脐血红系祖细胞及其生长刺激因子的比较观察
作者：朱洪 罗惠琪
单位：朱洪(华西医科大学附一院 成都 610044)；罗惠琪(四川省医学科学院 成都 610031)
关键词：脐血；红系祖细胞；生长刺激因子
川北医学院学报990402摘要 本文采用细胞集落培养技术，对照研究40例脐血的红系祖细胞(BFU-E)和红细胞生成素(EPO)爆式集落促进活性(BPA)。结果显示，在不加用EPO、BPA而仅加脐血集落刺激因子(CB-CSF)的培养体系中，同样可生成BFU-E，而且富含EPO、BPA等红系集落刺激因子。
文章编号：1005-3697(1999)04-0003-02中图分类号：R331.1 文献标识码：A
近10多年来，国内外对人类脐血的研究证明，含有多能造血干细胞和各种类型定向造血祖细胞，以及丰富的多种造血集落刺激因子(CSF)，如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)、红细胞生成素(EPO)等。本文采用细胞集落培养技术，对照观察证明人脐血富含红系祖细胞(BFU-E)和红细胞集落生长刺激因子、Epo、BPA(爆式集落促进活性)造血活性的实验观察，结果如下：
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 脐血的采集和单个核细胞(MNC)的分离同前文[1]。
1.2 AB型血清的制备
取自不抗凝AB型的正常成人静脉血，待在室温下自然沉淀，分离出血清。冰箱内冷冻8h，再经37℃溶解，除去冷凝蛋白，56℃、30min灭活分装，置-20℃冰箱内备用。
1.3 脐血集落刺激因子(CB-CSF)的制备
采取不抗凝的脐血，以人工手段为主，经过提取过滤过程，制成混合性CB-CSF，分装后置-20℃低温冰箱备用。
1.4 BFU-E体外培养
根据G regory[2]甲基纤维素法并加以改良，按需要分为实验组和对照组。
, 百拇医药
对照组：共20例脐血。每ml培养体系内含MNC2×105个和适量AB型血清、Epo(AMGBI Thousand Oaks U.S.A)、BPA(重庆医科大学惠赠)、谷氨酰胺、α-巯基乙醇、RPMIMEIUM 1640(美国GIBCO公司)，最后加甲基纤维素(4000CPS，美国)。取上述培养体系分别注入10mm的6个平皿中，每平皿0.5ml。
实验组：共20例脐血。在培养体系内除不加Epo和BPA外，另加入适量CB-CSF，其余与对照组相同。
取上述两组的培养皿，置入5%CO2、37℃饱和湿度的CO2培养箱中，培养14天观察结果。
2 结 果
2.1 观察方法与标准
将培养14天的培养皿、在恒温倒置显微镜下计数每只培养皿内的BFU-E集落数，每份标本计数4～6只培养皿、取其平均值作为结果。
, 百拇医药
细胞集落的判断标准：以≥50个细胞为一细胞团者。
2.2 观察结果，见表1。
表1 脐血BFU-E实验组和对照组的产率比较 组别
性
别
胎龄
例数
集落均值
(2×105MNC)
男
女
(周)
, 百拇医药
实验组
7
13
37～41
20
187.22±205.05
(29.50～795.33)
对照组
8
12
37～41
20
155.08±228.05
, 百拇医药
(10～759)
从表1看出，在不加用Epo和BPA而仅加CB-CSF的培养体系中，同样可生成BFU-E，且BFU-E的集落均值实验组(187.22)还高于对照组(155.08)，本实验说明脐血中不仅含有大量的BFU-E，而且含有丰富的Epo和BPA等红系集落刺激因子。两组的集落均值经统计学处理，P>0.05，没有显著性差异。
3 讨 论
关于人类脐血BFU-E生长刺激因子-Epo和BPA造血活性的实验观察，至今国内少有报道[3]。文献指出[4]CFU-E和BFU-E的增殖分化都受Epo调控的，或仅与培养体系中Epo的浓度有关，进一步研究指出，对BFU-E和CFU-E起调控作用的是两类性质不同的集落刺激因子。在红系祖细胞的体外培养研究中，Epo是一个不可缺少的刺激因子，但在正常生理条件下，Epo水平并不直接影响造血干细胞分化，而且EPO也不是直接调控BFU-E增殖的因子。所以，以红系集落刺激因子的研究中，除早已知道Epo外，还存在由巨噬细胞、单核细胞和T细胞分泌产生的BPA增殖因子进行调控。故Epo与BPA同时存在时才有可能生成爆增型红系细胞集落。
, 百拇医药
Hassan等[5]在含有Epo的0-4μ/ml培养基中，按106细胞/ml培养成人外周血和脐血，培养7天脐血先后出现集落200/0.1ml，成人外周血则未出现集落；培养14天脐血集落为 125/0.1ml，成人外周血集落为100/0.1ml，未加EPO则无集落形成。但Tchermia[6]发现无Epo的CFU-E培养体系中可形成CFU-E，测出脐血Epo浓度为0.019～0.125μ/ml。本文在加与不加Epo和BPA的两组对照实验中，表明在人类脐血中不加Epo与BPA的培养体系，实验组生成与对照组同样的的BFU-E，且实验组的集落均值还高于对照组，但P>0.05，没有显著性差异。我们的实验结果显然支持后者的论点，证明人类脐血中含有丰富的Epo和BPA增殖因子，对BFU-E进行调控，因为只有Epo和BPA同时存在时方能生成BFU-E。
国内外大量研究发现，人类脐血中含有丰富的多种造血集落刺激因子，同时富含各系造血干/祖细胞，是成人外周血的10倍[7]。本文实验结果亦表明，人脐血中富含红系祖细胞和Epo、BPA造血增殖因子。因此，加强对人类脐血中各种刺激因子定性、定量的基础研究和临床试用，很有必要。
, 百拇医药
参考文献
1 罗惠琪，等.人脐带血前红系祖细胞(BFU-E)体外培养的实验研究.泸州医学院学报，1993；16(3)
2 Gregory GJ & Eaves AC.Human marrow cells capable of erythropoiettic differentiation in vitro:Definition of three erythroid colony responses,Blood,1977(49)：855
3 隋星卫，等.人类脐带血中红系、粒系、粒——单系及成纤维细胞系祖细胞的体外培养.中华血液学杂志，1993；14：301
4 吴祖泽.造血干细胞移植基础.北京：人民卫生出版社，1988；83～86
5 Hassan MW,et al:In vitro culture of erythroid colonies from human fetal liver and umblilical cord blood,Br J Haematol 1979;41(4)：477
6 Tchernia G,et al:Characterization of circulating erythroid progenitor cells in human newborn blood,J Lab Clin Med,1981；97(3)：322
7 人脐血造血干/祖细胞移植的研究进展.国外医学输血及血液学分册，1998.21：219
收稿日期：1999-09-02, 百拇医药
单位：朱洪(华西医科大学附一院 成都 610044)；罗惠琪(四川省医学科学院 成都 610031)
关键词：脐血；红系祖细胞；生长刺激因子
川北医学院学报990402摘要 本文采用细胞集落培养技术，对照研究40例脐血的红系祖细胞(BFU-E)和红细胞生成素(EPO)爆式集落促进活性(BPA)。结果显示，在不加用EPO、BPA而仅加脐血集落刺激因子(CB-CSF)的培养体系中，同样可生成BFU-E，而且富含EPO、BPA等红系集落刺激因子。
文章编号：1005-3697(1999)04-0003-02中图分类号：R331.1 文献标识码：A
近10多年来，国内外对人类脐血的研究证明，含有多能造血干细胞和各种类型定向造血祖细胞，以及丰富的多种造血集落刺激因子(CSF)，如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)、红细胞生成素(EPO)等。本文采用细胞集落培养技术，对照观察证明人脐血富含红系祖细胞(BFU-E)和红细胞集落生长刺激因子、Epo、BPA(爆式集落促进活性)造血活性的实验观察，结果如下：
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 脐血的采集和单个核细胞(MNC)的分离同前文[1]。
1.2 AB型血清的制备
取自不抗凝AB型的正常成人静脉血，待在室温下自然沉淀，分离出血清。冰箱内冷冻8h，再经37℃溶解，除去冷凝蛋白，56℃、30min灭活分装，置-20℃冰箱内备用。
1.3 脐血集落刺激因子(CB-CSF)的制备
采取不抗凝的脐血，以人工手段为主，经过提取过滤过程，制成混合性CB-CSF，分装后置-20℃低温冰箱备用。
1.4 BFU-E体外培养
根据G regory[2]甲基纤维素法并加以改良，按需要分为实验组和对照组。
, 百拇医药
对照组：共20例脐血。每ml培养体系内含MNC2×105个和适量AB型血清、Epo(AMGBI Thousand Oaks U.S.A)、BPA(重庆医科大学惠赠)、谷氨酰胺、α-巯基乙醇、RPMIMEIUM 1640(美国GIBCO公司)，最后加甲基纤维素(4000CPS，美国)。取上述培养体系分别注入10mm的6个平皿中，每平皿0.5ml。
实验组：共20例脐血。在培养体系内除不加Epo和BPA外，另加入适量CB-CSF，其余与对照组相同。
取上述两组的培养皿，置入5%CO2、37℃饱和湿度的CO2培养箱中，培养14天观察结果。
2 结 果
2.1 观察方法与标准
将培养14天的培养皿、在恒温倒置显微镜下计数每只培养皿内的BFU-E集落数，每份标本计数4～6只培养皿、取其平均值作为结果。
, 百拇医药
细胞集落的判断标准：以≥50个细胞为一细胞团者。
2.2 观察结果，见表1。
表1 脐血BFU-E实验组和对照组的产率比较 组别
性
别
胎龄
例数
集落均值
(2×105MNC)
男
女
(周)
, 百拇医药
实验组
7
13
37～41
20
187.22±205.05
(29.50～795.33)
对照组
8
12
37～41
20
155.08±228.05
, 百拇医药
(10～759)
从表1看出，在不加用Epo和BPA而仅加CB-CSF的培养体系中，同样可生成BFU-E，且BFU-E的集落均值实验组(187.22)还高于对照组(155.08)，本实验说明脐血中不仅含有大量的BFU-E，而且含有丰富的Epo和BPA等红系集落刺激因子。两组的集落均值经统计学处理，P>0.05，没有显著性差异。
3 讨 论
关于人类脐血BFU-E生长刺激因子-Epo和BPA造血活性的实验观察，至今国内少有报道[3]。文献指出[4]CFU-E和BFU-E的增殖分化都受Epo调控的，或仅与培养体系中Epo的浓度有关，进一步研究指出，对BFU-E和CFU-E起调控作用的是两类性质不同的集落刺激因子。在红系祖细胞的体外培养研究中，Epo是一个不可缺少的刺激因子，但在正常生理条件下，Epo水平并不直接影响造血干细胞分化，而且EPO也不是直接调控BFU-E增殖的因子。所以，以红系集落刺激因子的研究中，除早已知道Epo外，还存在由巨噬细胞、单核细胞和T细胞分泌产生的BPA增殖因子进行调控。故Epo与BPA同时存在时才有可能生成爆增型红系细胞集落。
, 百拇医药
Hassan等[5]在含有Epo的0-4μ/ml培养基中，按106细胞/ml培养成人外周血和脐血，培养7天脐血先后出现集落200/0.1ml，成人外周血则未出现集落；培养14天脐血集落为 125/0.1ml，成人外周血集落为100/0.1ml，未加EPO则无集落形成。但Tchermia[6]发现无Epo的CFU-E培养体系中可形成CFU-E，测出脐血Epo浓度为0.019～0.125μ/ml。本文在加与不加Epo和BPA的两组对照实验中，表明在人类脐血中不加Epo与BPA的培养体系，实验组生成与对照组同样的的BFU-E，且实验组的集落均值还高于对照组，但P>0.05，没有显著性差异。我们的实验结果显然支持后者的论点，证明人类脐血中含有丰富的Epo和BPA增殖因子，对BFU-E进行调控，因为只有Epo和BPA同时存在时方能生成BFU-E。
国内外大量研究发现，人类脐血中含有丰富的多种造血集落刺激因子，同时富含各系造血干/祖细胞，是成人外周血的10倍[7]。本文实验结果亦表明，人脐血中富含红系祖细胞和Epo、BPA造血增殖因子。因此，加强对人类脐血中各种刺激因子定性、定量的基础研究和临床试用，很有必要。
, 百拇医药
参考文献
1 罗惠琪，等.人脐带血前红系祖细胞(BFU-E)体外培养的实验研究.泸州医学院学报，1993；16(3)
2 Gregory GJ & Eaves AC.Human marrow cells capable of erythropoiettic differentiation in vitro:Definition of three erythroid colony responses,Blood,1977(49)：855
3 隋星卫，等.人类脐带血中红系、粒系、粒——单系及成纤维细胞系祖细胞的体外培养.中华血液学杂志，1993；14：301
4 吴祖泽.造血干细胞移植基础.北京：人民卫生出版社，1988；83～86
5 Hassan MW,et al:In vitro culture of erythroid colonies from human fetal liver and umblilical cord blood,Br J Haematol 1979;41(4)：477
6 Tchernia G,et al:Characterization of circulating erythroid progenitor cells in human newborn blood,J Lab Clin Med,1981；97(3)：322
7 人脐血造血干/祖细胞移植的研究进展.国外医学输血及血液学分册，1998.21：219
收稿日期：1999-09-02, 百拇医药