广西慢性肝病病人中TTV感染及致病性研究
作者：李国坚 吴继周 周元平 梁远 周桂英 罗光汉 单晓阳
单位：广西医科大学第一附属医院传染病科 南宁 530021
关键词：套式PCR；TTVDNA；慢性肝病
广西医科大学学报990419
摘要 目的：探讨TTV感染在广西慢性肝病病人中的致病作用。方法：用套式PCR对确诊的原发性肝癌、慢性肝病病人并以非肝病病人作为对照进行TTVDNA检测。结果：原发性肝癌病人、非甲-庚型肝炎病、慢性乙肝轻度、中度、重度、肝硬变、重症肝炎病人及对照组TTVNDA检出率分别为：20.45%(18/88)，9.09%(1/11)，8.33%(1/12)，5.88%(4/17)，9.09%(1/11)，20.0%(4/20)，11.11%(1/9)和8.89%(4/45)。经统计学分析，各组虽无统计学差别，但原发性肝癌组与肝硬变组阳性率接近，两组与其他组比较P值接近显著性水平(P=0.089)。结论：TTV感染及复制与慢性乙肝的病情轻、中、重度，重肝无明显相关，但与原发性肝癌及肝硬变呈低相关关系。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R512.6
A STUDY ON THE INFECTION AND THE PATHOGENICITY OF TT DNA VIRUS IN GUANGXI'S PATIENTS WITH CHRONIC LIVER DISEASES
Li Guojian,Wu Jizhou,Zhou Yuanping,et al
(The First Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective:TT DNA Virus (TTV) is a novel hepatitis virus.The infection and the pathogenicity of TTV in patients with chronic liver diseases and control (non-liver diseases and non-tumor diseases) in Guangxi was investigated.Methods:TTVDNA in sera of patients with hepatocellular carcinoma (HCC),patients with chronic liver diseases and control were detected by Nest- PCR technique.Results:The positive rates of TTVDNA in sera in patients with HCC,non-A-G virus hepatitis,chronic hepatitis B (light degree,medium degree,heavy degree,cirrhosis,hepatic failure) and control were 20.45%(18/88),9.09%(1/11),8.33%(1/12),5.88%(1/17),9.09%(1/11),20.0%(4/20),11.11%9(1/9) and 8.89%(4/45) respectively.There is no significant deferent in statistic,but the positive rate of TTVDNA in HCC and cirrhosis groups is quite nearly,and higher than that of other groups (P=0.089).Conclusion:A low relevant seems to be seen between infection,replication of TTV and HCC as well as cirrhosis except in the other chronic liver disease groups.
, 百拇医药
Key words Nest-PCR;TTVDNA;chronic liver diseases
虽然Choo[1]于1989年建立起了丙型肝炎病毒(HCV)的特异性诊断方法,从而减少了输血后肝炎发生，但仍有不明原因的非A、B、C输血后肝炎发生。即使1995年Kim等[2]克隆成功了庚型肝炎病毒(HGV)，但进一步研究发现，HGV并非上述不明原因肝炎的主要致病因子。因此，日本学者Nishizawa应用代表性差异分析法(RDA)在输血后不明原因肝炎病人血清中研究发现了新型肝炎病毒TTV[3]。广西是我国肝炎高发区，目前尚无有关研究报道。本文对广西各种慢性肝病中的TTV感染情况进行初步研究，并探讨TTV的致病作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象：全部研究对象为1998年7～10月在我院及肿瘤医院住院的慢性肝病病人。各种慢性肝病的诊断按全国的诊断标准进行诊断[4]。研究对象中，经病理诊断的原发性肝癌病人88例，其中男67例，女21例，年龄19～62岁，平均38.9岁。其他慢性肝病病人80例，其中男63例，女17例，年龄19～63岁，平均38.7岁。慢性肝病中非甲-肝炎病人11例。慢性乙肝轻度12例，慢性乙肝中度17例，慢性乙肝重度11例，肝炎肝硬变20例，慢性重症肝炎9例，并以非肝病、非肿瘤的其他病人作为对照45例。对照组中男37例,女8例,年龄17～65岁,平均37.6岁。
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1.2 检测内容及方法
1.2.1 检测内容：检测研究对象外周血血清中的TTVDNA。
1.2.2 检测方法：采取研究对象外周血5 ml分离出血清，低温(-20℃)保存备测。TTVDNA应用RT-PCR方法进行检测。引物由中医科大第三附院根据Okamoto等[5]报道设计。PCR程度为：①模板制备:于0.5 ml离心管中加入裂解液5.5 μl和待测标本50 μl进行裂解。裂解程序为:55℃30 min，97℃15 min，将温度降至4℃后取出，12 000 r/min离心5 min，取上清液作为第一轮PCR模板；②第一轮PCR:取第一轮PCR反应液15 μl和模板5 μl加入到0.5 ml离心管中，加1滴石蜡油覆盖，上PCR仪进行扩增。循环参数为94℃40s，55℃40s，72℃1 min。扩增35个循环，72℃7 min延长；③第二轮PCR：取第二轮PCR反应液17 μl和第一轮PCR扩增产物3 μl放入0.5 ml离心管中，再加一滴石蜡油覆盖，上PCR仪进行第二轮扩增。循环参数为：94℃30s，55℃40s，72℃50s，扩增30个循环，72℃7 min延长；④结果判断:PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在紫外线透射分析仪上进行观察，在272bp DNA带出现一条亮带即为阳性。
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1.2.3 统计学分析法：采用华西医科大学卫生统计教研室设计的PEMS软件包中的计资料比较的四格表精确概率法，在电脑上进行运算。
2 结 果
经RT-PCR检测各组病人TTVDNA阳性情况见表1，经统计学分析，各组间虽无显著性差别，但原发性肝癌组以及肝硬变组的TTVDNA阳性率高于慢性肝炎各组及对照组，P值接近显著性水平(P=0.089)。
表1 各组TTVDNA检出情况比较 组 别
n
阳性数
阳性率
(%)
P
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原发性肝癌
88
18
20.45
0.137 5
非甲-庚型肝炎
11
1
9.09
1.000 0
慢性乙型肝炎
69
8
, 百拇医药
11.59
0.761 3
轻度
12
1
8.33
1.000 0
中度
17
1
5.88
1.000 0
重度
, 百拇医药
11
1
9.09
1.000 0
肝硬变
20
4
20.00
0.237 6
重症肝炎
9
1
11.11
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1.000 0
对照
45
4
8.89
3 讨 论
国内外许多研究结果表明HBV、HCV感染与原发性肝癌(HCC)发生关系密切，但不同国家和地区HBV、HCV作用大小不同。TTV刚发现不久，Okamoto等[5]对日本各型肝病患者，暴露于血及血制品的高危人群及供血员进行了TTVDNA检测，结果非甲-庚慢性肝病患者血清中检出率为46%(4/90),非甲-庚暴发型肝炎为47%(9/19),慢性乙肝为47%(15/32)，肝硬变为48%(19/40)，肝细胞癌为39%(7/18)。本研究结果发现，原发性肝癌病人阳性率比非甲-庚肝炎病人，慢性乙型肝炎病人都高，分别为20.45%(18/88)，9.09%(1/11)和11.59%(8/69)，P值接近显著性水平(P=0.089)。此结果提示TTV感染及复制与原发性肝癌的发生可能存在低相关关系，但目前尚难定论。而非甲-庚型肝炎病人中仅1例检测到TTVDNA，阳性率为9.09%(1/11),此病例为一慢性肝炎病人，过去并未接受过输血及血液制品。据此结果可推测，除了目前发现的甲-庚型肝炎病毒以及TTV外，还可能存在HFV[6]，甚至还有其他类型肝炎病毒存在，因为这些病例我们也已排除了CMV.EBV作用的可能性。从慢性乙型肝炎不同病情来看,TTV与HBV的重叠感染在肝炎肝硬变组阳性率达20.0%(4/20)，接近HCC组的TTVDNA阳性率。是否HBV和TTV的重叠感染易发生肝硬化，并在此基础上易发生原发性肝癌值得深入研究。本研究未发现TTV感染与慢性乙肝的病情轻重有明显相关关系，也未见慢性乙肝病人组与对照组阳性率有明显差别。因此，TTV的流行性虽呈世界性的[7,8],但其致病性仍不很清楚。由于至今有关TTV的研究报道还不很多，同时，各报道的病例数都不太多。因此，目前全世界的分布尚不清楚，其致病性还有待深入进行研究。
, 百拇医药
参考文献
1 Choo QL,Kuo G,Weiner AJ，et al.Isolation of cDNA from a blood-borne non-A,non-B hepatitis genome.Science,1989,244:359
2 Alter HJ,Bredley DW.Non-A,non-B hepatitis unrelated to the hepatitis C virvs (non A,B,C).Semin Liver Dis,1995,15:110
3 Nishizawa T,Okamoto H,Konishi K,et al.A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transminase level in posttransfusion hepatitis of unknown etiology.Biochem Biophy Res Commun,1997,241(1):92
, 百拇医药
4 中华医学会传染病寄生虫病学会修订.病毒性肝炎防治方案(试行).中华传染病杂志,1995，13(4)：241
5 Okamoto H,Nishizawa T,Taton,et al.Molecular cloning characterisation of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etology.Hepatol Res,1998,10:1
6 聂青和，李梦东，胡大荣.己型、庚型及其他新型肝炎病毒研究概况.国外医学流行病传染病分册，1997，24(1)：19
7 Naoumov NV,Pefrova E,Thomos MG,et al.Presence of newly described human DNA virus (TTV) in patients with liver disease.Lancet,1998,352(9123):195
8 Simmonds P,Davidson F,Lycettc,et al.Detection of a novel DNA virus (TTV) in blood donors and blood products.Lancet,1998,352(9123):191
收稿日期：1998-12-28, 百拇医药
单位：广西医科大学第一附属医院传染病科 南宁 530021
关键词：套式PCR；TTVDNA；慢性肝病
广西医科大学学报990419
摘要 目的：探讨TTV感染在广西慢性肝病病人中的致病作用。方法：用套式PCR对确诊的原发性肝癌、慢性肝病病人并以非肝病病人作为对照进行TTVDNA检测。结果：原发性肝癌病人、非甲-庚型肝炎病、慢性乙肝轻度、中度、重度、肝硬变、重症肝炎病人及对照组TTVNDA检出率分别为：20.45%(18/88)，9.09%(1/11)，8.33%(1/12)，5.88%(4/17)，9.09%(1/11)，20.0%(4/20)，11.11%(1/9)和8.89%(4/45)。经统计学分析，各组虽无统计学差别，但原发性肝癌组与肝硬变组阳性率接近，两组与其他组比较P值接近显著性水平(P=0.089)。结论：TTV感染及复制与慢性乙肝的病情轻、中、重度，重肝无明显相关，但与原发性肝癌及肝硬变呈低相关关系。
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中国图书资料分类法分类号 R512.6
A STUDY ON THE INFECTION AND THE PATHOGENICITY OF TT DNA VIRUS IN GUANGXI'S PATIENTS WITH CHRONIC LIVER DISEASES
Li Guojian,Wu Jizhou,Zhou Yuanping,et al
(The First Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective:TT DNA Virus (TTV) is a novel hepatitis virus.The infection and the pathogenicity of TTV in patients with chronic liver diseases and control (non-liver diseases and non-tumor diseases) in Guangxi was investigated.Methods:TTVDNA in sera of patients with hepatocellular carcinoma (HCC),patients with chronic liver diseases and control were detected by Nest- PCR technique.Results:The positive rates of TTVDNA in sera in patients with HCC,non-A-G virus hepatitis,chronic hepatitis B (light degree,medium degree,heavy degree,cirrhosis,hepatic failure) and control were 20.45%(18/88),9.09%(1/11),8.33%(1/12),5.88%(1/17),9.09%(1/11),20.0%(4/20),11.11%9(1/9) and 8.89%(4/45) respectively.There is no significant deferent in statistic,but the positive rate of TTVDNA in HCC and cirrhosis groups is quite nearly,and higher than that of other groups (P=0.089).Conclusion:A low relevant seems to be seen between infection,replication of TTV and HCC as well as cirrhosis except in the other chronic liver disease groups.
, 百拇医药
Key words Nest-PCR;TTVDNA;chronic liver diseases
虽然Choo[1]于1989年建立起了丙型肝炎病毒(HCV)的特异性诊断方法,从而减少了输血后肝炎发生，但仍有不明原因的非A、B、C输血后肝炎发生。即使1995年Kim等[2]克隆成功了庚型肝炎病毒(HGV)，但进一步研究发现，HGV并非上述不明原因肝炎的主要致病因子。因此，日本学者Nishizawa应用代表性差异分析法(RDA)在输血后不明原因肝炎病人血清中研究发现了新型肝炎病毒TTV[3]。广西是我国肝炎高发区，目前尚无有关研究报道。本文对广西各种慢性肝病中的TTV感染情况进行初步研究，并探讨TTV的致病作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象：全部研究对象为1998年7～10月在我院及肿瘤医院住院的慢性肝病病人。各种慢性肝病的诊断按全国的诊断标准进行诊断[4]。研究对象中，经病理诊断的原发性肝癌病人88例，其中男67例，女21例，年龄19～62岁，平均38.9岁。其他慢性肝病病人80例，其中男63例，女17例，年龄19～63岁，平均38.7岁。慢性肝病中非甲-肝炎病人11例。慢性乙肝轻度12例，慢性乙肝中度17例，慢性乙肝重度11例，肝炎肝硬变20例，慢性重症肝炎9例，并以非肝病、非肿瘤的其他病人作为对照45例。对照组中男37例,女8例,年龄17～65岁,平均37.6岁。
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1.2 检测内容及方法
1.2.1 检测内容：检测研究对象外周血血清中的TTVDNA。
1.2.2 检测方法：采取研究对象外周血5 ml分离出血清，低温(-20℃)保存备测。TTVDNA应用RT-PCR方法进行检测。引物由中医科大第三附院根据Okamoto等[5]报道设计。PCR程度为：①模板制备:于0.5 ml离心管中加入裂解液5.5 μl和待测标本50 μl进行裂解。裂解程序为:55℃30 min，97℃15 min，将温度降至4℃后取出，12 000 r/min离心5 min，取上清液作为第一轮PCR模板；②第一轮PCR:取第一轮PCR反应液15 μl和模板5 μl加入到0.5 ml离心管中，加1滴石蜡油覆盖，上PCR仪进行扩增。循环参数为94℃40s，55℃40s，72℃1 min。扩增35个循环，72℃7 min延长；③第二轮PCR：取第二轮PCR反应液17 μl和第一轮PCR扩增产物3 μl放入0.5 ml离心管中，再加一滴石蜡油覆盖，上PCR仪进行第二轮扩增。循环参数为：94℃30s，55℃40s，72℃50s，扩增30个循环，72℃7 min延长；④结果判断:PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在紫外线透射分析仪上进行观察，在272bp DNA带出现一条亮带即为阳性。
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1.2.3 统计学分析法：采用华西医科大学卫生统计教研室设计的PEMS软件包中的计资料比较的四格表精确概率法，在电脑上进行运算。
2 结 果
经RT-PCR检测各组病人TTVDNA阳性情况见表1，经统计学分析，各组间虽无显著性差别，但原发性肝癌组以及肝硬变组的TTVDNA阳性率高于慢性肝炎各组及对照组，P值接近显著性水平(P=0.089)。
表1 各组TTVDNA检出情况比较 组 别
n
阳性数
阳性率
(%)
P
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原发性肝癌
88
18
20.45
0.137 5
非甲-庚型肝炎
11
1
9.09
1.000 0
慢性乙型肝炎
69
8
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11.59
0.761 3
轻度
12
1
8.33
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中度
17
1
5.88
1.000 0
重度
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11
1
9.09
1.000 0
肝硬变
20
4
20.00
0.237 6
重症肝炎
9
1
11.11
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1.000 0
对照
45
4
8.89
3 讨 论
国内外许多研究结果表明HBV、HCV感染与原发性肝癌(HCC)发生关系密切，但不同国家和地区HBV、HCV作用大小不同。TTV刚发现不久，Okamoto等[5]对日本各型肝病患者，暴露于血及血制品的高危人群及供血员进行了TTVDNA检测，结果非甲-庚慢性肝病患者血清中检出率为46%(4/90),非甲-庚暴发型肝炎为47%(9/19),慢性乙肝为47%(15/32)，肝硬变为48%(19/40)，肝细胞癌为39%(7/18)。本研究结果发现，原发性肝癌病人阳性率比非甲-庚肝炎病人，慢性乙型肝炎病人都高，分别为20.45%(18/88)，9.09%(1/11)和11.59%(8/69)，P值接近显著性水平(P=0.089)。此结果提示TTV感染及复制与原发性肝癌的发生可能存在低相关关系，但目前尚难定论。而非甲-庚型肝炎病人中仅1例检测到TTVDNA，阳性率为9.09%(1/11),此病例为一慢性肝炎病人，过去并未接受过输血及血液制品。据此结果可推测，除了目前发现的甲-庚型肝炎病毒以及TTV外，还可能存在HFV[6]，甚至还有其他类型肝炎病毒存在，因为这些病例我们也已排除了CMV.EBV作用的可能性。从慢性乙型肝炎不同病情来看,TTV与HBV的重叠感染在肝炎肝硬变组阳性率达20.0%(4/20)，接近HCC组的TTVDNA阳性率。是否HBV和TTV的重叠感染易发生肝硬化，并在此基础上易发生原发性肝癌值得深入研究。本研究未发现TTV感染与慢性乙肝的病情轻重有明显相关关系，也未见慢性乙肝病人组与对照组阳性率有明显差别。因此，TTV的流行性虽呈世界性的[7,8],但其致病性仍不很清楚。由于至今有关TTV的研究报道还不很多，同时，各报道的病例数都不太多。因此，目前全世界的分布尚不清楚，其致病性还有待深入进行研究。
, 百拇医药
参考文献
1 Choo QL,Kuo G,Weiner AJ，et al.Isolation of cDNA from a blood-borne non-A,non-B hepatitis genome.Science,1989,244:359
2 Alter HJ,Bredley DW.Non-A,non-B hepatitis unrelated to the hepatitis C virvs (non A,B,C).Semin Liver Dis,1995,15:110
3 Nishizawa T,Okamoto H,Konishi K,et al.A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transminase level in posttransfusion hepatitis of unknown etiology.Biochem Biophy Res Commun,1997,241(1):92
, 百拇医药
4 中华医学会传染病寄生虫病学会修订.病毒性肝炎防治方案(试行).中华传染病杂志,1995，13(4)：241
5 Okamoto H,Nishizawa T,Taton,et al.Molecular cloning characterisation of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etology.Hepatol Res,1998,10:1
6 聂青和，李梦东，胡大荣.己型、庚型及其他新型肝炎病毒研究概况.国外医学流行病传染病分册，1997，24(1)：19
7 Naoumov NV,Pefrova E,Thomos MG,et al.Presence of newly described human DNA virus (TTV) in patients with liver disease.Lancet,1998,352(9123):195
8 Simmonds P,Davidson F,Lycettc,et al.Detection of a novel DNA virus (TTV) in blood donors and blood products.Lancet,1998,352(9123):191
收稿日期：1998-12-28, 百拇医药