PGGT单克隆抗体制备及其鉴别梗阻性黄疸的价值
作者：芮理 沈洪薰 陈玉泉
单位：南通医学院附属医院普外科(226001)
关键词：梗阻性黄疸；PGGT单克隆抗体
肝胆胰外科杂志990416 摘 要 目的 介绍PGGT单克隆抗体制备方法及探讨其对梗阻性黄疸鉴别的价值。方法 用杂交瘤技术制备人胰源性γ-谷氨酰转移酶(PGGT)单克隆抗体，并采用间接混合夹心法(Elisa)检测临床103例黄疸病人和40例健康人血清。结果 恶性阻黄组阳性率为59.09%，其中胰头癌组阳性率为100%，良性阻黄组、黄疸性肝炎组及健康人组均为阴性。结论 PGGT单克隆抗体在黄疸的鉴别诊断中特别是对胰头癌的诊断有重要意义。
梗阻性黄疸鉴别诊断的血清学检测方法繁多，仅凭一二项检查，有时难以作出明确诊断。作者从人胰腺组织中提取PGGT达电泳纯，应用杂交瘤技术制备PGGT单克隆抗体，并采用此抗体检测血清标本143例，结果提示PGGT单克隆抗体显著地提高了恶性阻黄特别是胰头癌诊断的特异性，现总结报告如下。
, 百拇医药
1 资料、方法和结果
1.1 一般资料 本组共测血清143例，其中黄疸组103例，健康人血清对照组40例。所有病例均经手术和病理证实，各组的性别构成、年龄及血清GGT浓度见表1。
表1 PGGT单抗检测的临床病理情况 类别
例数
性别
平均
年龄
GGT(U/I)
男
女
恶性阻黄组
, 百拇医药
22
17
5
59.6
179～602
胰头癌
12
9
3
59.0
243～602
胆管癌
10
, 百拇医药
8
2
60.2
179～502
良性阻黄组
31
19
12
43.8
105～389
黄疸性肝炎组
50
35
, 百拇医药
15
28.7
28～202
健康对照组
40
26
14
25.0
0～40
1.2 PGGT单克隆杂交瘤细胞株的建立 (1)免疫：取抗原PGGT 0.2mg与0.2ml福氏佐剂混匀，半量分别注入两只BALB/C小鼠腹腔内约40μg/只，3周后加强免疫一次，抗原量为30μg/只，在细胞融合前3天再次免疫一次，抗原量为45μg/只。(2)免疫脾细胞悬液制备：将上述免疫/BALB/C小鼠处死，无菌开腹剪开脾包膜，挤压脾脏使脾细胞从破口流出，悬于10ml 1640培养液中；(3)细胞融合：取对数生长期SP 2/0骨髓瘤细胞悬于1640培养液中，细胞总数为2×107，取4ml脾细胞悬液加入上述SP 2/0细胞悬液中，充分混匀后离心，将沉淀细胞悬于含20%小牛血清的HAT培养液4ml中，分配在加有饲养细胞的96孔培养板中培养，融合7天后，改用HT培养液，14天后改用1640-15完全培养液；(4)PGGT杂交瘤细胞的克隆化：用Elisa法检测有细胞生长中的上清液，共检测出6个抗PGGT阳性孔，将抗体阳性孔中的细胞吸出，配制成2ml细胞悬液，将此悬液稀释(有限稀释法)，进行克隆化培养，经3次克隆得3株单克隆杂交瘤细胞；将处于对数生长期细胞进行扩大培养，收集细胞用于制备单克隆抗体及冻存。
, 百拇医药
1.3 PGGT单克隆抗体制备 小鼠预处理取9只成年BALB/C小鼠给腹腔注射液体石蜡0.5ml，饲养一周后致瘤，每只小鼠予腹腔注射1ml单克隆杂交瘤细胞悬液，细胞浓度为1×109/L，第11天抽取小鼠腹水离心得上清液-30℃冻存备用。
1.4 PGGT兔多抗血清制备 取2kg家兔一只，将PGGT抗原与福氏佐混均后，用注射器在兔背部皮内多点注射，抗原免疫总量为0.5mg，4周后重复免疫一次，3周后测血清中抗体出现强阳性时，处死动物，取颈动脉血离心得血清-30℃冻存备用。
1.5 临床病例检测方法 Elisa间接混合夹心法。
1.6 结果 见表2。
表2 PGGT单克隆抗体检测结果 类别
例数
, 百拇医药
Elisa试验
阳性
阴性
恶性阻黄组
22
13
0
胰头癌
12
12
0
胆管癌
10
, 百拇医药 1
9
良性阻黄组
31
0
31
黄疸性肝炎组
50
0
50
健康对照组
40
0
40
, 百拇医药
合 计
143
13
130
2 讨论
本研究应用杂交瘤技术成功地制备了PGGT单克隆抗体：(1)杂交瘤细胞制备，小鼠的免疫方案各实验室不尽相同，目前尚无最适宜的、能有效地供融合用的B淋巴细胞的常规免疫法，较为常用的有小剂量多次免疫，脾内直接注射法及短程免疫法，作者采用小剂量多次免疫，融合前3天加强免疫，结果非常理想；(2)细胞融合：为杂交瘤工作中的关键步骤，细胞融合所需的骨髓瘤细胞最好是与免疫脾细胞呈同源性，融合后所得的杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔后既表受排斥，又可形成腹腔肿瘤和诱发腹水产生高效价的单克隆抗体。骨髓瘤细胞应无变异及返祖，并处于对数生长期，作者采用SP 2/0骨髓瘤细胞株，在培养过程中，用8-氮鸟嘌呤克隆一次，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性，保证了细胞融合的成功，作者采用分子量1 000的PEG，在融合前先测定其毒性和促融合能力，以保证细胞融合及杂交瘤细胞生存繁殖的成功。(3)杂交瘤细胞的筛选，融合后的细胞在HAT培养基中培养后，既有部分培养孔出现杂交瘤细胞的集溶，但其中仅部分是分泌针对预定抗原特异性抗体。作者采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)行杂交瘤细胞的筛选，方法快速方便，敏感性高，特异性好，方法稳定，结果满意。(4)杂交瘤细胞的克隆化，在细胞融合成功并证实培养孔中存在预定抗原特异性的抗体时，应尽快将杂交瘤细胞克隆化，其目的是利用单个细胞培养技术从细胞群中选育出遗传稳定而同源的细胞系，克隆化的方法包括有限稀释法，软琼脂培养法，单个细胞显微操作法，荧光激活细胞分离器法等，作者采用有限稀释法进行细胞克隆化，共克隆3次，最后一次克隆化结果符合Poissio分布的单个克隆的生长孔数，而且全部克隆生长孔的上清液均检出预定的抗体，作者认为，有限稀释法操作较为简便易行的细胞克隆化方法。
, 百拇医药
γ-谷氨酰转移酶(GGT)在人体肝、肾、胰组织中均很丰富。血清中的GGT主要来源于肝脏及胰腺。如肝胆胰发生病变时，血中GGT水平均显著升高。本文中103例肝胆胰疾病者GGT均明显升高，无显著性差异，故血GGT对梗阻性黄疸的鉴别诊断缺乏特异性。我们从人胰腺中提取GGT称PGGT。并测定血清PGGT水平，用于诊断胰头癌。并提出血清PGGT>4u/L,PGGT/TGGT(总GGT)>0.1作为诊断胰头癌的指标，其阳性率为62.5%，又用PGGT/TGGT与CA50、CEA、CA199进行比较研究发现，PGGT/TGGT的敏感性和特异性明显优于CA50、CEA、CA199。本研究在此基础上，制备了PGGT单克隆抗体，并应用此单抗检测143例血清，结果表明PGGT单抗检测血清中PGGT诊断恶性阻黄及胰头癌阳性率明显提高，分别为59.0%及100%。因此，我们认为PGGT单克隆抗体在梗阻性黄疸鉴别诊断中有其重要意义，并有望成为特异性诊断胰头癌更为理想的免疫学方法。我们将进一步从分子生物学水平上研究PGGT与胰头癌的关系。
参考文献
, http://www.100md.com
1 黄鹏，陈玉泉，沈洪薰等.γ-GT同工酶在肝胆外科鉴别诊断中价值.南通医学院学报，1984，4(1)∶7
2 朱远源，沈洪薰，陈玉泉等.PGGT/TGGT比值在胰头癌鉴别诊断中的意义.江苏医药，1985，11∶13
3 沈洪薰，陈玉泉等.血清PGGT，PGGT/TGGT诊断胰头癌临床价值.中华外科杂志，1991，29∶63
4 牛玉坚，陈玉泉，沈洪薰等.血清PGGT，PGGT/TGGT，CA50和CEA诊断胰头癌临床研究.南通医学院学报，1995，(15)∶5
(收稿：1999-04-06，修回：1999-05-28), 百拇医药
单位：南通医学院附属医院普外科(226001)
关键词：梗阻性黄疸；PGGT单克隆抗体
肝胆胰外科杂志990416 摘 要 目的 介绍PGGT单克隆抗体制备方法及探讨其对梗阻性黄疸鉴别的价值。方法 用杂交瘤技术制备人胰源性γ-谷氨酰转移酶(PGGT)单克隆抗体，并采用间接混合夹心法(Elisa)检测临床103例黄疸病人和40例健康人血清。结果 恶性阻黄组阳性率为59.09%，其中胰头癌组阳性率为100%，良性阻黄组、黄疸性肝炎组及健康人组均为阴性。结论 PGGT单克隆抗体在黄疸的鉴别诊断中特别是对胰头癌的诊断有重要意义。
梗阻性黄疸鉴别诊断的血清学检测方法繁多，仅凭一二项检查，有时难以作出明确诊断。作者从人胰腺组织中提取PGGT达电泳纯，应用杂交瘤技术制备PGGT单克隆抗体，并采用此抗体检测血清标本143例，结果提示PGGT单克隆抗体显著地提高了恶性阻黄特别是胰头癌诊断的特异性，现总结报告如下。
, 百拇医药
1 资料、方法和结果
1.1 一般资料 本组共测血清143例，其中黄疸组103例，健康人血清对照组40例。所有病例均经手术和病理证实，各组的性别构成、年龄及血清GGT浓度见表1。
表1 PGGT单抗检测的临床病理情况 类别
例数
性别
平均
年龄
GGT(U/I)
男
女
恶性阻黄组
, 百拇医药
22
17
5
59.6
179～602
胰头癌
12
9
3
59.0
243～602
胆管癌
10
, 百拇医药
8
2
60.2
179～502
良性阻黄组
31
19
12
43.8
105～389
黄疸性肝炎组
50
35
, 百拇医药
15
28.7
28～202
健康对照组
40
26
14
25.0
0～40
1.2 PGGT单克隆杂交瘤细胞株的建立 (1)免疫：取抗原PGGT 0.2mg与0.2ml福氏佐剂混匀，半量分别注入两只BALB/C小鼠腹腔内约40μg/只，3周后加强免疫一次，抗原量为30μg/只，在细胞融合前3天再次免疫一次，抗原量为45μg/只。(2)免疫脾细胞悬液制备：将上述免疫/BALB/C小鼠处死，无菌开腹剪开脾包膜，挤压脾脏使脾细胞从破口流出，悬于10ml 1640培养液中；(3)细胞融合：取对数生长期SP 2/0骨髓瘤细胞悬于1640培养液中，细胞总数为2×107，取4ml脾细胞悬液加入上述SP 2/0细胞悬液中，充分混匀后离心，将沉淀细胞悬于含20%小牛血清的HAT培养液4ml中，分配在加有饲养细胞的96孔培养板中培养，融合7天后，改用HT培养液，14天后改用1640-15完全培养液；(4)PGGT杂交瘤细胞的克隆化：用Elisa法检测有细胞生长中的上清液，共检测出6个抗PGGT阳性孔，将抗体阳性孔中的细胞吸出，配制成2ml细胞悬液，将此悬液稀释(有限稀释法)，进行克隆化培养，经3次克隆得3株单克隆杂交瘤细胞；将处于对数生长期细胞进行扩大培养，收集细胞用于制备单克隆抗体及冻存。
, 百拇医药
1.3 PGGT单克隆抗体制备 小鼠预处理取9只成年BALB/C小鼠给腹腔注射液体石蜡0.5ml，饲养一周后致瘤，每只小鼠予腹腔注射1ml单克隆杂交瘤细胞悬液，细胞浓度为1×109/L，第11天抽取小鼠腹水离心得上清液-30℃冻存备用。
1.4 PGGT兔多抗血清制备 取2kg家兔一只，将PGGT抗原与福氏佐混均后，用注射器在兔背部皮内多点注射，抗原免疫总量为0.5mg，4周后重复免疫一次，3周后测血清中抗体出现强阳性时，处死动物，取颈动脉血离心得血清-30℃冻存备用。
1.5 临床病例检测方法 Elisa间接混合夹心法。
1.6 结果 见表2。
表2 PGGT单克隆抗体检测结果 类别
例数
, 百拇医药
Elisa试验
阳性
阴性
恶性阻黄组
22
13
0
胰头癌
12
12
0
胆管癌
10
, 百拇医药 1
9
良性阻黄组
31
0
31
黄疸性肝炎组
50
0
50
健康对照组
40
0
40
, 百拇医药
合 计
143
13
130
2 讨论
本研究应用杂交瘤技术成功地制备了PGGT单克隆抗体：(1)杂交瘤细胞制备，小鼠的免疫方案各实验室不尽相同，目前尚无最适宜的、能有效地供融合用的B淋巴细胞的常规免疫法，较为常用的有小剂量多次免疫，脾内直接注射法及短程免疫法，作者采用小剂量多次免疫，融合前3天加强免疫，结果非常理想；(2)细胞融合：为杂交瘤工作中的关键步骤，细胞融合所需的骨髓瘤细胞最好是与免疫脾细胞呈同源性，融合后所得的杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔后既表受排斥，又可形成腹腔肿瘤和诱发腹水产生高效价的单克隆抗体。骨髓瘤细胞应无变异及返祖，并处于对数生长期，作者采用SP 2/0骨髓瘤细胞株，在培养过程中，用8-氮鸟嘌呤克隆一次，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性，保证了细胞融合的成功，作者采用分子量1 000的PEG，在融合前先测定其毒性和促融合能力，以保证细胞融合及杂交瘤细胞生存繁殖的成功。(3)杂交瘤细胞的筛选，融合后的细胞在HAT培养基中培养后，既有部分培养孔出现杂交瘤细胞的集溶，但其中仅部分是分泌针对预定抗原特异性抗体。作者采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)行杂交瘤细胞的筛选，方法快速方便，敏感性高，特异性好，方法稳定，结果满意。(4)杂交瘤细胞的克隆化，在细胞融合成功并证实培养孔中存在预定抗原特异性的抗体时，应尽快将杂交瘤细胞克隆化，其目的是利用单个细胞培养技术从细胞群中选育出遗传稳定而同源的细胞系，克隆化的方法包括有限稀释法，软琼脂培养法，单个细胞显微操作法，荧光激活细胞分离器法等，作者采用有限稀释法进行细胞克隆化，共克隆3次，最后一次克隆化结果符合Poissio分布的单个克隆的生长孔数，而且全部克隆生长孔的上清液均检出预定的抗体，作者认为，有限稀释法操作较为简便易行的细胞克隆化方法。
, 百拇医药
γ-谷氨酰转移酶(GGT)在人体肝、肾、胰组织中均很丰富。血清中的GGT主要来源于肝脏及胰腺。如肝胆胰发生病变时，血中GGT水平均显著升高。本文中103例肝胆胰疾病者GGT均明显升高，无显著性差异，故血GGT对梗阻性黄疸的鉴别诊断缺乏特异性。我们从人胰腺中提取GGT称PGGT。并测定血清PGGT水平，用于诊断胰头癌。并提出血清PGGT>4u/L,PGGT/TGGT(总GGT)>0.1作为诊断胰头癌的指标，其阳性率为62.5%，又用PGGT/TGGT与CA50、CEA、CA199进行比较研究发现，PGGT/TGGT的敏感性和特异性明显优于CA50、CEA、CA199。本研究在此基础上，制备了PGGT单克隆抗体，并应用此单抗检测143例血清，结果表明PGGT单抗检测血清中PGGT诊断恶性阻黄及胰头癌阳性率明显提高，分别为59.0%及100%。因此，我们认为PGGT单克隆抗体在梗阻性黄疸鉴别诊断中有其重要意义，并有望成为特异性诊断胰头癌更为理想的免疫学方法。我们将进一步从分子生物学水平上研究PGGT与胰头癌的关系。
参考文献
, http://www.100md.com
1 黄鹏，陈玉泉，沈洪薰等.γ-GT同工酶在肝胆外科鉴别诊断中价值.南通医学院学报，1984，4(1)∶7
2 朱远源，沈洪薰，陈玉泉等.PGGT/TGGT比值在胰头癌鉴别诊断中的意义.江苏医药，1985，11∶13
3 沈洪薰，陈玉泉等.血清PGGT，PGGT/TGGT诊断胰头癌临床价值.中华外科杂志，1991，29∶63
4 牛玉坚，陈玉泉，沈洪薰等.血清PGGT，PGGT/TGGT，CA50和CEA诊断胰头癌临床研究.南通医学院学报，1995，(15)∶5
(收稿：1999-04-06，修回：1999-05-28), 百拇医药