大肠癌端粒酶活性检测及诊断学意义
作者：寸凌云 陈雯 许发茂 张桥 万德森
单位：
寸凌云 陈雯 许发茂 张桥 中山医科大学公共卫生学院卫生毒理教研室(广州，510080)；万德森 中山医科大学肿瘤医院
关键词：大肠肿瘤；端粒酶；TRAP-银染；抑制效应
癌症990440
中图分类号：R735.34；R730.43 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(1999)04-0473-01
端粒与端粒酶是近年生物学界研究的热点，大量研究证实它与细胞衰老和肿瘤密切相关。虽然端粒酶与肿瘤发生的因果关系至今尚未有明确的结论，但端粒酶可在90%的肿瘤组织中表达这一事实使其在肿瘤诊断和治疗方面有着良好的利用前景。本文采用TRAP-银染法对32例手术切除的大肠癌组织端粒酶活性进行检测，并就端粒酶检出率与临床病理参数的关系及假阴性结果等几个涉及端粒酶在肿瘤诊断应用中的问题作了初步探讨。
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1 材料和方法
1.1 标本来源
32例大肠癌组织为中山医科大学肿瘤医院1995年10月(9例)和1997年3～4月(23例)手术切除标本。其中男性15例，女性17例，平均年龄55.6岁。标本取材中，剔除出血和坏死部分，立即-80℃冻存。所有病例均经病理证实，1例为印戒细胞癌，其余均为腺癌，阳性对照细胞CNE2(人鼻咽低分化鳞癌)由中山医科大学肿瘤研究所提供。
1.2 端粒酶提取
取组织50～100mg，或104～106CNE2细胞收获后，用冷的洗涤缓冲液[10mmol/LHepes-KOH(pH7.5)1.5mmol/LMgCl2，10mmol/LKCl，1mmol/LDTT]冲洗两次，组织加液氮研成粉末，立即加入200μl裂解缓冲液[200mmol/LTris-HCl(pH7.5)，1mmol/LMgCl2，1mmol/LEGTA,0.1mmolPMSF，5mmol/LBME,0.5%CHAPS,10%Glycerol]中冰浴30min,16000g、4℃离心20min，取上清液速冻后-80℃保存。考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量。
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1.3 端粒酶活性测定
参照Kim[1]创立的TRAP方法略加改进，用硝酸银染色，甲醛还原后显影观察结果。主要步骤：(1)建立反应体系，进行端粒酶催化的TS引物延伸；(2)加CX引物，进行PCR扩增；(3)在12.5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，分离扩增产物；(4)0.2%的硝酸银染色，0.28mol/L碳酸钠-0.02%甲醛显影，观察并记录结果。
1.4 统计学处理
用SPSS软件作χ2检验分析结果
2 结果
2.1 端粒酶在大肠癌中的表达
本实验用非同位素的TRAP-银染法，显影后以相隔6bp的梯状电泳图(至少4条带)为阳性结果(见图1)。32例大肠癌组织标本端粒酶检出率78.1%(25/32)，而相应癌旁组织仅有2例阳性(6.3%)。
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图1 结直肠癌中端粒酶活性及TRAP-银染的特异性
1、3、5.结直肠癌组织(10倍稀释)；2.癌旁组织；4.加RNase灭活；6.阴性对照；7.CNE2细胞阳性对照；8.pBR322-DNAHaeⅢ分子参照(bp)；9.加热灭活
表1 端粒酶检出率与临床病理参数的关系 组别
例数
端粒酶阴性数
端粒酶阳性数(%)
P值
取材时间
1995年10月
9
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4
5(55.6)
<0.01
1997年3～4月
23
3
20(87.0)
分化程度
Ⅰ级
6
1
5(83.3)
Ⅱ级
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16
4
12(75.0)
Ⅲ组
10
2
8(80.0)
>0.05
Dukes分期
A
5
1
4(80.0)
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B
12
2
10(83.3)
C
15
4
11(73.3)
>0.05
2.2 端粒酶检出率与大肠癌临床病理参数的关系
根据病理取材时间、肿瘤分化程度、临床分期等进行分组，结果见表1，由表可见，端粒酶检出率与取材时间有关，1995年取材的肿瘤组织，检出率明显低于1997年取材的肿瘤组织，其余各组端粒酶检出率无明显差异(P>0.05)。
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3 讨论
基于PCR的TRAP是目前检测端粒酶最敏感的方法。本研究用TRAP-银染方法可测出10个CNE2细胞中端粒酶活性(资料欠奉)。32例大肠癌标本中，端粒酶检出率78.1%(25/32)。7例端粒酶阴性的肿瘤组织，抽提液经系列稀释后出现阳性结果，说明抽提液中含有端粒酶或Taq酶的抑制剂。这种假阴性结果是应用端粒酶活性作肿瘤辅助诊断时必须解决的一个问题。就抑制剂的作用特点，Piatyszek[4]认为是抑制Taq酶所致，原因是在端粒酶延伸之后加入抑制性抽提液并不减轻抑制效应。本研究中1995年取材的标本假阴性率明显高于1997年取材的标本，表明抑制效应与标本的储存时间有关。但端粒酶的检出率却与肿瘤的分化程度和临床分期无关。至于抑制剂的来源，最近的研究表明，一种血红蛋白复合物可能是PCR的主要抑制剂[5]。32例大肠癌标本抽提液1000倍稀释后仍有28例端粒酶阳性，这可能是行手术切除的大肠癌患者多已进入临床晚期，所取标本中癌细胞占的比重较高。Yoshida[3]收集了15例结肠癌手术切除标本，肠腔灌洗液中的脱落细胞测定端粒酶活性，阳性率达60%，这为大肠癌的早期诊断和筛查提供了很好的思路。
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基金项目：国家自然科学基金资助(39670644)
参考文献
1 Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR.Specific association of human telomcrase activity with immortal cells and cancer [J] .Science,1994,226:2011～2105.
2 Tahara H,Kuniyasu H,Yokozaki H.Telomcrase activity in preneoplastic and neopvastic gastric and colorectal lesions [J] .Clin Cancer Res,1995,1(11):1245～1251.
3 Yoshida K,Sugino T,Goodison S,et al.Detection of telomerase activity in exfoliated cancer cells in colonic luminal washings and its related clinical implication [J] .Br J Cancer,1997,75(4):548～553.
, 百拇医药
4 Piatyszek MA,Kim NW,Weinrich SL.Detection of telomerase activity in human cells and tumors by a telomeric repeat amplification protocol(TRAP)[J] . Methods Cell Science,1995,17:1.
5 Akane A,Matsubara K,Nakamura H,et al.Identification of the heme compound copurified with deoxyribonucleic acid(DNA) from bloodstains,a major inhibitor of polymerase chain reaction(PCR) amplification [J] .J Forensic Sci,1994,39:362～372.
收稿日期：1998-04-14；修回日期：1999-01-25, http://www.100md.com
单位：
寸凌云 陈雯 许发茂 张桥 中山医科大学公共卫生学院卫生毒理教研室(广州，510080)；万德森 中山医科大学肿瘤医院
关键词：大肠肿瘤；端粒酶；TRAP-银染；抑制效应
癌症990440
中图分类号：R735.34；R730.43 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(1999)04-0473-01
端粒与端粒酶是近年生物学界研究的热点，大量研究证实它与细胞衰老和肿瘤密切相关。虽然端粒酶与肿瘤发生的因果关系至今尚未有明确的结论，但端粒酶可在90%的肿瘤组织中表达这一事实使其在肿瘤诊断和治疗方面有着良好的利用前景。本文采用TRAP-银染法对32例手术切除的大肠癌组织端粒酶活性进行检测，并就端粒酶检出率与临床病理参数的关系及假阴性结果等几个涉及端粒酶在肿瘤诊断应用中的问题作了初步探讨。
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1 材料和方法
1.1 标本来源
32例大肠癌组织为中山医科大学肿瘤医院1995年10月(9例)和1997年3～4月(23例)手术切除标本。其中男性15例，女性17例，平均年龄55.6岁。标本取材中，剔除出血和坏死部分，立即-80℃冻存。所有病例均经病理证实，1例为印戒细胞癌，其余均为腺癌，阳性对照细胞CNE2(人鼻咽低分化鳞癌)由中山医科大学肿瘤研究所提供。
1.2 端粒酶提取
取组织50～100mg，或104～106CNE2细胞收获后，用冷的洗涤缓冲液[10mmol/LHepes-KOH(pH7.5)1.5mmol/LMgCl2，10mmol/LKCl，1mmol/LDTT]冲洗两次，组织加液氮研成粉末，立即加入200μl裂解缓冲液[200mmol/LTris-HCl(pH7.5)，1mmol/LMgCl2，1mmol/LEGTA,0.1mmolPMSF，5mmol/LBME,0.5%CHAPS,10%Glycerol]中冰浴30min,16000g、4℃离心20min，取上清液速冻后-80℃保存。考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量。
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1.3 端粒酶活性测定
参照Kim[1]创立的TRAP方法略加改进，用硝酸银染色，甲醛还原后显影观察结果。主要步骤：(1)建立反应体系，进行端粒酶催化的TS引物延伸；(2)加CX引物，进行PCR扩增；(3)在12.5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，分离扩增产物；(4)0.2%的硝酸银染色，0.28mol/L碳酸钠-0.02%甲醛显影，观察并记录结果。
1.4 统计学处理
用SPSS软件作χ2检验分析结果
2 结果
2.1 端粒酶在大肠癌中的表达
本实验用非同位素的TRAP-银染法，显影后以相隔6bp的梯状电泳图(至少4条带)为阳性结果(见图1)。32例大肠癌组织标本端粒酶检出率78.1%(25/32)，而相应癌旁组织仅有2例阳性(6.3%)。
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图1 结直肠癌中端粒酶活性及TRAP-银染的特异性
1、3、5.结直肠癌组织(10倍稀释)；2.癌旁组织；4.加RNase灭活；6.阴性对照；7.CNE2细胞阳性对照；8.pBR322-DNAHaeⅢ分子参照(bp)；9.加热灭活
表1 端粒酶检出率与临床病理参数的关系 组别
例数
端粒酶阴性数
端粒酶阳性数(%)
P值
取材时间
1995年10月
9
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4
5(55.6)
<0.01
1997年3～4月
23
3
20(87.0)
分化程度
Ⅰ级
6
1
5(83.3)
Ⅱ级
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16
4
12(75.0)
Ⅲ组
10
2
8(80.0)
>0.05
Dukes分期
A
5
1
4(80.0)
, http://www.100md.com
B
12
2
10(83.3)
C
15
4
11(73.3)
>0.05
2.2 端粒酶检出率与大肠癌临床病理参数的关系
根据病理取材时间、肿瘤分化程度、临床分期等进行分组，结果见表1，由表可见，端粒酶检出率与取材时间有关，1995年取材的肿瘤组织，检出率明显低于1997年取材的肿瘤组织，其余各组端粒酶检出率无明显差异(P>0.05)。
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3 讨论
基于PCR的TRAP是目前检测端粒酶最敏感的方法。本研究用TRAP-银染方法可测出10个CNE2细胞中端粒酶活性(资料欠奉)。32例大肠癌标本中，端粒酶检出率78.1%(25/32)。7例端粒酶阴性的肿瘤组织，抽提液经系列稀释后出现阳性结果，说明抽提液中含有端粒酶或Taq酶的抑制剂。这种假阴性结果是应用端粒酶活性作肿瘤辅助诊断时必须解决的一个问题。就抑制剂的作用特点，Piatyszek[4]认为是抑制Taq酶所致，原因是在端粒酶延伸之后加入抑制性抽提液并不减轻抑制效应。本研究中1995年取材的标本假阴性率明显高于1997年取材的标本，表明抑制效应与标本的储存时间有关。但端粒酶的检出率却与肿瘤的分化程度和临床分期无关。至于抑制剂的来源，最近的研究表明，一种血红蛋白复合物可能是PCR的主要抑制剂[5]。32例大肠癌标本抽提液1000倍稀释后仍有28例端粒酶阳性，这可能是行手术切除的大肠癌患者多已进入临床晚期，所取标本中癌细胞占的比重较高。Yoshida[3]收集了15例结肠癌手术切除标本，肠腔灌洗液中的脱落细胞测定端粒酶活性，阳性率达60%，这为大肠癌的早期诊断和筛查提供了很好的思路。
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金资助(39670644)
参考文献
1 Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR.Specific association of human telomcrase activity with immortal cells and cancer [J] .Science,1994,226:2011～2105.
2 Tahara H,Kuniyasu H,Yokozaki H.Telomcrase activity in preneoplastic and neopvastic gastric and colorectal lesions [J] .Clin Cancer Res,1995,1(11):1245～1251.
3 Yoshida K,Sugino T,Goodison S,et al.Detection of telomerase activity in exfoliated cancer cells in colonic luminal washings and its related clinical implication [J] .Br J Cancer,1997,75(4):548～553.
, 百拇医药
4 Piatyszek MA,Kim NW,Weinrich SL.Detection of telomerase activity in human cells and tumors by a telomeric repeat amplification protocol(TRAP)[J] . Methods Cell Science,1995,17:1.
5 Akane A,Matsubara K,Nakamura H,et al.Identification of the heme compound copurified with deoxyribonucleic acid(DNA) from bloodstains,a major inhibitor of polymerase chain reaction(PCR) amplification [J] .J Forensic Sci,1994,39:362～372.
收稿日期：1998-04-14；修回日期：1999-01-25, http://www.100md.com