高效液相色谱法测定肉芽组织的羟脯氨酸
作者：刘放南 陈永明 顾 军 蔡晓敏
单位：南京军区南京总医院解放军普外研究所，南京 210002
关键词：肉芽组织；羟脯氨酸；高效液相色谱
肠外与肠内营养990411 中图分类号：R329 文献标识码：B 文章编号：1007-810X(1999)-04-0216-02*
1 引言
羟脯氨酸(hydroxyproline,缩写Hpro)为前胶原、胶原蛋白合成必需的前体氨基酸，外科腹腔感染病人肉芽组织中Hpro含量均明显下降，而导致局部前胶原及胶原蛋白合成抑制，影响了组织愈合能力。有研究表明[1]，临床感染病人使用了生长激素(growth hormone)后可提高肉芽组织中Hpro的含量，促进组织生长愈合。对外科腹腔感染病人常以监测肉芽组织内羟脯氨酸的含量，以调整生长激素的用药量。本研究应用异硫氰酸苯酯(PITC)为柱前衍生剂，参考了Cohen等[2]的方法，改进了流动相的梯度，具有分析时间短、灵敏度高的特点。
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2 实验方法
2.1 仪器 Waters高效液相色谱系统(包括486紫外检测仪、510双泵、PICO-TAG色谱工作站、PICO-TAG游离氨基酸分析柱)，北京东西电子色谱数据工作站。
2.2 试剂和流动相 羟脯氨酸标准品为BDH产品，PITC及三乙胺为Sigma产品，三水醋酸钠为分析纯，乙腈、甲醇均为色谱纯(江苏淮阴精细化工研究所)。
2.2.1 A缓冲液 9.54三水醋酸钠，溶于1 L水中，pH 6.5，取25 ml乙腈加入至975 ml上述溶液中，内含250 μl的10 mmol/L EDTA，充分混合脱气。
2.2.2 衍生试剂(需新鲜配制) 将PITC、甲醇、乙醇、三乙胺和水，按1∶6∶1∶1∶1体积比例配制。
2.2.3 样品稀释液 710 mg的Na2HPO4加高纯水溶至1 L，pH 7.4。
, 百拇医药
2.3 样品采取及处理 从液氮罐中取出肉芽组织，称取100 mg左右置碾钵中，倒入液氮，待组织冷冻坚硬后进行碾磨，粉碎后再加入液氮碾磨，如此反复进行3次。组织完全粉碎后，加0.2 ml样品稀释液，经超滤[3]后，取滤液10 μl注入0.5 cm×5 cm的玻璃样品小管中，经2次冷冻干燥后，再加20 μl衍生试剂，室温下衍生20 min，再经干燥后置冰箱保存。分析时，加50 μl样品稀释液涡旋搅拌，进样10 μl。
2.4 色谱条件 ①色谱柱：PICO-TAG柱(300 mm×3.9 mm id,5 μm,Waters公司)；②检测波长：UV 254 nm；③流速：1.0 ml/min;④柱温：46℃。分析梯度见表1。
表1 羟脯氨酸分析梯度表
Table 1 Election gradient of hydroxyproline 时间(min)
, 百拇医药
A%
B%
曲线号
初始
100
0
*
6.0
100
0
11
7.0
0
100
, 百拇医药
6
11.0
0
100
6
12.0
100
0
6
32.0
100
0
6
3 实验结果
, http://www.100md.com
3.1 Hpro的标准品及肉芽组织的色谱图 如图1、图2所示。
图1 Hpro标准品色谱图
Figure 1 Chromatography of Hpro standard
图2 肉芽组织Hpro色谱图
Figure 2 Chromatography of Hpro in granutation tissues
3.2 线性关系及检测限 准确配制浓度为6.250、3.125、1.563、0.781、0.156 mmol/L的羟脯氨酸标准品溶液，进行色谱分析，峰面积与浓度呈良好的线性关系y=277.44x-167,r=0.998 319,最低检测浓度为0.04 μmol/L。
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3.3 回收率及精密度
3.3.1 回收率 见表2。
表2 肉芽组织中Hpro回收率 (n=6)
Table 2 Hpro recovery rate in granulation tissues 肉芽中的含量
(μmol/L)
加标量
(μmol/L)
加标后测得量
(μmol/L)
回收率
(%)
, 百拇医药
平均回收率
(%)
0.20
1.56
1.72
97.23
0.11
0.78
0.94
105.62
99.53±5.42
0.05
0.16
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0.20
95.24
3.3.2 重复性实验 以25 μmol/L浓度的Hpro标准品重复进样5次，变异系数为4.99%。
4 讨论
PITC和氨基酸反应后产生的苯基硫代氨甲酰-氨基酸，结构稳定，在室温下放置数小时，低温下放置2周后分析都可以得到良好的结果[4]。因此，有利于临床上零散收集组织样品而集中进行检测。
衍生时，真空干燥需注意彻底除去过量试剂，否则进入分析柱，极易降低柱寿命。
肉芽组织采取时必需多于50 mg,才够碾磨及检测(肉芽组织为无神经组织，病人不至引起疼痛)。
作者简介：刘放南(1949-)，妇，江西人，主管技师，从事营养监测工作。
, 百拇医药
参考文献：
[1]Christensen H,Oxlund H.Growth hormone increases the colhagen deposition rats and breaking strength of left colonic anastomoses in rats[J].Surgery,1994,116(3):550.
[2]Cohen S,Bidingmeyer B,Tarvin T.PITC derivatives in amino acid analysis[J].Natuse,1986,320:769.
[3]刘放南，盛学勤，陈永明.高效液相色谱法测定超滤后血浆中的谷氨酰胺[J].生物化学与生物物理进展，1996，23(5)：475.
[4]梁冬生，常碧影.柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸[J].色谱，1993，11(3)：140.
* 收稿日期：199905-10, http://www.100md.com
单位：南京军区南京总医院解放军普外研究所，南京 210002
关键词：肉芽组织；羟脯氨酸；高效液相色谱
肠外与肠内营养990411 中图分类号：R329 文献标识码：B 文章编号：1007-810X(1999)-04-0216-02*
1 引言
羟脯氨酸(hydroxyproline,缩写Hpro)为前胶原、胶原蛋白合成必需的前体氨基酸，外科腹腔感染病人肉芽组织中Hpro含量均明显下降，而导致局部前胶原及胶原蛋白合成抑制，影响了组织愈合能力。有研究表明[1]，临床感染病人使用了生长激素(growth hormone)后可提高肉芽组织中Hpro的含量，促进组织生长愈合。对外科腹腔感染病人常以监测肉芽组织内羟脯氨酸的含量，以调整生长激素的用药量。本研究应用异硫氰酸苯酯(PITC)为柱前衍生剂，参考了Cohen等[2]的方法，改进了流动相的梯度，具有分析时间短、灵敏度高的特点。
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2 实验方法
2.1 仪器 Waters高效液相色谱系统(包括486紫外检测仪、510双泵、PICO-TAG色谱工作站、PICO-TAG游离氨基酸分析柱)，北京东西电子色谱数据工作站。
2.2 试剂和流动相 羟脯氨酸标准品为BDH产品，PITC及三乙胺为Sigma产品，三水醋酸钠为分析纯，乙腈、甲醇均为色谱纯(江苏淮阴精细化工研究所)。
2.2.1 A缓冲液 9.54三水醋酸钠，溶于1 L水中，pH 6.5，取25 ml乙腈加入至975 ml上述溶液中，内含250 μl的10 mmol/L EDTA，充分混合脱气。
2.2.2 衍生试剂(需新鲜配制) 将PITC、甲醇、乙醇、三乙胺和水，按1∶6∶1∶1∶1体积比例配制。
2.2.3 样品稀释液 710 mg的Na2HPO4加高纯水溶至1 L，pH 7.4。
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2.3 样品采取及处理 从液氮罐中取出肉芽组织，称取100 mg左右置碾钵中，倒入液氮，待组织冷冻坚硬后进行碾磨，粉碎后再加入液氮碾磨，如此反复进行3次。组织完全粉碎后，加0.2 ml样品稀释液，经超滤[3]后，取滤液10 μl注入0.5 cm×5 cm的玻璃样品小管中，经2次冷冻干燥后，再加20 μl衍生试剂，室温下衍生20 min，再经干燥后置冰箱保存。分析时，加50 μl样品稀释液涡旋搅拌，进样10 μl。
2.4 色谱条件 ①色谱柱：PICO-TAG柱(300 mm×3.9 mm id,5 μm,Waters公司)；②检测波长：UV 254 nm；③流速：1.0 ml/min;④柱温：46℃。分析梯度见表1。
表1 羟脯氨酸分析梯度表
Table 1 Election gradient of hydroxyproline 时间(min)
, 百拇医药
A%
B%
曲线号
初始
100
0
*
6.0
100
0
11
7.0
0
100
, 百拇医药
6
11.0
0
100
6
12.0
100
0
6
32.0
100
0
6
3 实验结果
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3.1 Hpro的标准品及肉芽组织的色谱图 如图1、图2所示。
图1 Hpro标准品色谱图
Figure 1 Chromatography of Hpro standard
图2 肉芽组织Hpro色谱图
Figure 2 Chromatography of Hpro in granutation tissues
3.2 线性关系及检测限 准确配制浓度为6.250、3.125、1.563、0.781、0.156 mmol/L的羟脯氨酸标准品溶液，进行色谱分析，峰面积与浓度呈良好的线性关系y=277.44x-167,r=0.998 319,最低检测浓度为0.04 μmol/L。
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3.3 回收率及精密度
3.3.1 回收率 见表2。
表2 肉芽组织中Hpro回收率 (n=6)
Table 2 Hpro recovery rate in granulation tissues 肉芽中的含量
(μmol/L)
加标量
(μmol/L)
加标后测得量
(μmol/L)
回收率
(%)
, 百拇医药
平均回收率
(%)
0.20
1.56
1.72
97.23
0.11
0.78
0.94
105.62
99.53±5.42
0.05
0.16
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0.20
95.24
3.3.2 重复性实验 以25 μmol/L浓度的Hpro标准品重复进样5次，变异系数为4.99%。
4 讨论
PITC和氨基酸反应后产生的苯基硫代氨甲酰-氨基酸，结构稳定，在室温下放置数小时，低温下放置2周后分析都可以得到良好的结果[4]。因此，有利于临床上零散收集组织样品而集中进行检测。
衍生时，真空干燥需注意彻底除去过量试剂，否则进入分析柱，极易降低柱寿命。
肉芽组织采取时必需多于50 mg,才够碾磨及检测(肉芽组织为无神经组织，病人不至引起疼痛)。
作者简介：刘放南(1949-)，妇，江西人，主管技师，从事营养监测工作。
, 百拇医药
参考文献：
[1]Christensen H,Oxlund H.Growth hormone increases the colhagen deposition rats and breaking strength of left colonic anastomoses in rats[J].Surgery,1994,116(3):550.
[2]Cohen S,Bidingmeyer B,Tarvin T.PITC derivatives in amino acid analysis[J].Natuse,1986,320:769.
[3]刘放南，盛学勤，陈永明.高效液相色谱法测定超滤后血浆中的谷氨酰胺[J].生物化学与生物物理进展，1996，23(5)：475.
[4]梁冬生，常碧影.柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸[J].色谱，1993，11(3)：140.
* 收稿日期：199905-10, http://www.100md.com