人非小细胞肺癌药物敏感性的MTT法测定
作者： 郭 杨 王增林 任金荣 艾 军 何兰欣 张雪莉
单位：华北煤炭医学院附属医院 063000
关键词：
中国综合临床990442 建立肿瘤药敏检测方法，可提高肿瘤化疗用药的针对性及选择综合疗法的可靠性。本文应用MTT比色法检测了71例手术治疗的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞对临床上常用的9种化疗药物的敏感性。报道如下。
1 材料与方法
1.1 标本与药物 71例NSCLC标本制成单细胞悬液。化疗药物：阿霉素(ADM)，顺铂(DDP)，卡铂(CBDCA)，丝裂霉素(MMC)，5-氟尿嘧啶(5-FU)，足叶乙甙(VP-16)，长春新硷(VCR)，平阳霉素(BLM)，甲氨喋呤(MTX)。体外试验药物浓度(μg/ml)C=50×D(临床每日用药剂量)/5 000×2×103，试验药物以生理盐水配成所需溶液，-20℃保存备用。
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1.2 MTT比色法 参照Tada测定活细胞的改良MTT法[1]，将单细胞悬液接种于96孔板(200μl/孔)中，与化疗药物(20μl/孔)一起混合培养48h，加入20μl MTT-PBS溶液(5mg/ml)，培养4～6h，以10% SDS-0.01mmol/L HCl溶液终止反应，放置过夜，于酶联免疫检测仪上测定OD(λ=570nm)。化疗药物对肿瘤细胞的抑制率以细胞毒性指数(CI)来表示，CI%=(1-实验组均值/对照组均值)×100%。以CI≥30%为敏感性药物。
2 结果
71例肺癌标本有57例获得满意结果，14例标本由于原代瘤细胞生长不良失败，总体可评价率为80.28%。其中腺癌标本成功率高，为91.30%(21/23)，鳞癌标本为65.71%(23/35)。本组57例NSCLC对9种化疗药物的敏感度(敏感例数/总例数)为：DDP 56.14%(32/57)、CBDCA 47.37%(27/57)、MMC 42.10%(24/57)、5-Fu36.84%(21/57)、BLM 35.09%(20/57)、VCR 24.56%(14/57)、VP-16 21.05%(12/57)、MTX 19.30%(11/57)、ADM 17.54%(10/57)。
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九种药物对腺癌和鳞癌的抑制率见附表。腺癌组中除ADM与MTX之间无显著性差异(P>0.05)外，余各药之间均有显著性差异(P<0.01)；鳞癌组中除CBDCA与5-Fu之间无显著性差异(P>0.05)外，余各药之间均有显著性差异(P<0.01)；同一种药物对腺癌组、鳞癌组的抑制率除VCR、MTX无显著性差异(P>0.05)外，余7种药物均有显著性差异(P<0.01)。
附表 9种药物对肺腺癌和肺鳞癌标本的抑制率(%
±s) 类型
ADM
DDP
CBDCA
MMC
5-Fu
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VP-16
VCR
BLM
MTX
腺癌
11.53±2.77
42.44±3.22
35.90±3.09
23.02±2.56
31.40±3.11
8.40±2.39
19.77±3.56
, 百拇医药
28.07±3.36
13.80±3.75
鳞癌
31.41±3.57
65.03±2.53
49.46±3.01
56.81±5.76
51.22±3.30
40.79±3.50
19.03±3.61
47.15±3.70
12.39±2.28
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P
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
>0.05
<0.01
>0.05
3 讨论
目前，进展期肺癌的治愈率仅13%，导致治疗失败的主要原因是瘤细胞的播散。NSCLC在发现时已有70%左右患者有远处转移而不能手术，即使能手术，体内也有微小转移灶。化疗作为全身性治疗的手段，在NSCLC中有效率为10%～30%，成为延长肺癌患者生存的重要方法之一[2]。但由于个体肿瘤细胞生物学特性的差异，使得临床上化疗取得的效果差别很大。因此，对手术切除的肺癌组织细胞进行药物敏感性及其生物学特性的测定是必要的。
, 百拇医药
Mosmann提出的四唑蓝快速比色法(MTT法)[3]方法简便、用药少、判断结果快、能同时进行各种抗肿瘤药物的大量筛选。其不足之处是对肿瘤细胞非直接作用的药物常显假阴性，由于环磷酰胺需先经肝内氧化酶代谢后转换成有效物质才对肿瘤细胞产生杀伤效应，故本试验中未选用。另外，为了避免有色的抗肿瘤药物沉积于96孔板底不易洗净，影响比色结果，本试验中均未重复使用96孔板。
MTT法药物敏感性试验成功与否与恶性肿瘤的病理类型和肿瘤细胞生长情况有关[2]。腺癌细胞体外生长良好，成功率高；鳞癌细胞体外生长较差，成功率较低。在本组实验中，腺癌标本的可评价率最高为91.30%，鳞癌标本为63.64%，与报道相符。另外，同一种药物对腺癌、鳞癌细胞的抑制率除VCR、MTX无显著性差异(P>0.05)外，其余7种药物对鳞癌组的抑制率明显高于腺癌组(P<0.01)。这与肺鳞癌的化疗效果高于肺腺癌的临床报告相符。而腺癌组及鳞癌组中均以DDP对瘤细胞的抑制率最高，分别为42.44%±3.22%、65.03%±2.53%，这与目前把肺腺癌、肺鳞癌均列为NSCLC来考虑以DDP为基础的联合化疗的观点相一致。
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本试验显示，不同类型的肺癌细胞对化疗药物的敏感性不同，而同一类型的肺癌细胞对同一种化疗药物的敏感性也不同，个别差异较大，提示了肺癌需经“个体化”化学治疗的重要性。NSCLC对常用的9种化疗药物的敏感度(由高到低)为：DDP>CBDCA>MMC>5-Fu>BLM>VCR>VP-16>MTX>ADM，可为临床用药提供参考。总之，MTT法是一种简单、快捷的体外药敏检测方法，它能帮助临床医生选择有效的化疗药物，合理设计治疗方案，提高治疗效果。
参考文献
1 Tada H,Shiho O,Kueoshima K,et al.An improved colorimetric assay for interleukin.J Immunol Meth,1986,93:157
2 张胜本.肿瘤化学治疗敏感性与抗药性.成都:四川科学技术出版社,1995.119～121
3 Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxic assay.J Immunol Methods.1983,65(1):55
[收稿：1998-12-11], 百拇医药
单位：华北煤炭医学院附属医院 063000
关键词：
中国综合临床990442 建立肿瘤药敏检测方法，可提高肿瘤化疗用药的针对性及选择综合疗法的可靠性。本文应用MTT比色法检测了71例手术治疗的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞对临床上常用的9种化疗药物的敏感性。报道如下。
1 材料与方法
1.1 标本与药物 71例NSCLC标本制成单细胞悬液。化疗药物：阿霉素(ADM)，顺铂(DDP)，卡铂(CBDCA)，丝裂霉素(MMC)，5-氟尿嘧啶(5-FU)，足叶乙甙(VP-16)，长春新硷(VCR)，平阳霉素(BLM)，甲氨喋呤(MTX)。体外试验药物浓度(μg/ml)C=50×D(临床每日用药剂量)/5 000×2×103，试验药物以生理盐水配成所需溶液，-20℃保存备用。
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1.2 MTT比色法 参照Tada测定活细胞的改良MTT法[1]，将单细胞悬液接种于96孔板(200μl/孔)中，与化疗药物(20μl/孔)一起混合培养48h，加入20μl MTT-PBS溶液(5mg/ml)，培养4～6h，以10% SDS-0.01mmol/L HCl溶液终止反应，放置过夜，于酶联免疫检测仪上测定OD(λ=570nm)。化疗药物对肿瘤细胞的抑制率以细胞毒性指数(CI)来表示，CI%=(1-实验组均值/对照组均值)×100%。以CI≥30%为敏感性药物。
2 结果
71例肺癌标本有57例获得满意结果，14例标本由于原代瘤细胞生长不良失败，总体可评价率为80.28%。其中腺癌标本成功率高，为91.30%(21/23)，鳞癌标本为65.71%(23/35)。本组57例NSCLC对9种化疗药物的敏感度(敏感例数/总例数)为：DDP 56.14%(32/57)、CBDCA 47.37%(27/57)、MMC 42.10%(24/57)、5-Fu36.84%(21/57)、BLM 35.09%(20/57)、VCR 24.56%(14/57)、VP-16 21.05%(12/57)、MTX 19.30%(11/57)、ADM 17.54%(10/57)。
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九种药物对腺癌和鳞癌的抑制率见附表。腺癌组中除ADM与MTX之间无显著性差异(P>0.05)外，余各药之间均有显著性差异(P<0.01)；鳞癌组中除CBDCA与5-Fu之间无显著性差异(P>0.05)外，余各药之间均有显著性差异(P<0.01)；同一种药物对腺癌组、鳞癌组的抑制率除VCR、MTX无显著性差异(P>0.05)外，余7种药物均有显著性差异(P<0.01)。
附表 9种药物对肺腺癌和肺鳞癌标本的抑制率(%
±s) 类型ADM
DDP
CBDCA
MMC
5-Fu
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VP-16
VCR
BLM
MTX
腺癌
11.53±2.77
42.44±3.22
35.90±3.09
23.02±2.56
31.40±3.11
8.40±2.39
19.77±3.56
, 百拇医药
28.07±3.36
13.80±3.75
鳞癌
31.41±3.57
65.03±2.53
49.46±3.01
56.81±5.76
51.22±3.30
40.79±3.50
19.03±3.61
47.15±3.70
12.39±2.28
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P
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3 讨论
目前，进展期肺癌的治愈率仅13%，导致治疗失败的主要原因是瘤细胞的播散。NSCLC在发现时已有70%左右患者有远处转移而不能手术，即使能手术，体内也有微小转移灶。化疗作为全身性治疗的手段，在NSCLC中有效率为10%～30%，成为延长肺癌患者生存的重要方法之一[2]。但由于个体肿瘤细胞生物学特性的差异，使得临床上化疗取得的效果差别很大。因此，对手术切除的肺癌组织细胞进行药物敏感性及其生物学特性的测定是必要的。
, 百拇医药
Mosmann提出的四唑蓝快速比色法(MTT法)[3]方法简便、用药少、判断结果快、能同时进行各种抗肿瘤药物的大量筛选。其不足之处是对肿瘤细胞非直接作用的药物常显假阴性，由于环磷酰胺需先经肝内氧化酶代谢后转换成有效物质才对肿瘤细胞产生杀伤效应，故本试验中未选用。另外，为了避免有色的抗肿瘤药物沉积于96孔板底不易洗净，影响比色结果，本试验中均未重复使用96孔板。
MTT法药物敏感性试验成功与否与恶性肿瘤的病理类型和肿瘤细胞生长情况有关[2]。腺癌细胞体外生长良好，成功率高；鳞癌细胞体外生长较差，成功率较低。在本组实验中，腺癌标本的可评价率最高为91.30%，鳞癌标本为63.64%，与报道相符。另外，同一种药物对腺癌、鳞癌细胞的抑制率除VCR、MTX无显著性差异(P>0.05)外，其余7种药物对鳞癌组的抑制率明显高于腺癌组(P<0.01)。这与肺鳞癌的化疗效果高于肺腺癌的临床报告相符。而腺癌组及鳞癌组中均以DDP对瘤细胞的抑制率最高，分别为42.44%±3.22%、65.03%±2.53%，这与目前把肺腺癌、肺鳞癌均列为NSCLC来考虑以DDP为基础的联合化疗的观点相一致。
, http://www.100md.com
本试验显示，不同类型的肺癌细胞对化疗药物的敏感性不同，而同一类型的肺癌细胞对同一种化疗药物的敏感性也不同，个别差异较大，提示了肺癌需经“个体化”化学治疗的重要性。NSCLC对常用的9种化疗药物的敏感度(由高到低)为：DDP>CBDCA>MMC>5-Fu>BLM>VCR>VP-16>MTX>ADM，可为临床用药提供参考。总之，MTT法是一种简单、快捷的体外药敏检测方法，它能帮助临床医生选择有效的化疗药物，合理设计治疗方案，提高治疗效果。
参考文献
1 Tada H,Shiho O,Kueoshima K,et al.An improved colorimetric assay for interleukin.J Immunol Meth,1986,93:157
2 张胜本.肿瘤化学治疗敏感性与抗药性.成都:四川科学技术出版社,1995.119～121
3 Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxic assay.J Immunol Methods.1983,65(1):55
[收稿：1998-12-11], 百拇医药