ET，2C，LCL和B95-8组
, 百拇医药
EBV基因阳性，1C和LC组EBV基因阴性
2.2 各实验组细胞CKpan产物表达 (见表1) 1C组CKpan表达高于2C组(P<0.01)，EBV感染后1E和1ET组CKpan表达低于1C组(P<0.01)，尤以1ET组降低更明显(P<0.01)，而2E和2ET组CKpan表达高于2C组(P<0.01)，2ET与2E组间无差异显著性(P>0.05)。
表1 EB病毒感染CNE-1和CNE-2Z
细胞后角蛋白表达的检测 组别
角蛋白阳性细胞(%)
E
ET
C
, 百拇医药
1 C
46.5**
19.0**▲▲
62.5
2 C
67.5**
74.5**
17.0＃＃
**P<0.01；与1C比较，＃＃P<0.01；与E比较，▲▲P<0.01
2.3 EBV、EBV+TPA对CNE-1和CNE-2 Z细胞形态参数的影响(见表2)表2 EB病毒感染CN
-1和CNE-2Z细胞后细胞形态
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参数的影响(
±s，A/μm2) 细胞株
胞面积(A/μm2)
核面积(A/μm2)
核桨比
1C
480.91±217.24
217.58±148.77
0.40±0.10
1E
298.32±93.92**
, 百拇医药
172.32±44.79
0.59±0.04**
1ET
395.80±124.48
221.22±79.11
0.57±0.04*
2C
195.15±47.20**
142.29±48.23**
0.71±0.08＃＃
2E
, 百拇医药 230.05±51.42**
144.13±40.88
0.60±0.04*
2ET
249.13±31.28**
105.44±.33.79**
0.41±0.09**▲
与对照组比较，** P<0.01，*P<0.05；与1C比较，＃＃P<0.01；与E相比较，▲P<0.01
胞面积：1E组细胞面积下降(1E与1C组相比P<0.01)，而1ET组胞面积大于1E组(两者比较，P<0.01)。表明TPA拮抗EBV降低胞面积作用；EBV和EBV+TPA对CNE-2Z细胞的胞面积的影响则表现为升高趋势(与2C相比较，P<0.01)。
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核面积：1C组核面积明显大于2C组(P<0.01)，除1ET组大于1E组(P<0.01)，2ET组小于2C组(P<0.01)，2ET组大于2E组(P<0.01)外，EBV、EBV+TPA对CNE-1和CNE-2Z细胞核面积影响不明显。
核浆比：1C组小于2C(P<0.01)，经EBV和EBV+TPA处理后CNE-1细胞的核浆比出现升高趋势(与1C相比，P<0.05)，而CNE-2Z相比则表现为降低的趋势(与2C比较，P<0.05)，且TPA与EBV在CNE-2Z细胞表现出协同降低核桨比的作用(P<0.01)，但TPA对CNE-1细胞的核浆比没有影响。
2.4 细胞DNA含量及倍体分布特点(见表3和直方图2) 1C组DNA含量均值高于2C组(P<0.01)，1C组DNA含量直方图DNA倍体分布宽而分散，宽达15C，而2C组DNA倍体分布集中左移至7C附近；1E、1ET组DNA含量均值下降与1C组相比差异有非常显著(P<0.01)；1E、1ET组直方图DNA倍体分布与1C组相比明显集中，分别左移到10C和1C处，而2E、2ET组DNA含量升高与2C组相比仅2ET组差异有非常显著性(P<0.01)；2E组及2ET组含量直方图倍体分布较2C组增宽而分散右移至9C附近；1ET组与1E、2ET与2E组的DNA含量相比均差异有非常显著性(P<0.01)；1ET组与1E、2ET组与2E组相比DNA倍体分布无明显变化。
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表3 各组细胞DNA含量的检测 细胞系
DNA值
数目
范围(U)
(+s)
1C
110
2.88-14.79
6.65±2.36
1E
107
, 百拇医药
2.62-10.00
4.56±1.54**
1ET
112
2.45-10.95
5.55±1.37**▲▲
2C
113
2.52-6.86
3.80±0.80＃＃
2E
102
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1.74-8.63
4.04±1.05
2ET
107
2.58-8.71
4.70±1.15**▲▲
与对照组比较，**P<0.01，*P<0.05；与E相比▲▲P<0.01；与1 C相比，＃＃P<0.01。
图2 各组细胞DNA含量和DNA倍体分布
3 讨论
3.1 EBV体外感染细胞株的情况
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有报道，脐带血淋巴细胞和建株时的CNE-1细胞未被EBV感染，而CNE-2Z 细胞已被感染，这与我们实验结果一致。这表明低分化NPC的发生与EBV感染有关。我们的实验结果也发现，EBV体外能感染CNE-1和LC。
3.2 EBV对CNE-1及CNE-2Z和LC细胞分化的影响
EBV对细胞分化的影响以往研究较多的靶细胞是淋巴细胞，其对上皮细胞的影响研究不多，尤其是探讨EBV对不同生长分化状态细胞的作用的研究尚未见报道。我们所选靶细胞为两种不同分化状态的NPC细胞株(CNE-1和CNE-2Z)，用免疫组化技术，观察EBV对细胞分化的影响。结果显示，EBV感染LC和CNE-1后能抑制CNE-1分化；相反，EBV能促进CNE-2Z分化，其原因尚不清楚，可能与EBV感染不同分化状态细胞或者EBV初次感染与再次感染对细胞生长分化有不同影响有关。长期以来，人们对EBV的研究都是基于其促增殖和抑分化而设计的，所得的大量结果也证明其与细胞增殖和去分化有关[3，4]。近来研究发现，EBV和TPA体外转染两株表达EBV受体的永生化鳞状上皮细胞系(SVK-CR2、SCC12F-CR2)后，出现细胞内EBV复制增加，同时细胞出现分化(细胞形态改变及鳞状上皮标记表达)[5]，这与我们的CNE-2Z实验组结果相似。这为探讨EBV影响不同分化状态NPC细胞的演进规律，提供了强有力的实验证据。
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3.3 EBV转染CNE-1和CNE-2Z细胞后，细胞形态和DNA含量变化规律及其生长分化的关系
恶性肿瘤细胞的核染色体变化在于数量增减和结构畸变，其异常必将影响到细胞形态及DNA含量的变化，因此测定病变细胞形态参数和DNA含量及倍体分布，可作为直接反映肿瘤生长分化的重要生物学指标[6]，还有助于了解肿瘤生长过程中干系的选择情况[7，8]。我们利用该技术检测了EBV体外转染的CNE-1和CNE-2Z的形态参数和DNA含量。研究结果显示：(1)CNE-1为大细胞、低核浆比、高DNA含量且倍体分布宽而散的细胞群体；相反，CNE-2Z为小细胞、高核浆比、低DNA含量且倍体分布集中的细胞群体。CNE-1和CNE-2Z分别为高、低分化NPC细胞，但DNA含量和倍体分布的结果似乎与目前公认的恶性肿瘤细胞恶性程度越高，其DNA含量越高和倍体分布也越宽、越分散的变化规律不一致。由于CNE-1和CNE-2Z细胞形态差异大，而且DNA含量由核面积乘光密度的对数得出的，核的大小、染色质的类型(常染色质和异染色质)可直接影响DNA细胞的含量。因此在比较两种形态差异较大的肿瘤细胞分化程度时，仅凭细胞DNA含量难以下结论，应该结合生长分化指标和形态参数(尤其是核浆比)来综合判断；(2)EBV感染CNE-1后，使其形态参数、DNA含量和倍体分布朝类似于低分化CNE-2 Z细胞的方向转变，相反，EBV作用于CNE-2Z后，则使其向高分化CNE-1细胞转变。结果提示EBV感染CNE-1和作用于CNE-2 Z后，可使细胞亚群发生变化，出现一个或几个优势的细胞亚群，从而影响整个细胞群体的生长分化。同时发现EBV感染细胞后核浆比的变化主要由胞浆面积的增减所致，而与核面积改变没有关系。核浆比一直是判断细胞分化程度的一个重要指标，它随肿瘤恶性程度增加而递增，我们的结果与之相符，即高分化CNE-1和EBV使CNE-2 Z细胞分化时核浆比低，相反，低分化CNE-2 Z和EBV促CNE-1细胞增殖时，其核浆比高，表明在判断形态上差异较大的瘤细胞的增殖分化程度时，核浆比是一个良好的指标，优于其他形态参数和DNA含量。
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3.4 TPA对CNE-1和CNE-2 Z细胞分化、形态参数及DNA含量的影响
TPA为常用的促癌剂，但常因浓度不同及作用的细胞不同，其效果也各异[9]。本实验发现，TPA对不同分化状态细胞的影响不同，TPA与EBV协同抑制CNE-1细胞CKpan表达，而对CNE-2 Z的CKpan表达却没有影响，与EBV合用拮抗EBV对CNE-1细胞形态参数和NDA含量的影响，而在CNE-2 Z细胞则拮抗EBV对细胞核面积作用，同时协同对核浆比和DNA含量的影响，其原因可能也与其浓度不同及作用的细胞类型、细胞分化状态不同，因而对细胞的效应不同有关。
4 参考文献
1 Nemerow GR，Cooper NR.Isolation of Epstein-Barr virus and studies of its neutralization by human IgG and complement.J Immunol，1981，127：272
, http://www.100md.com
2 Hedrick JA，Watry D，Speiser，et al.Interation between Epstein-Barr virus and a T cell line(HSB-2) via a receptor phenotypcally distinct from complement receptor type2.Eur J Immunol，1992，22：1123
3 Fahraus R.Morphological transformation of human keratinicytes expressing the LMP gene of Epstein-Barr virus.Nature，1990，345：447
4 Dawson CW.LMP inhibits human epithelia cell differentiation.Nature，1990，344：777
, 百拇医药
5 Li QX，Young LS，Niedobitck G，et al.Epstein-Barr virus infection and replication in a human epithelial cell system.Nature，1992，356：347
6 左连富，郭建文，许树堂，等.3050例恶性肿瘤DNA倍体分析.中华病理学杂志，1992，21(3)：167
7 Nowell PC.Mechanisms of tumro progression.Cancer Res，1986，44：2203
8 罗经文，孙宁，沈淑静.人鼻咽癌克隆株体外传代过程中的群体变化.细胞生物学杂志，1996，18(2)：79
9 Blumberg PM，Jaken S，Konig B，et al.Mechanisms of the phorbol ester tumor promoters specific receptors for lipophilic ligands.Bio Pharmacology，1984，33(3)：933
收稿日期：1998-12-23, http://www.100md.com
单位：(李岩松)广东医学院附属医院病理科，湛江 524001；(陈小毅 沈淑静 孙宁)广东医学院病理学教研室，湛江 524023
关键词：鼻咽癌：Epstein-Barr病毒；图像分析
广东医学院学报990401 摘要 目的：观察EBV体外感染对不同分化状态鼻咽癌细胞株形态参数和DNA含量的影响。方法：应用PCR法检测EBV基因、免疫组化和图像分析仪分别检测了EBV和EBV+TPA对CNE-1和CNE-2Z细胞Ckpan表达及形态参数和DNA含量的影响。结果：(1)EBV在体外可感染CNE-1细胞；(2)EBV感染CNE-1细胞使其Ckpan表达降低，胞面积变小和核浆比升高及DNA含量明显减少(P<0.01or<0.05)，DNA倍体分布集中左移至10C附近，但对核面积没有影响。(3)EBV和EBV+TPA则使CNE-2Z的Ckpan表达升高，细胞面积和DNA含量增加及核浆比降低(P<0.01or<0.05)，且DNA倍体分布分散右移至9C处，但EBV对核面积影响不大。(4)TPA的作用较复杂。结论：EBV感染CNE-1细胞后，其形态趋向于向低分化的小细胞群体演变，而EBV则使CNE-2Z细胞形态趋向于高分化的大细胞群体演变。
, 百拇医药
The effect of EBV infection on the changes of cellular morphometric
and DNA content of NPC cell lines in vitro
Li Yansong
Department of Pathology，Affiliated Hospital of Guangdong
Medical College，Zhanjiang 524001；
Chen Xiaoyi Shen Shujing et al
Department of Pathology，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023
, 百拇医药
Abstract Objective：To observe the changes of cellular morphometric and DNA content of NPC cell lines by EBV combined TPA in vitro.Methods：PCR，immunohistochemical staining and cellular image analysis were performed on the cells and the smeats in all groups.Results：(1)In vitro EBV can infect CNE-1 cells.(2)EBV infection reduced distinctly Ckpan expresion，cellular area and DNA content，enhanced N/C ratio， but did not influence morphometric of nuclear on CNE-1.(3)EBV(EBV or EBV plus TPA) incrseased Ckpan expression，cellular ares and DNA content， but decreased N/C on CNE-2Z.(4)The effects of TPA on those cell lines were quite complex.It needs further investigation.Conclusions：EBV can promote CNE-1 proliferation and CNE-2Z differentiation in vitro.
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Key Words：nasopharyngeal carcinoma；Epstein-Barr Virus；image analysis
EBV与鼻咽癌的关系十分密切，但EBV在鼻咽癌的发生、发展及演变过程中的作用与机制，目前仍不清楚。EBV对CNE-1和CNE-2Z细胞形态参数有何影响尚未见报道。我们采用细胞图像分析仪检测EBV和EBV加TPA处理后CNE-1和CNE-2Z细胞形态参数和DNA含量变化并观察不同分化程度的鼻咽癌细胞株的演进规律，从不同的角度探讨EBV在鼻咽癌的发生发展及演变过程中的作用与机制。
1 材料和方法
1.1材料 B95-8，CNE-1和CNE-2Z细胞株由我院病理教研室提供。IBMS图像分析系统(USA，MicroStarAO)。
1.2 试剂 RPMI1640(USA，Gibco)，小牛血清(杭州四季青生物材料工程公司)谷氨酰胺及TPA(USA Sigma)。兔抗人多克隆角蛋白抗体和S-P试剂盒(Maxim公司)，EBV-W片段特异性引物(北京医科大学病理教研室合成)。
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1.3 EBV的制备 按Nemerow[1]等的方法。
1.4 EBV感染CNE-1和CNE-2Z细胞实验 参照Hedrick[2]等相关方法，实验分三组即EBV处理组(E组)：2×108/L细胞分别于培养的第2和第4d加入EBV上清2mL，37℃孵育1h后弃液，再加新鲜培养液常规培养5d，传代2次；EBV+TPA组(ET组)：于第二次EBV感染的当天加入TPA(终浓度1μmol/L)，培养1d，弃液换新鲜培养液继续培养5d传代2次；对照组(C组)：不加任何处理，最后搜集细胞涂片。
1.5 EBV基因检测 搜集各组细胞(约106细胞)，用9.0g/L Nacl溶液洗涤细胞1次，加1mL Lysis buffer液和30μl蛋白酶K，混匀，37℃水浴24h后加入饱和酚1mL，5000r/min离心5min×2，上清加1mL氯仿，混匀，5000r/min离心5min，取5μl上清作PCR。以EBV-W片段特异引物检测。用B 95-8 DNA作阳性对照，K562细胞作阴性对照，双蒸水(ddH2O)作空白对照。
, http://www.100md.com
1.6 免疫组化染色 Ckpan染色严格按SP法操作步骤进行，用已知食道癌阳性切片为阳性对照，以PBS取代第一抗体作阴性对照，CKpan以胞浆及胞膜出现棕黄色颗粒为阳性标志。
1.7 细胞形态参数含量测定 涂片HE染色后，应用IBMS图像分析系统进行测定，在显微镜25×0.8(放大250倍，视野范围0.8)下，从涂片中随机选取150个细胞，通过高分辨电视摄像系统扫描，在图像监视器上显示图像，测定每个细胞的胞面积，核面积和核浆比。
1.8 细胞DNA含量测定 涂片经Feulgen染色后图像分析仪检测。通过光学显微镜摄像系统放大400倍摄取图像，对图像进行编辑，灰度主换，二值变换及分割，根据图像条件进行全自动、半自动或手动模拟测量，每组测100～110个细胞，同时测正常人淋巴细胞30个，取其DNA含量(积分光密度)平均值作为正常二倍体(2C)细胞的DNA标准值，换算肿瘤细胞的DNA含量倍体数(U值)。计算机作数值处理，绘出直方图。
, 百拇医药
计算每组细胞DNA相对倍体均值(U值)：
1.9 统计学处理 采用医学统计学程序作χ2检验，t 检验和t'检验。
2 结果
2.1EBV基因检测 用PCR法以EBV-W片段特异性引物检测上述各组细胞，其中对照组的脐带血淋巴细胞(LC组)和CNE-1(1C组)的基因阴性，而EBV感染的淋巴细胞(LCL组)、CNE-1(1E、1ET组)和CNE-2Z(2E、2ET，2C组)的EBV基因为阳性(图1)。
图1 PCP结果，示1E，1ET，2E，2ET，2C，LCL和B95-8组
, 百拇医药
EBV基因阳性，1C和LC组EBV基因阴性
2.2 各实验组细胞CKpan产物表达 (见表1) 1C组CKpan表达高于2C组(P<0.01)，EBV感染后1E和1ET组CKpan表达低于1C组(P<0.01)，尤以1ET组降低更明显(P<0.01)，而2E和2ET组CKpan表达高于2C组(P<0.01)，2ET与2E组间无差异显著性(P>0.05)。
表1 EB病毒感染CNE-1和CNE-2Z
细胞后角蛋白表达的检测 组别
角蛋白阳性细胞(%)
E
ET
C
, 百拇医药
1 C
46.5**
19.0**▲▲
62.5
2 C
67.5**
74.5**
17.0＃＃
**P<0.01；与1C比较，＃＃P<0.01；与E比较，▲▲P<0.01
2.3 EBV、EBV+TPA对CNE-1和CNE-2 Z细胞形态参数的影响(见表2)表2 EB病毒感染CN
-1和CNE-2Z细胞后细胞形态, http://www.100md.com
参数的影响(
±s，A/μm2) 细胞株胞面积(A/μm2)
核面积(A/μm2)
核桨比
1C
480.91±217.24
217.58±148.77
0.40±0.10
1E
298.32±93.92**
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172.32±44.79
0.59±0.04**
1ET
395.80±124.48
221.22±79.11
0.57±0.04*
2C
195.15±47.20**
142.29±48.23**
0.71±0.08＃＃
2E
, 百拇医药 230.05±51.42**
144.13±40.88
0.60±0.04*
2ET
249.13±31.28**
105.44±.33.79**
0.41±0.09**▲
与对照组比较，** P<0.01，*P<0.05；与1C比较，＃＃P<0.01；与E相比较，▲P<0.01
胞面积：1E组细胞面积下降(1E与1C组相比P<0.01)，而1ET组胞面积大于1E组(两者比较，P<0.01)。表明TPA拮抗EBV降低胞面积作用；EBV和EBV+TPA对CNE-2Z细胞的胞面积的影响则表现为升高趋势(与2C相比较，P<0.01)。
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核面积：1C组核面积明显大于2C组(P<0.01)，除1ET组大于1E组(P<0.01)，2ET组小于2C组(P<0.01)，2ET组大于2E组(P<0.01)外，EBV、EBV+TPA对CNE-1和CNE-2Z细胞核面积影响不明显。
核浆比：1C组小于2C(P<0.01)，经EBV和EBV+TPA处理后CNE-1细胞的核浆比出现升高趋势(与1C相比，P<0.05)，而CNE-2Z相比则表现为降低的趋势(与2C比较，P<0.05)，且TPA与EBV在CNE-2Z细胞表现出协同降低核桨比的作用(P<0.01)，但TPA对CNE-1细胞的核浆比没有影响。
2.4 细胞DNA含量及倍体分布特点(见表3和直方图2) 1C组DNA含量均值高于2C组(P<0.01)，1C组DNA含量直方图DNA倍体分布宽而分散，宽达15C，而2C组DNA倍体分布集中左移至7C附近；1E、1ET组DNA含量均值下降与1C组相比差异有非常显著(P<0.01)；1E、1ET组直方图DNA倍体分布与1C组相比明显集中，分别左移到10C和1C处，而2E、2ET组DNA含量升高与2C组相比仅2ET组差异有非常显著性(P<0.01)；2E组及2ET组含量直方图倍体分布较2C组增宽而分散右移至9C附近；1ET组与1E、2ET与2E组的DNA含量相比均差异有非常显著性(P<0.01)；1ET组与1E、2ET组与2E组相比DNA倍体分布无明显变化。
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表3 各组细胞DNA含量的检测 细胞系
DNA值
数目
范围(U)
(
+s)1C
110
2.88-14.79
6.65±2.36
1E
107
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2.62-10.00
4.56±1.54**
1ET
112
2.45-10.95
5.55±1.37**▲▲
2C
113
2.52-6.86
3.80±0.80＃＃
2E
102
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1.74-8.63
4.04±1.05
2ET
107
2.58-8.71
4.70±1.15**▲▲
与对照组比较，**P<0.01，*P<0.05；与E相比▲▲P<0.01；与1 C相比，＃＃P<0.01。
图2 各组细胞DNA含量和DNA倍体分布
3 讨论
3.1 EBV体外感染细胞株的情况
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有报道，脐带血淋巴细胞和建株时的CNE-1细胞未被EBV感染，而CNE-2Z 细胞已被感染，这与我们实验结果一致。这表明低分化NPC的发生与EBV感染有关。我们的实验结果也发现，EBV体外能感染CNE-1和LC。
3.2 EBV对CNE-1及CNE-2Z和LC细胞分化的影响
EBV对细胞分化的影响以往研究较多的靶细胞是淋巴细胞，其对上皮细胞的影响研究不多，尤其是探讨EBV对不同生长分化状态细胞的作用的研究尚未见报道。我们所选靶细胞为两种不同分化状态的NPC细胞株(CNE-1和CNE-2Z)，用免疫组化技术，观察EBV对细胞分化的影响。结果显示，EBV感染LC和CNE-1后能抑制CNE-1分化；相反，EBV能促进CNE-2Z分化，其原因尚不清楚，可能与EBV感染不同分化状态细胞或者EBV初次感染与再次感染对细胞生长分化有不同影响有关。长期以来，人们对EBV的研究都是基于其促增殖和抑分化而设计的，所得的大量结果也证明其与细胞增殖和去分化有关[3，4]。近来研究发现，EBV和TPA体外转染两株表达EBV受体的永生化鳞状上皮细胞系(SVK-CR2、SCC12F-CR2)后，出现细胞内EBV复制增加，同时细胞出现分化(细胞形态改变及鳞状上皮标记表达)[5]，这与我们的CNE-2Z实验组结果相似。这为探讨EBV影响不同分化状态NPC细胞的演进规律，提供了强有力的实验证据。
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3.3 EBV转染CNE-1和CNE-2Z细胞后，细胞形态和DNA含量变化规律及其生长分化的关系
恶性肿瘤细胞的核染色体变化在于数量增减和结构畸变，其异常必将影响到细胞形态及DNA含量的变化，因此测定病变细胞形态参数和DNA含量及倍体分布，可作为直接反映肿瘤生长分化的重要生物学指标[6]，还有助于了解肿瘤生长过程中干系的选择情况[7，8]。我们利用该技术检测了EBV体外转染的CNE-1和CNE-2Z的形态参数和DNA含量。研究结果显示：(1)CNE-1为大细胞、低核浆比、高DNA含量且倍体分布宽而散的细胞群体；相反，CNE-2Z为小细胞、高核浆比、低DNA含量且倍体分布集中的细胞群体。CNE-1和CNE-2Z分别为高、低分化NPC细胞，但DNA含量和倍体分布的结果似乎与目前公认的恶性肿瘤细胞恶性程度越高，其DNA含量越高和倍体分布也越宽、越分散的变化规律不一致。由于CNE-1和CNE-2Z细胞形态差异大，而且DNA含量由核面积乘光密度的对数得出的，核的大小、染色质的类型(常染色质和异染色质)可直接影响DNA细胞的含量。因此在比较两种形态差异较大的肿瘤细胞分化程度时，仅凭细胞DNA含量难以下结论，应该结合生长分化指标和形态参数(尤其是核浆比)来综合判断；(2)EBV感染CNE-1后，使其形态参数、DNA含量和倍体分布朝类似于低分化CNE-2 Z细胞的方向转变，相反，EBV作用于CNE-2Z后，则使其向高分化CNE-1细胞转变。结果提示EBV感染CNE-1和作用于CNE-2 Z后，可使细胞亚群发生变化，出现一个或几个优势的细胞亚群，从而影响整个细胞群体的生长分化。同时发现EBV感染细胞后核浆比的变化主要由胞浆面积的增减所致，而与核面积改变没有关系。核浆比一直是判断细胞分化程度的一个重要指标，它随肿瘤恶性程度增加而递增，我们的结果与之相符，即高分化CNE-1和EBV使CNE-2 Z细胞分化时核浆比低，相反，低分化CNE-2 Z和EBV促CNE-1细胞增殖时，其核浆比高，表明在判断形态上差异较大的瘤细胞的增殖分化程度时，核浆比是一个良好的指标，优于其他形态参数和DNA含量。
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3.4 TPA对CNE-1和CNE-2 Z细胞分化、形态参数及DNA含量的影响
TPA为常用的促癌剂，但常因浓度不同及作用的细胞不同，其效果也各异[9]。本实验发现，TPA对不同分化状态细胞的影响不同，TPA与EBV协同抑制CNE-1细胞CKpan表达，而对CNE-2 Z的CKpan表达却没有影响，与EBV合用拮抗EBV对CNE-1细胞形态参数和NDA含量的影响，而在CNE-2 Z细胞则拮抗EBV对细胞核面积作用，同时协同对核浆比和DNA含量的影响，其原因可能也与其浓度不同及作用的细胞类型、细胞分化状态不同，因而对细胞的效应不同有关。
4 参考文献
1 Nemerow GR，Cooper NR.Isolation of Epstein-Barr virus and studies of its neutralization by human IgG and complement.J Immunol，1981，127：272
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2 Hedrick JA，Watry D，Speiser，et al.Interation between Epstein-Barr virus and a T cell line(HSB-2) via a receptor phenotypcally distinct from complement receptor type2.Eur J Immunol，1992，22：1123
3 Fahraus R.Morphological transformation of human keratinicytes expressing the LMP gene of Epstein-Barr virus.Nature，1990，345：447
4 Dawson CW.LMP inhibits human epithelia cell differentiation.Nature，1990，344：777
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5 Li QX，Young LS，Niedobitck G，et al.Epstein-Barr virus infection and replication in a human epithelial cell system.Nature，1992，356：347
6 左连富，郭建文，许树堂，等.3050例恶性肿瘤DNA倍体分析.中华病理学杂志，1992，21(3)：167
7 Nowell PC.Mechanisms of tumro progression.Cancer Res，1986，44：2203
8 罗经文，孙宁，沈淑静.人鼻咽癌克隆株体外传代过程中的群体变化.细胞生物学杂志，1996，18(2)：79
9 Blumberg PM，Jaken S，Konig B，et al.Mechanisms of the phorbol ester tumor promoters specific receptors for lipophilic ligands.Bio Pharmacology，1984，33(3)：933
收稿日期：1998-12-23, http://www.100md.com