新型肿瘤生物标记端粒酶研究进展
作者：赵万洲 韩锐
单位：中国协和医科大学中国医学科学院药物研究所(北京，100050)
关键词：端粒酶；肿瘤；生物标记
癌症990442
中图分类号：R73-3
文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)04-0475-03
端粒酶是一种能延长端粒末端的核糖核蛋白酶，主要成分是RNA和蛋白质，含有引物特异识别位点，能以自身RNA为模板，合成端粒DNA并加到染色体末端，使端粒延长，从而延长细胞的寿命甚至使其永生化。自从1989年Morin[1]首次在人的癌细胞系中发现端粒酶以来，肿瘤细胞永生化的“端粒-端粒酶”假说已为越来越多的研究结果所证实。以端粒酶为靶点研究开发新的抗肿瘤药，以端粒酶活性水平作为肿瘤诊断的生物标记和愈后指标，越来越受到人们的关注。
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1 端粒酶与肿瘤的发生、发展
越来越多的资料表明，端粒酶的激活虽然不是引起细胞癌变的最早因素，但确实是一个维持肿瘤生长的继发性改变。Counter[2]认为端粒酶的表达是肿瘤发生的后续事件，而不是肿瘤发生的病因。Harley等[3]人提出了“端粒-端粒酶”假说。在细胞有丝分裂过程中，伴随部分端粒序列的丢失，端粒长度缩短。当端粒缩短到一定长度，可能触发某种信号，使细胞进入第一致死期M1，此时细胞不再分裂，退出细胞周期而死亡。如果细胞被病毒转染，或者某些抑癌基因如p53、RB等的突变，细胞可越过M1期而继续分裂，端粒继续缩短，最终达到一个关键阈值，细胞进入第二致死期M2，这时染色体可能出现形态异常，某些细胞由于端粒太短而失去功能，导致细胞死亡。但极少数细胞在此阶段进一步激活端粒酶，使端粒功能得以恢复，维持了染色体的稳定，从而避免死亡，具有无限增殖的能力。尽管迄今还不知道端粒酶激活的具体过程，但这一假说已被一些研究证实，提示端粒酶再激活可能参与细胞的癌变过程，可能是肿瘤发生过程中多步基因改变中的至关重要的一步。
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Kido[4]以化学致癌剂4-HAQQ诱发出大鼠骨肉瘤的同时，发现端粒酶的活性提高了18.4～19.1倍。在许多良性肿瘤及良性病变，如肠腺瘤、前列腺增生、子宫肌瘤中，均未检出端粒酶活性，但在癌前病变中则有低水平的端粒酶，如胃和肠的不典型增生[5],提示端粒酶的激活在肿瘤的发生中起着一定作用。
1993年Shay等[6,7]就提出端粒酶的再激活是正常乳腺上皮组织发展到乳腺癌过程中的重要一步。Hiyama[8]发现乳癌的分期与端粒酶的活性密切相关，在所有的Ⅳ期病人和96%的Ⅲ期病人瘤细胞内均可检测到端粒酶活性，而Ⅰ期病人中仅68%的可检测到，随着乳腺肿瘤的发展，端粒酶活性呈进行性增高。Ueda等[9]认为在皮肤肿瘤的发生过程中，端粒酶的激活可能处于早期阶段，而且可能早于紫外线特异的p53突变。通过慢性粒细胞性白血病(CML)和急性粒细胞性白血病(AML)病人的外周血和骨髓细胞检测，可观察到CML慢性期端粒酶活性较低。而AML时活性显著增高，而且复发病例比新发病例活性高[10]，揭示端粒酶在白血病有症状时临床阶段被激活，是肿瘤细胞恶性化的必要条件。Kim[11]认为端粒的长度不能作为衡量端粒酶活性的可靠标记，某些肿瘤组织的端粒显著短于正常组织，而端粒酶活性表达的水平可作为恶性肿瘤发展程度的衡量指标。
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Tahara[12]在1995年作了端粒酶活性在正常肝脏、慢性肝病(肝炎、肝硬化)和肝肿瘤中表达的有关研究，认为端粒酶的表达水平在肝癌的发展中起决定性作用，并且端粒酶活性的表达水平与肝炎病毒的种类无关。端粒酶的活性在慢性肝病和肝癌病人中的表达分别是55%的弱阳性和85%的强阳性，而在正常肝组织中未检测到端粒酶活性。
2 端粒酶活性的表达水平作为肿瘤诊断及预后指标的价值
研究资料表明[5，10]，恶性肿瘤组织端粒酶阳性率远远高于正常组织及肿瘤周围邻近组织(表1)，说明端粒酶活性与恶性肿瘤之间有较高的相关性，有人认为端粒酶活性是可靠的肿瘤标记物[13]。
表1 不同组织中端粒酶活性的阳性检出率[5](%)
头颈
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肺
胃
结肠
肝脏
胰
乳腺
前裂腺
肾
正常及癌周组织
3
4
5
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0-2
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14
0-5
0
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良性肿瘤及癌前病变
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5
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恶性肿瘤
86
78-100
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Hiyama等在这方面作了系统的研究。通过检测胰腺肿瘤得出，在胰腺癌中有95%(41/43)端粒酶活性增强，而在良性肿瘤中未检测到端粒酶活性[14]；对胃癌患者的研究表明，端粒酶阳性的患者其病灶较阴性者大，淋巴结转移率也较阴性者高，且预后差[15]；对140例乳腺癌中端粒酶的活性研究表明，端粒酶活性与预后存在相关性[16]。Nason[17]的研究证实端粒酶的持久活化与急性早幼粒细胞性白血病的全反式维甲酸抗药性有关。Zhang等[18]检测了56例AML病人的单核细胞中的端粒酶，发现41例表现端粒酶阳性，端粒酶活性高的病人对化疗抗药并且预后很差，而端粒酶活性低的病人预后较好。Sommerfeld[19]在16%的前列腺癌转移病人的淋巴结中均检测出端粒酶的表达强阳性。Brown等[20]以端粒酶RNA表达水平作指标成功地区分了成血管细胞瘤(hemangioblastomas)和转移性肾细胞癌。陈小君[21]等检测了51例鼻咽癌标本，端粒酶活性阳性率为88.2%，而18例鼻咽慢性炎症标本阳性率仅为11.1%。
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所以，临床上若将组织学检查与端粒酶检测结合起来，不但能提高早期诊断的准确率，而且还可以判断所取标本中细胞的永生性，从而推断是否有恶性变的可能。有意义的是，乳腺、甲状腺、前列腺等细针穿刺标本、尿标本、肠腔和膀胱冲洗液脱落细胞的端粒酶活性检测在恶性肿瘤也有较高的阳性表达[22～24]，这无疑为肿瘤的早期诊断提供了更便捷的途径。
3 端粒酶活性的检测
端粒酶活性的检测最初采用分析提取液在引物3’末端上合成重复序列的能力的方法，通过放射性核苷酸标记，聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影观察结果，但传统方法灵敏度有限，很难检测出人肿瘤细胞的端粒酶活性。1994年，Kim等[11]通过两个关键性的技术步骤建立了端粒重复序列扩增法(Telomericrepeatsamplificationprotocol,TRAP)，使灵敏度提高了一万倍，他首先应用去垢剂制备细胞提取液，然后利用PCR扩增端粒酶促反应产物，目前这一方法已成为端粒酶检测的主要方法，但这种方法亦存在不足之处，如在某些组织中有Taq酶抑制物，可能使实验结果出现假阴性，实验过程需时较长，实验结果定量困难，放射性同位素对人体的损伤及对环境的污染等。
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Tatematsu[10]改进了引物的设计，建立了“Strech-PCR”法，一定程度上提高了反应的精确度。Ohyashiki等[25]应用荧光标记的引物和DNA自动测序仪建立了一种新的方法：用荧光曲线表示端粒酶的活性，同时半定量地检测了端粒酶的活性。Savoysky[26]将TRAP与闪烁亲近法结合建立了RTAP-SPA，该检测方法的优点是速度快，可定量，便于大量检测。1996年，德国宝灵曼公司向市场推出了利用DIG标记引物，用于半定量检测端粒酶活性的试剂盒，最近，Wen等[27]采用TRAP银染法成功地检测了肿瘤组织中端粒酶活性，卫生辛等[28]将TRAP与常规ELISA法结合，建立了端粒酶TRAP-ELISA法，该方法特异、敏感、快速。端粒酶的活性检测正逐步向定量化、非同位素化发展。
4 端粒酶抑制剂的研究
早在1991年第27届美国临床肿瘤学会上提出肿瘤治疗的几套方案中，就提出端粒酶抑制剂是肿瘤治疗的一种新途径，目前有许多生物技术及制药公司正在以端粒酶为靶点，挖掘端粒酶抑制剂作为治疗肿瘤的有效药物。反义核苷酸、核酶、核苷类似物、蛋白激酶C抑制剂、细胞分化诱导剂作为端粒酶抑制剂显示出极有潜力的应用前景。
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4.1 阻断端粒酶RNA的模板作用抑制端粒酶活性
端粒酶RNA序列中含有与端粒DNA序列互补的模板序列，针对该模板序列设计的反义核甘酸可抑制端粒酶合成端粒序列。Feng等[29]首先用含反义人端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)的质粒转染HeLa细胞，经过23～26次倍增后，HeLa细胞进入生长危机，并伴随端粒长度的缩短和端粒酶活性的抑制。Norton等[30]设计了针对hTR模板区不同长度的反义肽苷酸(PNA)，PNA5’-TAGGGTTAGACAA抑制端粒酶活性的IC50为0.9nmol/L。PNA具有较DNA寡聚核苷酸更高的退火温度，以及抗蛋白酶和核酸酶降解能力具有5’-d(TTAGGG)序列的硫代反义核苷酸(PS-ODN)也是一种有效的端粒酶抑制剂。Meta等[31]发现，PS-ODN不仅能有效抑制Burkitt's淋巴瘤抽提物中的端粒酶活性，并能抑制淋巴瘤细胞系OMA-BL1的生长，延长倍增时间，诱导细胞调亡。对异种移植人肿瘤的裸鼠模型，给小鼠每天50mgPS-ODN可导致原位肿瘤体积缩小以及脾转移肿瘤结节数目减少，该抑制作用呈序列特异性和剂量依赖性。
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核酶是具有特殊核酸内切酶活性的小分子RNA。Kanazawa等[32]设计了一种锤形核酶(Telo-RZ)，具特异性切割hTR模板区序列的功能。Telo-RZ与肝癌细胞株HepG2和Huh-7的细胞抽提物共育，端粒酶活性受到明显抑制。
4.2 核苷类似物对端粒酶活性的抑制
端粒酶是合成端粒DNA的特殊逆转录酶，利用一些已知的逆转录酶抑制剂如AZT、AraC、ddT等核苷类似物有可能对端粒酶活性产生抑制作用。Yegorov等[33]实验表明，在AZT和Carbovir诱导下，鼠胚成纤维细胞自发地转化形成无端粒酶活性的细胞克隆，永生化的鼠胚成纤维细胞出现类似衰老的过程。Strahl等[34]研究发现，与AZT或ddG共同培养，可导致永生B细胞系JY616和T细胞系JurkatE6-1端粒缩短。近来有资料表明，7-脱氮-dGTP与7-脱氮-dATP也是端粒酶活性的有效抑制剂，其LC50低于100μmol[35]。
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4.3 蛋白激酶C抑制剂
蛋白激酶C抑制剂bisindolylmaleimideⅠ和H-7对鼻咽癌细胞NPC-076端粒酶活性具很强的抑制作用，staurosporine产生中等强度的抑制作用，sphingosine的抑制作用较弱[36]。
4.4 细胞分化诱导剂对端粒酶活性的抑制
Sharma等[37]用细胞分化剂维甲酸(RA)和维生素D3分别在诱导人早幼粒白血病HL-60细胞分化为成熟的粒细胞和单核细胞的同时，能明显抑制端粒酶活性，使细胞停滞于G1期。用丁酸钠诱导人红白血病细胞K562分化，可得同样结果。并发现端粒酶抑制程度与细胞分化程度相关。Bestilny等[38]用TPA、RA、DMSO诱导HL-60细胞分化为成熟的单核细胞或粒细胞，发现虽然hTR表达水平无明显变化，端粒酶活性及细胞增殖能力均明显受抑，调亡细胞增多，但在诱导胚胎细胞癌P19和神经母细胞瘤Neuro2a细胞分化过程中，无端粒酶抑制现象。同时，DMSO可作为Burkitt淋巴细胞系端粒酶的可逆性抑制剂[39]。
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除以上几类主要的端粒酶抑制剂外，Ofloxacin及其左旋体能抑制人转化膀胱癌细胞T24和BOY中端粒酶的活性[40]。亦有以1，4-或2，6-二取代氨基蒽-9，10-二酮的衍生物作为人端粒酶抑制剂的报道[41]。
5 结语
端粒、端粒酶与肿瘤的密切相关性，使端粒酶成为当今肿瘤防治领域最受重视的新靶点之一。肿瘤的发生可分为启动、促癌、演进三个阶段，端粒酶的激活可能发生于启动阶段的后期，深入研究端粒的激活过程及其活性维持机制，寻找开发有效的端粒酶抑制剂，有可能阻断细胞的恶性化转变。尽管科学家们刚刚开始评价端粒酶的临床应用，端粒酶抑制剂的研究也还处于实验室研究阶段，但这一领域却已显示了令人兴奋的广阔前景。
参考文献
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收稿日期：1998-11-10；修回日期：1998-12-25, http://www.100md.com
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Kido[4]以化学致癌剂4-HAQQ诱发出大鼠骨肉瘤的同时，发现端粒酶的活性提高了18.4～19.1倍。在许多良性肿瘤及良性病变，如肠腺瘤、前列腺增生、子宫肌瘤中，均未检出端粒酶活性，但在癌前病变中则有低水平的端粒酶，如胃和肠的不典型增生[5],提示端粒酶的激活在肿瘤的发生中起着一定作用。
1993年Shay等[6,7]就提出端粒酶的再激活是正常乳腺上皮组织发展到乳腺癌过程中的重要一步。Hiyama[8]发现乳癌的分期与端粒酶的活性密切相关，在所有的Ⅳ期病人和96%的Ⅲ期病人瘤细胞内均可检测到端粒酶活性，而Ⅰ期病人中仅68%的可检测到，随着乳腺肿瘤的发展，端粒酶活性呈进行性增高。Ueda等[9]认为在皮肤肿瘤的发生过程中，端粒酶的激活可能处于早期阶段，而且可能早于紫外线特异的p53突变。通过慢性粒细胞性白血病(CML)和急性粒细胞性白血病(AML)病人的外周血和骨髓细胞检测，可观察到CML慢性期端粒酶活性较低。而AML时活性显著增高，而且复发病例比新发病例活性高[10]，揭示端粒酶在白血病有症状时临床阶段被激活，是肿瘤细胞恶性化的必要条件。Kim[11]认为端粒的长度不能作为衡量端粒酶活性的可靠标记，某些肿瘤组织的端粒显著短于正常组织，而端粒酶活性表达的水平可作为恶性肿瘤发展程度的衡量指标。
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Tahara[12]在1995年作了端粒酶活性在正常肝脏、慢性肝病(肝炎、肝硬化)和肝肿瘤中表达的有关研究，认为端粒酶的表达水平在肝癌的发展中起决定性作用，并且端粒酶活性的表达水平与肝炎病毒的种类无关。端粒酶的活性在慢性肝病和肝癌病人中的表达分别是55%的弱阳性和85%的强阳性，而在正常肝组织中未检测到端粒酶活性。
2 端粒酶活性的表达水平作为肿瘤诊断及预后指标的价值
研究资料表明[5，10]，恶性肿瘤组织端粒酶阳性率远远高于正常组织及肿瘤周围邻近组织(表1)，说明端粒酶活性与恶性肿瘤之间有较高的相关性，有人认为端粒酶活性是可靠的肿瘤标记物[13]。
表1 不同组织中端粒酶活性的阳性检出率[5](%)
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Hiyama等在这方面作了系统的研究。通过检测胰腺肿瘤得出，在胰腺癌中有95%(41/43)端粒酶活性增强，而在良性肿瘤中未检测到端粒酶活性[14]；对胃癌患者的研究表明，端粒酶阳性的患者其病灶较阴性者大，淋巴结转移率也较阴性者高，且预后差[15]；对140例乳腺癌中端粒酶的活性研究表明，端粒酶活性与预后存在相关性[16]。Nason[17]的研究证实端粒酶的持久活化与急性早幼粒细胞性白血病的全反式维甲酸抗药性有关。Zhang等[18]检测了56例AML病人的单核细胞中的端粒酶，发现41例表现端粒酶阳性，端粒酶活性高的病人对化疗抗药并且预后很差，而端粒酶活性低的病人预后较好。Sommerfeld[19]在16%的前列腺癌转移病人的淋巴结中均检测出端粒酶的表达强阳性。Brown等[20]以端粒酶RNA表达水平作指标成功地区分了成血管细胞瘤(hemangioblastomas)和转移性肾细胞癌。陈小君[21]等检测了51例鼻咽癌标本，端粒酶活性阳性率为88.2%，而18例鼻咽慢性炎症标本阳性率仅为11.1%。
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所以，临床上若将组织学检查与端粒酶检测结合起来，不但能提高早期诊断的准确率，而且还可以判断所取标本中细胞的永生性，从而推断是否有恶性变的可能。有意义的是，乳腺、甲状腺、前列腺等细针穿刺标本、尿标本、肠腔和膀胱冲洗液脱落细胞的端粒酶活性检测在恶性肿瘤也有较高的阳性表达[22～24]，这无疑为肿瘤的早期诊断提供了更便捷的途径。
3 端粒酶活性的检测
端粒酶活性的检测最初采用分析提取液在引物3’末端上合成重复序列的能力的方法，通过放射性核苷酸标记，聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影观察结果，但传统方法灵敏度有限，很难检测出人肿瘤细胞的端粒酶活性。1994年，Kim等[11]通过两个关键性的技术步骤建立了端粒重复序列扩增法(Telomericrepeatsamplificationprotocol,TRAP)，使灵敏度提高了一万倍，他首先应用去垢剂制备细胞提取液，然后利用PCR扩增端粒酶促反应产物，目前这一方法已成为端粒酶检测的主要方法，但这种方法亦存在不足之处，如在某些组织中有Taq酶抑制物，可能使实验结果出现假阴性，实验过程需时较长，实验结果定量困难，放射性同位素对人体的损伤及对环境的污染等。
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Tatematsu[10]改进了引物的设计，建立了“Strech-PCR”法，一定程度上提高了反应的精确度。Ohyashiki等[25]应用荧光标记的引物和DNA自动测序仪建立了一种新的方法：用荧光曲线表示端粒酶的活性，同时半定量地检测了端粒酶的活性。Savoysky[26]将TRAP与闪烁亲近法结合建立了RTAP-SPA，该检测方法的优点是速度快，可定量，便于大量检测。1996年，德国宝灵曼公司向市场推出了利用DIG标记引物，用于半定量检测端粒酶活性的试剂盒，最近，Wen等[27]采用TRAP银染法成功地检测了肿瘤组织中端粒酶活性，卫生辛等[28]将TRAP与常规ELISA法结合，建立了端粒酶TRAP-ELISA法，该方法特异、敏感、快速。端粒酶的活性检测正逐步向定量化、非同位素化发展。
4 端粒酶抑制剂的研究
早在1991年第27届美国临床肿瘤学会上提出肿瘤治疗的几套方案中，就提出端粒酶抑制剂是肿瘤治疗的一种新途径，目前有许多生物技术及制药公司正在以端粒酶为靶点，挖掘端粒酶抑制剂作为治疗肿瘤的有效药物。反义核苷酸、核酶、核苷类似物、蛋白激酶C抑制剂、细胞分化诱导剂作为端粒酶抑制剂显示出极有潜力的应用前景。
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4.1 阻断端粒酶RNA的模板作用抑制端粒酶活性
端粒酶RNA序列中含有与端粒DNA序列互补的模板序列，针对该模板序列设计的反义核甘酸可抑制端粒酶合成端粒序列。Feng等[29]首先用含反义人端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)的质粒转染HeLa细胞，经过23～26次倍增后，HeLa细胞进入生长危机，并伴随端粒长度的缩短和端粒酶活性的抑制。Norton等[30]设计了针对hTR模板区不同长度的反义肽苷酸(PNA)，PNA5’-TAGGGTTAGACAA抑制端粒酶活性的IC50为0.9nmol/L。PNA具有较DNA寡聚核苷酸更高的退火温度，以及抗蛋白酶和核酸酶降解能力具有5’-d(TTAGGG)序列的硫代反义核苷酸(PS-ODN)也是一种有效的端粒酶抑制剂。Meta等[31]发现，PS-ODN不仅能有效抑制Burkitt's淋巴瘤抽提物中的端粒酶活性，并能抑制淋巴瘤细胞系OMA-BL1的生长，延长倍增时间，诱导细胞调亡。对异种移植人肿瘤的裸鼠模型，给小鼠每天50mgPS-ODN可导致原位肿瘤体积缩小以及脾转移肿瘤结节数目减少，该抑制作用呈序列特异性和剂量依赖性。
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核酶是具有特殊核酸内切酶活性的小分子RNA。Kanazawa等[32]设计了一种锤形核酶(Telo-RZ)，具特异性切割hTR模板区序列的功能。Telo-RZ与肝癌细胞株HepG2和Huh-7的细胞抽提物共育，端粒酶活性受到明显抑制。
4.2 核苷类似物对端粒酶活性的抑制
端粒酶是合成端粒DNA的特殊逆转录酶，利用一些已知的逆转录酶抑制剂如AZT、AraC、ddT等核苷类似物有可能对端粒酶活性产生抑制作用。Yegorov等[33]实验表明，在AZT和Carbovir诱导下，鼠胚成纤维细胞自发地转化形成无端粒酶活性的细胞克隆，永生化的鼠胚成纤维细胞出现类似衰老的过程。Strahl等[34]研究发现，与AZT或ddG共同培养，可导致永生B细胞系JY616和T细胞系JurkatE6-1端粒缩短。近来有资料表明，7-脱氮-dGTP与7-脱氮-dATP也是端粒酶活性的有效抑制剂，其LC50低于100μmol[35]。
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4.3 蛋白激酶C抑制剂
蛋白激酶C抑制剂bisindolylmaleimideⅠ和H-7对鼻咽癌细胞NPC-076端粒酶活性具很强的抑制作用，staurosporine产生中等强度的抑制作用，sphingosine的抑制作用较弱[36]。
4.4 细胞分化诱导剂对端粒酶活性的抑制
Sharma等[37]用细胞分化剂维甲酸(RA)和维生素D3分别在诱导人早幼粒白血病HL-60细胞分化为成熟的粒细胞和单核细胞的同时，能明显抑制端粒酶活性，使细胞停滞于G1期。用丁酸钠诱导人红白血病细胞K562分化，可得同样结果。并发现端粒酶抑制程度与细胞分化程度相关。Bestilny等[38]用TPA、RA、DMSO诱导HL-60细胞分化为成熟的单核细胞或粒细胞，发现虽然hTR表达水平无明显变化，端粒酶活性及细胞增殖能力均明显受抑，调亡细胞增多，但在诱导胚胎细胞癌P19和神经母细胞瘤Neuro2a细胞分化过程中，无端粒酶抑制现象。同时，DMSO可作为Burkitt淋巴细胞系端粒酶的可逆性抑制剂[39]。
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除以上几类主要的端粒酶抑制剂外，Ofloxacin及其左旋体能抑制人转化膀胱癌细胞T24和BOY中端粒酶的活性[40]。亦有以1，4-或2，6-二取代氨基蒽-9，10-二酮的衍生物作为人端粒酶抑制剂的报道[41]。
5 结语
端粒、端粒酶与肿瘤的密切相关性，使端粒酶成为当今肿瘤防治领域最受重视的新靶点之一。肿瘤的发生可分为启动、促癌、演进三个阶段，端粒酶的激活可能发生于启动阶段的后期，深入研究端粒的激活过程及其活性维持机制，寻找开发有效的端粒酶抑制剂，有可能阻断细胞的恶性化转变。尽管科学家们刚刚开始评价端粒酶的临床应用，端粒酶抑制剂的研究也还处于实验室研究阶段，但这一领域却已显示了令人兴奋的广阔前景。
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收稿日期：1998-11-10；修回日期：1998-12-25, http://www.100md.com