急性白血病肿瘤抑制基因p53突变分析
作者：李晓雯 连建华 齐 华 宋国英
单位：河南医科大学细胞生物学与医学遗传学教研室(郑州 450052)
关键词：白血病，急性/诊断；白血病/病因学；细胞转化，肿瘤
河北医科大学学报990417
中图号 R733.74
为研究白血病中p53基因的突变情况,本文应用PCR-SSCP技术对57例急性白血病标本进行了检测。
1 材料与方法
1.1 研究对象和DNA制备:河南医科大学第一附属医院血液科、儿科、河南省人民医院血液科1996年10月～1997年6月初诊未化疗的急性白血病57例,其中急性淋巴细胞性白血病(ALL)26例,急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)31例;正常人22例。每个病例抽取其外周血1～5 ml或骨髓0.5～1 ml,肝素抗凝,常规方法制备DNA。
, 百拇医药
1.2 引物:p53基因第5、6、7、8外显子引物购自北京师范大学细胞调控国家重点实验室。
1.3 PCR-SSCP反应体系:总体积25 μl,10×PCR缓冲液2.5 μl,0.2 mol/L dNTP,上下游引物各25 pmol,模板DNA 0.5～1.0 μg,无菌双蒸水补足至总体积,混匀,反应体系先行97 ℃预变性6 min后,加入TaqDNA聚合酶1.5 U和50 μl石蜡油覆盖,进入循环:94 ℃ 60 s→55 ℃～60 ℃ 90 s→72 ℃ 60s,进行35个循环后,72 ℃延伸7 min终止反应。取5 μl扩增产物和等体积变性缓冲液(97 %甲酰胺、10 Mmedta、0.05%溴酚蓝)混匀后97 ℃热变性10 min,迅速取出置于冰上5 min,加样于8 %非变性聚丙酰胺凝胶(交联度49∶1),电压300 V,1×TBE,电泳至溴酚蓝接近凝胶下缘时结束电泳。对发现有SSCP改变的样本重复PCR-SSCP分析1～2次,以排除假阳性结果。
, 百拇医药
1.4 统计方法:基因突变的相关分析采用配对计数资料χ2检验。
2 结果
26例ALL中发现5例突变,突变率19.2 %(5/26):其中5、6、7外显子各1例,第8外显子2例;31例ANLL中发现5例突变,突变率16.1%(5/31),其中第6外显子2例,第5、7、8外显子各1例;22例正常人均未发生突变,见表1。
表1 p53基因突变SSCP分析结果 组 别
n
p53外显子突变例数
突变率(%)
5
6
, http://www.100md.com
7
8
对照组
22
0
0
0
0
0
ALL
26
1
1
1
, 百拇医药
2
19.2*
ANLL
31
1
2
1
1
16.1*
* P<0.05与对照组比较(χ2检验)3 讨论
大量研究表明,90%以上的p53基因突变发生在4个热点区[1],即第5、6、7、8外显子。因此,检测第5～8外显子的突变可基本测得p53基因的激活状况。本文应用PCR-SSCP技术对急性白血病p53基因第5、6、7、8外显子进行了突变分析,发现p53基因在ALL中突变率为19.2%、ANLL中为16.1%,统计学分析结果,与对照组比较均有显著性差异(P<0.05),但ALL组与ANLL组之间无显著性差异(P>0.05),远远高于一般基因的自发突变率(10-6～10-4),与文献中报道p53基因在白血病中的突变率(10 %～20 %)相符[2]。表明p53基因突变后失去抑癌能力,引起细胞生长失控和恶性转化,在白血病发生过程中起着重要作用。
, 百拇医药
参考文献
1.Hartmann A,Blaszyk H,Mcgovern RM,et al.p53 gene mutations inside and outside of exons 5～8:the patterns differ in breast and other cancer.Oncogen,1995,10(6):681
2.Baas I,Mulder JW,Offerhaus GJ.An evaluatuin of six antibodys for immunohistochemistry of mutant p53 gene produce in archival colorectal neoplasms.J Pathol,1994,172(1):5
(1999-03-31 收稿), http://www.100md.com
单位：河南医科大学细胞生物学与医学遗传学教研室(郑州 450052)
关键词：白血病，急性/诊断；白血病/病因学；细胞转化，肿瘤
河北医科大学学报990417
中图号 R733.74
为研究白血病中p53基因的突变情况,本文应用PCR-SSCP技术对57例急性白血病标本进行了检测。
1 材料与方法
1.1 研究对象和DNA制备:河南医科大学第一附属医院血液科、儿科、河南省人民医院血液科1996年10月～1997年6月初诊未化疗的急性白血病57例,其中急性淋巴细胞性白血病(ALL)26例,急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)31例;正常人22例。每个病例抽取其外周血1～5 ml或骨髓0.5～1 ml,肝素抗凝,常规方法制备DNA。
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1.2 引物:p53基因第5、6、7、8外显子引物购自北京师范大学细胞调控国家重点实验室。
1.3 PCR-SSCP反应体系:总体积25 μl,10×PCR缓冲液2.5 μl,0.2 mol/L dNTP,上下游引物各25 pmol,模板DNA 0.5～1.0 μg,无菌双蒸水补足至总体积,混匀,反应体系先行97 ℃预变性6 min后,加入TaqDNA聚合酶1.5 U和50 μl石蜡油覆盖,进入循环:94 ℃ 60 s→55 ℃～60 ℃ 90 s→72 ℃ 60s,进行35个循环后,72 ℃延伸7 min终止反应。取5 μl扩增产物和等体积变性缓冲液(97 %甲酰胺、10 Mmedta、0.05%溴酚蓝)混匀后97 ℃热变性10 min,迅速取出置于冰上5 min,加样于8 %非变性聚丙酰胺凝胶(交联度49∶1),电压300 V,1×TBE,电泳至溴酚蓝接近凝胶下缘时结束电泳。对发现有SSCP改变的样本重复PCR-SSCP分析1～2次,以排除假阳性结果。
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1.4 统计方法:基因突变的相关分析采用配对计数资料χ2检验。
2 结果
26例ALL中发现5例突变,突变率19.2 %(5/26):其中5、6、7外显子各1例,第8外显子2例;31例ANLL中发现5例突变,突变率16.1%(5/31),其中第6外显子2例,第5、7、8外显子各1例;22例正常人均未发生突变,见表1。
表1 p53基因突变SSCP分析结果 组 别
n
p53外显子突变例数
突变率(%)
5
6
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7
8
对照组
22
0
0
0
0
0
ALL
26
1
1
1
, 百拇医药
2
19.2*
ANLL
31
1
2
1
1
16.1*
* P<0.05与对照组比较(χ2检验)3 讨论
大量研究表明,90%以上的p53基因突变发生在4个热点区[1],即第5、6、7、8外显子。因此,检测第5～8外显子的突变可基本测得p53基因的激活状况。本文应用PCR-SSCP技术对急性白血病p53基因第5、6、7、8外显子进行了突变分析,发现p53基因在ALL中突变率为19.2%、ANLL中为16.1%,统计学分析结果,与对照组比较均有显著性差异(P<0.05),但ALL组与ANLL组之间无显著性差异(P>0.05),远远高于一般基因的自发突变率(10-6～10-4),与文献中报道p53基因在白血病中的突变率(10 %～20 %)相符[2]。表明p53基因突变后失去抑癌能力,引起细胞生长失控和恶性转化,在白血病发生过程中起着重要作用。
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参考文献
1.Hartmann A,Blaszyk H,Mcgovern RM,et al.p53 gene mutations inside and outside of exons 5～8:the patterns differ in breast and other cancer.Oncogen,1995,10(6):681
2.Baas I,Mulder JW,Offerhaus GJ.An evaluatuin of six antibodys for immunohistochemistry of mutant p53 gene produce in archival colorectal neoplasms.J Pathol,1994,172(1):5
(1999-03-31 收稿), http://www.100md.com