短期制动对兔膝外侧副韧带生物力学与形态学的影响
作者：张长杰 陈晓文
单位：湖南医科大学第二附属医院 (长沙 410011)
关键词：侧副韧带；制动；生物力学；形态学
湖南医学/990404 摘 要 【目的】研究制动对外侧副韧带生物力学及形态学的影响。【方法】选用新西兰兔15只，10只行右后肢膝关节全屈曲位内固定4周。取外侧副韧带进行生物力学测试和形态学观察。【结果】实验组外侧副韧带横截面积，最大负荷、能量吸收较对侧对照和正常对照组减少，能量吸收与正常对照组存在显著性差异(P<0.05)；最大应力、弹性模量比较无显著差异，材料常数X1、X2与对侧对照组和正常对照组比较有显著性差异(P<0.05)。胶原纤维排列类似正常，细胞形态无明显变化，断裂方式大部分为腓骨止点撕脱骨折。【结论】制动4周，对膝外侧副韧带生物力学和形态学影响不明显。
, http://www.100md.com
Effect of Short-term Immobilization on Biomechanics and Morphology of Lateral Collateral Ligaments on the Knee of Rabbits
ZHANG Changjie,CHEN Xiaowen
Department of Rehabilitation Medicine,The Second Affiliated Hospital,Hunan Medical University,Changsha,410011
Abstract 【Objective】To elucidate effect of immobilization on biomechanics and morphology of lateral collateral ligaments(LCL) on the knee of rabbits.【Methods】Fifteen New Zealand white rabbits were divided into three groups:Group I-10 rabbits were immobilized for four weeks;GroupⅡ-same 10 rabbits served as contralateral control;Group Ⅲ-5 rabbits were selected as age matched normal control.The right hindlimb of each experimental rabbit was surgically immobilized in full flexion(170°)by thread pin-internal fixation.The biomechanical testing,histological and ultrastructural evaluation were carried out.【Results】Area of transverse section,maximal loading and energy absorption of LCL in Group I decreased as compared with those of other two groups.In addition,there was significant difference between the material constants X1 and X2 of Group I and those of other two groups (P<0.05).Histologically,after immobilization for four weeks,arrangement of collagen fibers of LCL in Group I was similar to that in normal control.The shape of fibroblasts showed not distinct alteration.The rupture mode of LCL was mainly avulsion fracture of fibular insertion sites.【Conclusion】Effects of immobilization for four weeks on biomechanics and morphology of LCL on rabbit knees were not obvious.
, 百拇医药
Key words collateral ligament; immobilization; biomechanics; morphology
制动具有双重效应，一方面，制动作为一种治疗手段有助于减轻疼痛，有利于损伤组织愈合；另一方面，人们也逐渐认识到制动对关节的活动和功能产生不利影响。而制动对关节组织的实际生理效应才受到重视。韧带是关节外结缔组织成份之一，因其两端与骨连接构成骨-韧带-骨组合体，易于钳夹，在生物力学试验中具有优势。对膝周的交叉韧带、内侧副韧带已有一些研究，而对外侧副韧带的研究甚少。本文拟选择兔的外侧副韧带(lateral collateral ligamnent,LCL)作为研究对象，从生物力学，组织形态学方面研究制动对LCL的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 新西兰大白兔15只，兔龄3～5月，体重2.2～2.7 kg。随机分为3组。实验组10只，右后肢膝关节制动4周；对侧对照组10只，不制动；正常对照组5只，不作任何处理，只作年龄相匹配的正常对照。
, 百拇医药
1.2 内固定制动方法[1] 术前在直径2.0 mm的克氏钢针一端制作螺纹，拧上螺帽备用。3%戊巴比妥钠(1 ml/kg体重)耳缘静脉注射麻醉。自右后肢胫骨上1/3处切开皮肤，显露胫骨，用骨钻在胫骨上从前至后钻一洞，将克氏钢针从洞中穿出并经皮肤皱折抵达股骨外侧面皮下，切小口伸出钢针，将钢针弯成钩套在股骨上并充分屈曲膝关节，通过螺帽调节屈曲角度使膝固定于屈曲170°位。左后肢不作处理，作对侧对照组。
1.3 肉眼观察 将兔放出笼外观察行走时右后肢负重情况及伤口有无感染。切取标本时观察膝关节及韧带的颜色、质地、有无粘连和组织萎缩。
1.4 形态学观察 麻醉下取外侧副韧带及其止点骨块，骨块脱钙，按组织学常规切片，HE和VG染色法染色。电镜标本将韧带切成约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，3%戊二醛液固定，0.1 M磷酸缓冲液漂洗，锇酸后固定，丙酮脱水，环氧树脂618包埋，LKB 4800型超薄切片机切出500～700
超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，JEM-1200 EX透射电镜下观察。
, 百拇医药
1.5 生物力学试验 试验前将冷冻标本解冻，剥离除外侧副韧带外的所有软组织，获取完整的股骨-外侧副韧带-胫骨标本。用游标卡尺(测定精度为0.02 mm)测量LCL在无应力状态下的初始长度，共测3次，求平均值。LCL的横截面积参考Yamamoto等[2]的方法，使用软组织截面面积测微计测量。将试件固定在自制的夹具固定上，再把夹具固定在CSS-1102 C型电子万能试验机上，使韧带的纵轴与拉力线方向一致。试件与夹具浸泡在充满生理盐水溶液的恒温水箱中，先进行预调，以5 mm/min的加载速率，在0～2%应变范围内对试件进行循环加、卸载，进行5次，此时加、卸载曲线趋于重叠，得出的实验数据基本稳定。预调结束后进行拉伸试验及断裂试验，结果由计算机自动记录并打印。
在软组织拉伸试验中，常采用Lagaranian应力。根据实验数据类型，推导出Lagaranian应力T为：
T=X1.E.X2.λ.EXP[X2(E2-E*2)]
, 百拇医药
其中X1，X2是材料常数，E*是相应于某一选定的应力S*时的应变，E为应变，λ是伸长比。上式表示LCL的非线性本构方程。
2 结果
2.1 肉眼观察 制动4周兔行走跳跃时制动侧部分负重，股四头肌有轻度压痕，韧带外观尚正常或有轻度粘连。
2.2 生物力学试验 ①制动后LCL初长及横截面积的变化 制动4周：LCL初长值(15.94 mm)较对侧对照(16.57 mm)及正常对照组(16.80 mm)略短，但三者无显著性差异(P>0.05)；LCL横截面积实验组为1.97 mm2，对侧对照组为2.42 mm2，正常对照组为2.47 mm2，三者亦无显著性差异。②制动后LCL结构特性和材料特性的变化：实验组最大负荷和能量吸收减少，能量吸引与正常对照组比较差异有显著性(P<0.05)。实验组最大应力降低，最大应变变小，弹性模量变化不明显，与对侧对照和正常对照组差异不显著(P>0.05，见表1)。
, 百拇医药
表1 制动对LCL结构特性和材料特性的影响(
±s) 组别
n
最大负荷
(N)
能量吸收
(N.MM)
最大应力
(MPa)
最大应变
(%)
弹性量模
, 百拇医药
(MPa)
实验组
8
39.42±
14.17
103.73±
31.94*
20.29±
8.06
22.53±
2.18
81.46±
, 百拇医药 19.16
对侧对照组
8
65.55±
15.11
176.55±
41.40
27.93±
9.18
32.83±
2.30
84.39±
23.66
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正常对照组
8
68.08±
21.69
185.55±
17.66
27.46±
12.01
31.75±
2.33
82.01±
10.26
*与正常组比较：P<0.05
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LCL的材料常数X2值与对侧对照和正常对照组比较有显著差异(P<0.05，见表2)。③制动后LCL应力-应变曲线的变化：制动4周，LCL应力-应变曲线与对侧对照组和正常组接近。④制动后LCL的断裂方式：制动4周后韧带骨组合体断裂方式80%为腓骨小头撕脱骨折，20%为股骨起点断裂。
表2 LCL的材料常数(无量纲) 组 别
X1
X2
实验组
1.5917±0.1586
15.8523±4.86251)2)
对侧对照组
, 百拇医药
1.4479±0.1572
31.2048±4.7394
正常对照组
1.4408±0.1359
30.9621±3.4752
1)与对侧对照组比较：P<0.05；2)与正常组比较：P<0.05
2.3 光镜观察结果 制动4周，LCL胶原纤维的排列，韧带骨止点与正常对照LCL相似(封三图1)。
2.4 电镜观察结果 4周制动后胶原原纤维排列，成纤维细胞形状(封三图2)，细胞内细胞器均与正常对照类似。
, 百拇医药
图1 制动4周LCL胶原纤维排列尚整齐 图2 制动4周LCL原纤维分布较均匀,结构清
(HE×100) 晰(TEM×25 000)
3 讨论
短期制动对兔LCL的初长和横截面积没有明显影响。其他作者的研究结果与此相似。Walsh等[3]发现制动1月兔内侧副韧带横截面积稍小于正常，而正常组稍小于对侧，但没有统计学的显著性差异。最大负荷和能量吸收反映骨-韧带-骨组合体的整体抗张特性。4周制动，LCL最大负荷和能量吸收减少，反映制动影响韧带-骨组合体的抗张能力，韧带的能量储备也降低。Tipton等[4]报道将狗膝关节固定6周骨-韧带组合体的最大负荷减少37%。韧带-骨组合体结构特性的变化与韧带骨止点的改变有关。
制动除影响韧带的结构特性外，也影响韧带的材料特性。制动4周，最大应力、弹性模量降低。Bindley等[5]报道大鼠制动韧带的最大应力减少64.2%。韧带物质的材料常数正引起重视，在软组织生物力学试验中，有些作者导出组织的本构方程，据此求出组织的材料常数[6]。本文根据实验数据，推导出LCL的非线性本构方程，显示制动对材料常数X1、X2有明显影响。韧带材料特性的改变，与韧带胶原的代谢变化有关。Amiel等[7]显示兔膝关节制动，内侧副韧带胶原合成和降解都增加。
, 百拇医药
本实验结果显示，LCL对侧对照组和正常对照组生物力学指标之间存在差异，提示对侧对照不能代替正常对照，这种差异与制动后对侧的负重和动物全身状态改变有关。Walsh等[3]也观察到对侧韧带与年龄相匹配的正常动物的不同。在本试验中，韧带试件浸泡在37 ℃的生理盐水溶液中，接近活体状态，所得出的结果类似于正常生理状态。以往进行软组织生物力学试验时，为防止试件失水，通常采用棉签将试件浸湿的方法[8]，这增加了操作步骤，能否完全防失水也不能确定。将整个试件浸入特制的双层有机玻璃水箱中，其内充满生理盐水溶液，使韧带不失水并保持等渗状态。结果显示，制动4周后尽管生物力学指标已有改变，但并不特别明显，故在临床使用制动时，制动期的选择最好不要超过4周，此时，韧带等关节周围结缔组织的改变较轻微，组织恢复的可能性较大。
参考文献
1 Newton PO,Woo SL,Mackenna DA,et al.Immobilization of the knee joint alters the
, http://www.100md.com
mechanical and ultrastructure properties of the rabbit anterior cruciate
ligament.J Orthop Res,1995,13:191～200
2 Yamamoto N,Hayashi K,Kuriyama H,et al.Mechanical properties of the rabbit patellar
tendon.J Biomech Eng,1992,114:332～337
3 Walsh S,Frank C,Shrive N,et al.Knee immobilization inhibits biomechanical
maturation of the rabbit medial collateral ligament.Clin Orthop,1993,297:253～261
, 百拇医药
4 Tipton CN,Matthes RD,Maynard IA,et al.The influence of physical activity on
ligament and tendons.Med Sci Sports,1975,7:165～175
5 Binkley JM,Peat M.The effect of immobilization on the ultrastructure and
mechanical properties of the medial collateral ligament of rats.Clin
Orthop,1986,203:301～308
6 成海平.脐带静脉的非线性本构关系.湖北医学院学报，1990，11：191～196
, 百拇医药
7 Amiel D,Akeson WH,Harwood FL,et al.Stress depression effect on metabolic turnover
of the medial collateral ligament collagen.Clin Orthop,1983,172:265～270
8 Woo SL,Newton PO,Machenna DQ,et al.A comparative evaluation of the mechanical
properties of the rabbit medial collateral and anterior cruciate ligaments.J
Biomech,1992,25:377～386
19981214 收稿, 百拇医药
单位：湖南医科大学第二附属医院 (长沙 410011)
关键词：侧副韧带；制动；生物力学；形态学
湖南医学/990404 摘 要 【目的】研究制动对外侧副韧带生物力学及形态学的影响。【方法】选用新西兰兔15只，10只行右后肢膝关节全屈曲位内固定4周。取外侧副韧带进行生物力学测试和形态学观察。【结果】实验组外侧副韧带横截面积，最大负荷、能量吸收较对侧对照和正常对照组减少，能量吸收与正常对照组存在显著性差异(P<0.05)；最大应力、弹性模量比较无显著差异，材料常数X1、X2与对侧对照组和正常对照组比较有显著性差异(P<0.05)。胶原纤维排列类似正常，细胞形态无明显变化，断裂方式大部分为腓骨止点撕脱骨折。【结论】制动4周，对膝外侧副韧带生物力学和形态学影响不明显。
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Effect of Short-term Immobilization on Biomechanics and Morphology of Lateral Collateral Ligaments on the Knee of Rabbits
ZHANG Changjie,CHEN Xiaowen
Department of Rehabilitation Medicine,The Second Affiliated Hospital,Hunan Medical University,Changsha,410011
Abstract 【Objective】To elucidate effect of immobilization on biomechanics and morphology of lateral collateral ligaments(LCL) on the knee of rabbits.【Methods】Fifteen New Zealand white rabbits were divided into three groups:Group I-10 rabbits were immobilized for four weeks;GroupⅡ-same 10 rabbits served as contralateral control;Group Ⅲ-5 rabbits were selected as age matched normal control.The right hindlimb of each experimental rabbit was surgically immobilized in full flexion(170°)by thread pin-internal fixation.The biomechanical testing,histological and ultrastructural evaluation were carried out.【Results】Area of transverse section,maximal loading and energy absorption of LCL in Group I decreased as compared with those of other two groups.In addition,there was significant difference between the material constants X1 and X2 of Group I and those of other two groups (P<0.05).Histologically,after immobilization for four weeks,arrangement of collagen fibers of LCL in Group I was similar to that in normal control.The shape of fibroblasts showed not distinct alteration.The rupture mode of LCL was mainly avulsion fracture of fibular insertion sites.【Conclusion】Effects of immobilization for four weeks on biomechanics and morphology of LCL on rabbit knees were not obvious.
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Key words collateral ligament; immobilization; biomechanics; morphology
制动具有双重效应，一方面，制动作为一种治疗手段有助于减轻疼痛，有利于损伤组织愈合；另一方面，人们也逐渐认识到制动对关节的活动和功能产生不利影响。而制动对关节组织的实际生理效应才受到重视。韧带是关节外结缔组织成份之一，因其两端与骨连接构成骨-韧带-骨组合体，易于钳夹，在生物力学试验中具有优势。对膝周的交叉韧带、内侧副韧带已有一些研究，而对外侧副韧带的研究甚少。本文拟选择兔的外侧副韧带(lateral collateral ligamnent,LCL)作为研究对象，从生物力学，组织形态学方面研究制动对LCL的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 新西兰大白兔15只，兔龄3～5月，体重2.2～2.7 kg。随机分为3组。实验组10只，右后肢膝关节制动4周；对侧对照组10只，不制动；正常对照组5只，不作任何处理，只作年龄相匹配的正常对照。
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1.2 内固定制动方法[1] 术前在直径2.0 mm的克氏钢针一端制作螺纹，拧上螺帽备用。3%戊巴比妥钠(1 ml/kg体重)耳缘静脉注射麻醉。自右后肢胫骨上1/3处切开皮肤，显露胫骨，用骨钻在胫骨上从前至后钻一洞，将克氏钢针从洞中穿出并经皮肤皱折抵达股骨外侧面皮下，切小口伸出钢针，将钢针弯成钩套在股骨上并充分屈曲膝关节，通过螺帽调节屈曲角度使膝固定于屈曲170°位。左后肢不作处理，作对侧对照组。
1.3 肉眼观察 将兔放出笼外观察行走时右后肢负重情况及伤口有无感染。切取标本时观察膝关节及韧带的颜色、质地、有无粘连和组织萎缩。
1.4 形态学观察 麻醉下取外侧副韧带及其止点骨块，骨块脱钙，按组织学常规切片，HE和VG染色法染色。电镜标本将韧带切成约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，3%戊二醛液固定，0.1 M磷酸缓冲液漂洗，锇酸后固定，丙酮脱水，环氧树脂618包埋，LKB 4800型超薄切片机切出500～700
超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，JEM-1200 EX透射电镜下观察。, 百拇医药
1.5 生物力学试验 试验前将冷冻标本解冻，剥离除外侧副韧带外的所有软组织，获取完整的股骨-外侧副韧带-胫骨标本。用游标卡尺(测定精度为0.02 mm)测量LCL在无应力状态下的初始长度，共测3次，求平均值。LCL的横截面积参考Yamamoto等[2]的方法，使用软组织截面面积测微计测量。将试件固定在自制的夹具固定上，再把夹具固定在CSS-1102 C型电子万能试验机上，使韧带的纵轴与拉力线方向一致。试件与夹具浸泡在充满生理盐水溶液的恒温水箱中，先进行预调，以5 mm/min的加载速率，在0～2%应变范围内对试件进行循环加、卸载，进行5次，此时加、卸载曲线趋于重叠，得出的实验数据基本稳定。预调结束后进行拉伸试验及断裂试验，结果由计算机自动记录并打印。
在软组织拉伸试验中，常采用Lagaranian应力。根据实验数据类型，推导出Lagaranian应力T为：
T=X1.E.X2.λ.EXP[X2(E2-E*2)]
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其中X1，X2是材料常数，E*是相应于某一选定的应力S*时的应变，E为应变，λ是伸长比。上式表示LCL的非线性本构方程。
2 结果
2.1 肉眼观察 制动4周兔行走跳跃时制动侧部分负重，股四头肌有轻度压痕，韧带外观尚正常或有轻度粘连。
2.2 生物力学试验 ①制动后LCL初长及横截面积的变化 制动4周：LCL初长值(15.94 mm)较对侧对照(16.57 mm)及正常对照组(16.80 mm)略短，但三者无显著性差异(P>0.05)；LCL横截面积实验组为1.97 mm2，对侧对照组为2.42 mm2，正常对照组为2.47 mm2，三者亦无显著性差异。②制动后LCL结构特性和材料特性的变化：实验组最大负荷和能量吸收减少，能量吸引与正常对照组比较差异有显著性(P<0.05)。实验组最大应力降低，最大应变变小，弹性模量变化不明显，与对侧对照和正常对照组差异不显著(P>0.05，见表1)。
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表1 制动对LCL结构特性和材料特性的影响(
±s) 组别n
最大负荷
(N)
能量吸收
(N.MM)
最大应力
(MPa)
最大应变
(%)
弹性量模
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(MPa)
实验组
8
39.42±
14.17
103.73±
31.94*
20.29±
8.06
22.53±
2.18
81.46±
, 百拇医药 19.16
对侧对照组
8
65.55±
15.11
176.55±
41.40
27.93±
9.18
32.83±
2.30
84.39±
23.66
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正常对照组
8
68.08±
21.69
185.55±
17.66
27.46±
12.01
31.75±
2.33
82.01±
10.26
*与正常组比较：P<0.05
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LCL的材料常数X2值与对侧对照和正常对照组比较有显著差异(P<0.05，见表2)。③制动后LCL应力-应变曲线的变化：制动4周，LCL应力-应变曲线与对侧对照组和正常组接近。④制动后LCL的断裂方式：制动4周后韧带骨组合体断裂方式80%为腓骨小头撕脱骨折，20%为股骨起点断裂。
表2 LCL的材料常数(无量纲) 组 别
X1
X2
实验组
1.5917±0.1586
15.8523±4.86251)2)
对侧对照组
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1.4479±0.1572
31.2048±4.7394
正常对照组
1.4408±0.1359
30.9621±3.4752
1)与对侧对照组比较：P<0.05；2)与正常组比较：P<0.05
2.3 光镜观察结果 制动4周，LCL胶原纤维的排列，韧带骨止点与正常对照LCL相似(封三图1)。
2.4 电镜观察结果 4周制动后胶原原纤维排列，成纤维细胞形状(封三图2)，细胞内细胞器均与正常对照类似。
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图1 制动4周LCL胶原纤维排列尚整齐 图2 制动4周LCL原纤维分布较均匀,结构清
(HE×100) 晰(TEM×25 000)
3 讨论
短期制动对兔LCL的初长和横截面积没有明显影响。其他作者的研究结果与此相似。Walsh等[3]发现制动1月兔内侧副韧带横截面积稍小于正常，而正常组稍小于对侧，但没有统计学的显著性差异。最大负荷和能量吸收反映骨-韧带-骨组合体的整体抗张特性。4周制动，LCL最大负荷和能量吸收减少，反映制动影响韧带-骨组合体的抗张能力，韧带的能量储备也降低。Tipton等[4]报道将狗膝关节固定6周骨-韧带组合体的最大负荷减少37%。韧带-骨组合体结构特性的变化与韧带骨止点的改变有关。
制动除影响韧带的结构特性外，也影响韧带的材料特性。制动4周，最大应力、弹性模量降低。Bindley等[5]报道大鼠制动韧带的最大应力减少64.2%。韧带物质的材料常数正引起重视，在软组织生物力学试验中，有些作者导出组织的本构方程，据此求出组织的材料常数[6]。本文根据实验数据，推导出LCL的非线性本构方程，显示制动对材料常数X1、X2有明显影响。韧带材料特性的改变，与韧带胶原的代谢变化有关。Amiel等[7]显示兔膝关节制动，内侧副韧带胶原合成和降解都增加。
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本实验结果显示，LCL对侧对照组和正常对照组生物力学指标之间存在差异，提示对侧对照不能代替正常对照，这种差异与制动后对侧的负重和动物全身状态改变有关。Walsh等[3]也观察到对侧韧带与年龄相匹配的正常动物的不同。在本试验中，韧带试件浸泡在37 ℃的生理盐水溶液中，接近活体状态，所得出的结果类似于正常生理状态。以往进行软组织生物力学试验时，为防止试件失水，通常采用棉签将试件浸湿的方法[8]，这增加了操作步骤，能否完全防失水也不能确定。将整个试件浸入特制的双层有机玻璃水箱中，其内充满生理盐水溶液，使韧带不失水并保持等渗状态。结果显示，制动4周后尽管生物力学指标已有改变，但并不特别明显，故在临床使用制动时，制动期的选择最好不要超过4周，此时，韧带等关节周围结缔组织的改变较轻微，组织恢复的可能性较大。
参考文献
1 Newton PO,Woo SL,Mackenna DA,et al.Immobilization of the knee joint alters the
, http://www.100md.com
mechanical and ultrastructure properties of the rabbit anterior cruciate
ligament.J Orthop Res,1995,13:191～200
2 Yamamoto N,Hayashi K,Kuriyama H,et al.Mechanical properties of the rabbit patellar
tendon.J Biomech Eng,1992,114:332～337
3 Walsh S,Frank C,Shrive N,et al.Knee immobilization inhibits biomechanical
maturation of the rabbit medial collateral ligament.Clin Orthop,1993,297:253～261
, 百拇医药
4 Tipton CN,Matthes RD,Maynard IA,et al.The influence of physical activity on
ligament and tendons.Med Sci Sports,1975,7:165～175
5 Binkley JM,Peat M.The effect of immobilization on the ultrastructure and
mechanical properties of the medial collateral ligament of rats.Clin
Orthop,1986,203:301～308
6 成海平.脐带静脉的非线性本构关系.湖北医学院学报，1990，11：191～196
, 百拇医药
7 Amiel D,Akeson WH,Harwood FL,et al.Stress depression effect on metabolic turnover
of the medial collateral ligament collagen.Clin Orthop,1983,172:265～270
8 Woo SL,Newton PO,Machenna DQ,et al.A comparative evaluation of the mechanical
properties of the rabbit medial collateral and anterior cruciate ligaments.J
Biomech,1992,25:377～386
19981214 收稿, 百拇医药