复合PCR方法检测HCMV和CT的探讨
作者：刘 英 韩 莉 刘朝奇 宋利琼
单位：湖北三峡学院医学院免疫学教研室(宜昌 443003)
关键词：复合聚合酶链反应；人巨细胞病毒；沙眼衣原体
复合PCR方法检测HCMV和CT的探讨
摘 要 目的：应用聚合酶链反应(PCR)方法同时检测人巨细胞病毒(HCMV)和沙眼衣原体(CT)。方法：根据国外文献报道的HCMV和CT基因序列，利用计算机辅助设计并选出各一对寡核苷酸引物，扩增片段分别为370bp和510bp。结果：在370bp和510bp处出现扩增带者为HCMV和CT阳性。结论：PCR同时检测HCMV和CT快速、敏感、特异，有望应用于临床检测HCMV和CT的单独或混合感染。
Reseach of Compound PCRdetecting HCMV and CT
, 百拇医药
Liu Ying Han Li Liu Zhaoqi,et al
Department of immunology,Hubei Three GorgesUniversity Medical College,Yichang 443003
Abstract Objective:To insitute a quick and simple method of Polymerase Chain Reaction(PCR),which can measure HCMV and CT.Method:According to HCMV and CT gene orders that literatures reported,and with the computer we devise and choose out a pair of oligonucleotide primers,whose expanded fractions appear at 370bp and 510bp.Result:That DNA expanded areas appear at 370bp and 510bp is regarded as HCMV and CT positive reaction.Conclusion:The PCR technique measuring HCMV and CT are quick，sehsitive，specificand can be used as an early diagnostic method of HCMV and CT or one of them infection in clinic.
, 百拇医药
Key Words compound PCR;HCMV;CT
人巨细胞病毒和沙眼衣原体是引起女性泌尿生殖道感染的常见病原体。据文献报道，HCMV易侵袭胎儿，感染的发生率为0.5%～2.0%，造成胎儿中枢神经系统受损、出生缺陷等严重后果[1]。孕妇生殖道CT的感染率可达3%～25%，感染后易引起生殖道炎症、输卵管阻塞，导致不孕[2]。由于单重PCR检测HCMV、CT需分别操作，费力耗时，并且增加污染机会。本实验室采用HCMV和CT两对引物，建立一种复合PCR技术-HCMV/CT双重引物PCR，在反应体系中同时加入两对引物，一次反应可同时检出泌尿生殖系标本中存在的HCMV、CT单独或混合感染经过反复试验，最终筛选出一种最佳优化的复合技术，为女性泌尿生殖道感染提供了一种快速、敏感、特异的检测手段，报告如下。
1 材料
1.1 临床资料
, 百拇医药
87例门诊和住院宫颈炎和疑有宫颈癌患者，年龄20～65岁，平均39岁，拭取女性宫颈分泌物。
1.2 实验材料
1.2.1 病原体来源 HCMV AD169株(湖北医科大学病毒研究所提供)；CT培养物(湖北医科大学微生物室提供)。
1.2.2 PCR相关试剂 dNTPs(华美公司产品)；Taq酶(Promega公司产品)；PBR322/Hinf Ⅰ (Promega公司产品)；DNA提取液(华美公司产品)。
1.2.3 引物设计 据文献[3，4]的HCMV和CT基因序列，利用计算机辅助设计出各一对寡核苷酸引物，由上海生工生物工程公司合成。
HCMV引物 上游引物 5’GGGTG
, http://www.100md.com
CTGTCCTGCTATGTCTTA3’
下游引物 5’CATCACTCTGCTCA
CTTTCTTCC3’
CT引物 上游引物 5’GTTTAAG
TGTTCCCATCATAAAAACATATTC3’
下游引物 5’ATCCTTGTATCCTG
TTGGGAAGCCATCAAAG3’
1.2.4 PCR扩增仪(美国基因公司产品 型号PTC-150)
2 方法
2.1 拭子标本采集和处理
, 百拇医药
统一由临床医师用棉签从患者宫颈口擦取，拭子放入内含1～2ml无菌生理盐水的试管中立即送检。
实验室取到标本后立即旋转充分洗涤拭子后挤干，弃去棉球，将浸出液15000rpm离心15min，弃上清，在沉淀中加入50μlDNA提取液，吹打均匀后100℃沸水浴15min，立即放入冰块中10min，然后15000rpm离心10min，取上清做模板。
2.2 PCR扩增反应
在0.2ml管中加入下列各成分(50μl反应体系)
dNTP 1.2μl(200μmol/L)
10×反应缓冲液5μl
引物(HCMV∶CT
体积比=1∶2)1.5μl(50pmol/L)
, http://www.100md.com
NDA模板2μl(50ng)
MgCl28μl(25μmol/L)
DMSO1μl(0.2%)
去离子水29.3μl
上述诸液混匀后，离心15秒，使液体沉至管底。加石蜡油30μl左右于反应管表面，以防加温过程中液体蒸发影响反应体积。反应管方入PCR扩增仪中，93℃预变性3min，将2UTaq酶2μl加入以上反应体系中，再进行以下循环：94℃变性60秒，54℃退火80秒，72℃延伸80秒，共进行40个循环，最后72℃延伸5min。
2.3 电泳
取扩增产物10μl，加5μl上样缓冲液，1.5%琼脂糖凝胶电泳，TAE为电泳缓冲液，EB作染色剂，120V，电泳40min。以pBR322/HinfⅠ标准分子量作对照，并设立阴、阳性对照，在紫外透射仪上观察结果。
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3 结果
3.1 电泳结果
如图所示：A为pBR322/HinfⅠ标准分子量的条带，B为HCMV和CT阳性标本，在370bp位置处有一条亮带是HCMV阳性标本，510bp位置处有一亮带为CT阳性标本，C为阴性对照，D为阳性对照。
附图 复合PCR产物电泳结果
3.2 扩增的特异性
分别以HCMV DNA为模板做HCMV单重引物PCR和HCMV/CT双重引物PCR，结果均在370bp处有一带形；然后以CT DNA为模板分别做CT单重引物PCR和HCMV/CT双重引物PCR，结果均在510bp处有一带形。再分别以本室HPV DNA、奈瑟氏淋球菌DNA、解脲支原体DNA为模板进行HCMV/CT双重引物PCR，结果均无扩增带。
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3.3 扩增的敏感性
用去离子水分别将HCMV DNA和CT DNA做梯度稀释，使HCMV和CT DNA的含量从1ng/μl到0.001fg/μl，以之为模板，去离子水作阴性对照进行扩增，结果在扩增体系中HCMV和CT终点检出浓度分别为0.001fg/μl和0.01fg/μl。
4 讨论
目前，运用PCR技术单独检测HCMV或CT较为普遍，但是此方法既费时又耗材，检测时同一标本来源用不同试剂盒由于各种因素影响其准确性，不利于分析，且女性泌尿生殖道感染多为几种病原体混合感染，临床医师据患者症状和体征往往难以确定为何种病原体感染，单重PCR检测混合感染为患者增加了负担，难以推广。正是由于这些不足，我们探讨出用复合PCR方法对HCMV和CT进行双重检测，在同一反应体系中，同样条件下，排除了各种外界因素和人为的干扰，使检测结果更准确，有利于综合分析。节约了人力，物力，能更好地指导临床医师综合分析、治疗。临床中更易被患者接受，为女性泌尿生殖道感染和流行病学研究提供了一种快速、经济、敏感、特异的检测方法。
, 百拇医药
实验中我们采用以下手段克服了复合扩增中各引物之间、模板之间、引物与引物之间及引物与模板之间可能存在的竞争性抑制。①为保证两个目的片段同时扩增，增加了两对引物的浓度，摸索后发现HCMV、CT两对引物浓度分别为0.55μmol/L、0.6μmol/L时复合扩增效果最佳。据文献报道这种浓度比例形成原因可能和扩增产物的长短及引物A/T含量等有关[5～7]；②提高dNTP和Taq酶用量至200μmol/L和2μl(2U)；③为减少非特异性扩增，采用了热启动PCR技术，以消除引物错配和二聚体形成的任何机会[8]，在预变性后将Taq酶直接加入处于94℃的反应体系中；④反应体系中添加了PCR特异性增强剂DMSO，应用DMSO可减少二级结构形成，提高扩增的特异性[9]；⑤增加循环次数至40个。
采用本反应体系检测了87份标本，其中HCMV、CT单独感染分别为28例和24例，HCMV和CT混合感染为18例，另外17例无HCMV和CT感染。上述结果和用HCMV、CT诊断试剂盒(上海复星高科技集团有限公司生产)检测结果相同。
, http://www.100md.com
(本文承蒙张昌菊教授的指导，在此深表谢意。)
参考文献
1 田冬珍，王彬，雷莉，等.沙眼衣原体生殖道感染与输卵管病理形态变化.生殖医学杂志，1998；7(2)：84
2 丁瑛，顾惠珍，龚培娥，等.孕妇新生儿沙眼衣原体感染的临床观察.中华妇产科杂志，1995；30(3)：74
3 Julio C,et al.Bvaluation of PCR primers for early diagnesis of Cytomet agalovirus in seetion following liver transplantation.Journal of Clincal Microbiology，1998;36(2):526
4 Stella Mitrani-Rosenbaum,Rimona Tsvieli,Ofer lavie et al.Simultaneous detection of three common sexually transmitted agents by polymerase chain reaction.Am J Obstet Gynecol，1994:784
, http://www.100md.com
5 Frantamico PM,Sackitey SK,Wiedmann M,et al.Detection of Escheriachia Coli0157:H7 by multiplex PCR.J Clin Microbiol，1995；33：2188
6 Edward MC,Gibbs RA.Multiplex PCR:advantages,development,and applications.PCR Methods Appl,1994;3:565
7 Zazzi M,Romano L,Brasini A,et al.Simultaneous amplification of multiple HIV-1 DNA sequenees from clinical specimens by using nested-primer polymevase chain reaction.AIDS Res Hum Retroviruses,1993;9:315
8 肖文华.热启动PCR.国外医学.临床生物化学与检验学分册，1996；17(2)：68
9 Hung T,Mar K,Fong K.A specificity enhancer for PCR.Nucleic Acids Res,1990;18(16):4953
(1999-08-05 收稿), 百拇医药
单位：湖北三峡学院医学院免疫学教研室(宜昌 443003)
关键词：复合聚合酶链反应；人巨细胞病毒；沙眼衣原体
复合PCR方法检测HCMV和CT的探讨
摘 要 目的：应用聚合酶链反应(PCR)方法同时检测人巨细胞病毒(HCMV)和沙眼衣原体(CT)。方法：根据国外文献报道的HCMV和CT基因序列，利用计算机辅助设计并选出各一对寡核苷酸引物，扩增片段分别为370bp和510bp。结果：在370bp和510bp处出现扩增带者为HCMV和CT阳性。结论：PCR同时检测HCMV和CT快速、敏感、特异，有望应用于临床检测HCMV和CT的单独或混合感染。
Reseach of Compound PCRdetecting HCMV and CT
, 百拇医药
Liu Ying Han Li Liu Zhaoqi,et al
Department of immunology,Hubei Three GorgesUniversity Medical College,Yichang 443003
Abstract Objective:To insitute a quick and simple method of Polymerase Chain Reaction(PCR),which can measure HCMV and CT.Method:According to HCMV and CT gene orders that literatures reported,and with the computer we devise and choose out a pair of oligonucleotide primers,whose expanded fractions appear at 370bp and 510bp.Result:That DNA expanded areas appear at 370bp and 510bp is regarded as HCMV and CT positive reaction.Conclusion:The PCR technique measuring HCMV and CT are quick，sehsitive，specificand can be used as an early diagnostic method of HCMV and CT or one of them infection in clinic.
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Key Words compound PCR;HCMV;CT
人巨细胞病毒和沙眼衣原体是引起女性泌尿生殖道感染的常见病原体。据文献报道，HCMV易侵袭胎儿，感染的发生率为0.5%～2.0%，造成胎儿中枢神经系统受损、出生缺陷等严重后果[1]。孕妇生殖道CT的感染率可达3%～25%，感染后易引起生殖道炎症、输卵管阻塞，导致不孕[2]。由于单重PCR检测HCMV、CT需分别操作，费力耗时，并且增加污染机会。本实验室采用HCMV和CT两对引物，建立一种复合PCR技术-HCMV/CT双重引物PCR，在反应体系中同时加入两对引物，一次反应可同时检出泌尿生殖系标本中存在的HCMV、CT单独或混合感染经过反复试验，最终筛选出一种最佳优化的复合技术，为女性泌尿生殖道感染提供了一种快速、敏感、特异的检测手段，报告如下。
1 材料
1.1 临床资料
, 百拇医药
87例门诊和住院宫颈炎和疑有宫颈癌患者，年龄20～65岁，平均39岁，拭取女性宫颈分泌物。
1.2 实验材料
1.2.1 病原体来源 HCMV AD169株(湖北医科大学病毒研究所提供)；CT培养物(湖北医科大学微生物室提供)。
1.2.2 PCR相关试剂 dNTPs(华美公司产品)；Taq酶(Promega公司产品)；PBR322/Hinf Ⅰ (Promega公司产品)；DNA提取液(华美公司产品)。
1.2.3 引物设计 据文献[3，4]的HCMV和CT基因序列，利用计算机辅助设计出各一对寡核苷酸引物，由上海生工生物工程公司合成。
HCMV引物 上游引物 5’GGGTG
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CTGTCCTGCTATGTCTTA3’
下游引物 5’CATCACTCTGCTCA
CTTTCTTCC3’
CT引物 上游引物 5’GTTTAAG
TGTTCCCATCATAAAAACATATTC3’
下游引物 5’ATCCTTGTATCCTG
TTGGGAAGCCATCAAAG3’
1.2.4 PCR扩增仪(美国基因公司产品 型号PTC-150)
2 方法
2.1 拭子标本采集和处理
, 百拇医药
统一由临床医师用棉签从患者宫颈口擦取，拭子放入内含1～2ml无菌生理盐水的试管中立即送检。
实验室取到标本后立即旋转充分洗涤拭子后挤干，弃去棉球，将浸出液15000rpm离心15min，弃上清，在沉淀中加入50μlDNA提取液，吹打均匀后100℃沸水浴15min，立即放入冰块中10min，然后15000rpm离心10min，取上清做模板。
2.2 PCR扩增反应
在0.2ml管中加入下列各成分(50μl反应体系)
dNTP 1.2μl(200μmol/L)
10×反应缓冲液5μl
引物(HCMV∶CT
体积比=1∶2)1.5μl(50pmol/L)
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NDA模板2μl(50ng)
MgCl28μl(25μmol/L)
DMSO1μl(0.2%)
去离子水29.3μl
上述诸液混匀后，离心15秒，使液体沉至管底。加石蜡油30μl左右于反应管表面，以防加温过程中液体蒸发影响反应体积。反应管方入PCR扩增仪中，93℃预变性3min，将2UTaq酶2μl加入以上反应体系中，再进行以下循环：94℃变性60秒，54℃退火80秒，72℃延伸80秒，共进行40个循环，最后72℃延伸5min。
2.3 电泳
取扩增产物10μl，加5μl上样缓冲液，1.5%琼脂糖凝胶电泳，TAE为电泳缓冲液，EB作染色剂，120V，电泳40min。以pBR322/HinfⅠ标准分子量作对照，并设立阴、阳性对照，在紫外透射仪上观察结果。
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3 结果
3.1 电泳结果
如图所示：A为pBR322/HinfⅠ标准分子量的条带，B为HCMV和CT阳性标本，在370bp位置处有一条亮带是HCMV阳性标本，510bp位置处有一亮带为CT阳性标本，C为阴性对照，D为阳性对照。
附图 复合PCR产物电泳结果
3.2 扩增的特异性
分别以HCMV DNA为模板做HCMV单重引物PCR和HCMV/CT双重引物PCR，结果均在370bp处有一带形；然后以CT DNA为模板分别做CT单重引物PCR和HCMV/CT双重引物PCR，结果均在510bp处有一带形。再分别以本室HPV DNA、奈瑟氏淋球菌DNA、解脲支原体DNA为模板进行HCMV/CT双重引物PCR，结果均无扩增带。
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3.3 扩增的敏感性
用去离子水分别将HCMV DNA和CT DNA做梯度稀释，使HCMV和CT DNA的含量从1ng/μl到0.001fg/μl，以之为模板，去离子水作阴性对照进行扩增，结果在扩增体系中HCMV和CT终点检出浓度分别为0.001fg/μl和0.01fg/μl。
4 讨论
目前，运用PCR技术单独检测HCMV或CT较为普遍，但是此方法既费时又耗材，检测时同一标本来源用不同试剂盒由于各种因素影响其准确性，不利于分析，且女性泌尿生殖道感染多为几种病原体混合感染，临床医师据患者症状和体征往往难以确定为何种病原体感染，单重PCR检测混合感染为患者增加了负担，难以推广。正是由于这些不足，我们探讨出用复合PCR方法对HCMV和CT进行双重检测，在同一反应体系中，同样条件下，排除了各种外界因素和人为的干扰，使检测结果更准确，有利于综合分析。节约了人力，物力，能更好地指导临床医师综合分析、治疗。临床中更易被患者接受，为女性泌尿生殖道感染和流行病学研究提供了一种快速、经济、敏感、特异的检测方法。
, 百拇医药
实验中我们采用以下手段克服了复合扩增中各引物之间、模板之间、引物与引物之间及引物与模板之间可能存在的竞争性抑制。①为保证两个目的片段同时扩增，增加了两对引物的浓度，摸索后发现HCMV、CT两对引物浓度分别为0.55μmol/L、0.6μmol/L时复合扩增效果最佳。据文献报道这种浓度比例形成原因可能和扩增产物的长短及引物A/T含量等有关[5～7]；②提高dNTP和Taq酶用量至200μmol/L和2μl(2U)；③为减少非特异性扩增，采用了热启动PCR技术，以消除引物错配和二聚体形成的任何机会[8]，在预变性后将Taq酶直接加入处于94℃的反应体系中；④反应体系中添加了PCR特异性增强剂DMSO，应用DMSO可减少二级结构形成，提高扩增的特异性[9]；⑤增加循环次数至40个。
采用本反应体系检测了87份标本，其中HCMV、CT单独感染分别为28例和24例，HCMV和CT混合感染为18例，另外17例无HCMV和CT感染。上述结果和用HCMV、CT诊断试剂盒(上海复星高科技集团有限公司生产)检测结果相同。
, http://www.100md.com
(本文承蒙张昌菊教授的指导，在此深表谢意。)
参考文献
1 田冬珍，王彬，雷莉，等.沙眼衣原体生殖道感染与输卵管病理形态变化.生殖医学杂志，1998；7(2)：84
2 丁瑛，顾惠珍，龚培娥，等.孕妇新生儿沙眼衣原体感染的临床观察.中华妇产科杂志，1995；30(3)：74
3 Julio C,et al.Bvaluation of PCR primers for early diagnesis of Cytomet agalovirus in seetion following liver transplantation.Journal of Clincal Microbiology，1998;36(2):526
4 Stella Mitrani-Rosenbaum,Rimona Tsvieli,Ofer lavie et al.Simultaneous detection of three common sexually transmitted agents by polymerase chain reaction.Am J Obstet Gynecol，1994:784
, http://www.100md.com
5 Frantamico PM,Sackitey SK,Wiedmann M,et al.Detection of Escheriachia Coli0157:H7 by multiplex PCR.J Clin Microbiol，1995；33：2188
6 Edward MC,Gibbs RA.Multiplex PCR:advantages,development,and applications.PCR Methods Appl,1994;3:565
7 Zazzi M,Romano L,Brasini A,et al.Simultaneous amplification of multiple HIV-1 DNA sequenees from clinical specimens by using nested-primer polymevase chain reaction.AIDS Res Hum Retroviruses,1993;9:315
8 肖文华.热启动PCR.国外医学.临床生物化学与检验学分册，1996；17(2)：68
9 Hung T,Mar K,Fong K.A specificity enhancer for PCR.Nucleic Acids Res,1990;18(16):4953
(1999-08-05 收稿), 百拇医药