咖啡因促进受照肿瘤细胞凋亡的研究
作者：赵卫红 陈家佩 从玉文 吴岚军
单位：军事医学科学院放射医学研究所(北京，100850)
关键词：细胞凋亡；G2/M期阻滞；咖啡因；放射敏感性
癌症990418
【摘要】目的：探讨肿瘤细胞受照后G2/M期阻滞和凋亡的关系及调控。方法：以K562细胞为对象，用流式细胞仪、形态学、DNA电泳和凋亡蛋白2.7(APO2.7)等方法检测细胞周期和凋亡。结果：(1)20Gyγ射线照射K562细胞后引起G2/M期阻滞，48hG2/M期比例为71.2%，流式细胞仪、形态学和APO2.7检测凋亡比例分别为2.6%、2.0%±1.1%和22.5%；(2)照前加入10mmol/L咖啡因，G2/M比例降低至12.0%，凋亡比例增至13.5%、20.1%±3.5%和34.4%，明显高于单纯照射组(P<0.01)。咖啡因本身对细胞周期和凋亡没有影响。结论：抑制G2/M期阻滞可促进辐射诱导的凋亡，为提高肿瘤细胞的辐射敏感性提供一个新思路。
, http://www.100md.com
中图分类号：R730.5；R811.5 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)04-0415-03
Caffeine promoting tumor cells apoptosis induced by irradiation
ZHAO Wei-hong, CHEN Jia-pei, CONG Yu-wen,et al
Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850,P.R.China
【Abstract】 Objectives：To investigate the modulation and relationship between G2/M arrest and apoptosis induced by irradiation(IR). Methods：K562 cell line was used as the model.Cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry, DNA electrophoresis, morphology, and apoptotic protein 2.7(APO 2.7). Results：(1) 20 Gy gamma-ray IR resulted in G2/M arrest of K562 cells.The fraction of cells in G2/M phase at 48h after IR was 71.2%.Apoptitic cells were measured 2.6%, 2.0%± 1.1%and 22.5%by flow cytometry, morphology and APO2.7, respectively.(2)When K562 cells were treated with 10 mmol/L caffeine and 20 Gy gamma rays, the percentage of cells in G2/M phase was decreased to 12.0%, while,the percentage of apoptotic cells was increased as high as 13.5%, 20.1%± 3.5%and 34.4%, which was more than that of cells treated with IR alone (P<0.01).Caffeine had no effect on cell cycle and apoptosis.Conclusions： Inhibition of G2/M arrest could promote apoptosis induced by IR.It would give us a new method of enhencement of tumor cell radiosensitivity.
, 百拇医药
Key words：Apoptosis; G2/M arrest; Caffeine;Radiosensitivity
调控细胞周期和凋亡在肿瘤治疗研究中越来越受到重视。辐射可引起几乎所有真核细胞出现周期阻滞，但只能诱导对其敏感细胞的凋亡，不敏感的细胞在照后经过一段时间的修复，阻滞被解除，进入下一个增殖周期，并不发生凋亡[1，2]，如何促进这部分细胞进入凋亡程序对肿瘤放疗具有重要意义。本文以辐射耐受的人白血病细胞株K562为对象，观察了咖啡因(CAF)抑制辐射所致的G2/M期阻滞、促进凋亡的作用。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
K562细胞为本实验室冻存，照射后继续培养48h。CAF用RPMI-1640配成浓度为100mmol/L的储存液，照前加入培养瓶中。照射并加入10mmol/LCAF组作为实验组，单纯照射、10mmol/LCAF组及未照射组为三个对照组。
, 百拇医药
1.2 照射条件
60Goγ射线，照射剂量为20Gy，剂量率451.2cGy/min。
1.3 形态学观察(光镜、电镜)及DNA琼脂糖凝胶电泳检测
参照文献[3]进行。
1.4 细胞凋亡蛋白2.7(APO2.7)测定
参考Zhang等[4]方法，收集106细胞，4℃1%多聚甲醛固定15min；10μg/ml毛地黄苷4℃作用5min；加入FITC标记的鼠抗人APO2.7单抗，4℃染色30min，以FITC标记的非特异鼠抗人IgG1作为阴性对照，流式细胞仪检测调亡蛋白APO2.7的含量。
1.5 细胞周期测定
, 百拇医药
参照文献[3]进行。
1.6 统计学处理
采用两均数比较的t检验。
2 结果
2.1 γ射线对细胞周期和凋亡的作用
20Gy照后6h，细胞就出现G2/M期阻滞，G2/M期比例由照射前的6.4%升至24.5%，随时间延长，比例逐渐增加，至48h，达到71.2%。形态学、DNA电泳及流式细胞仪未观察到典型细胞凋亡发生。
2.2 咖啡因对受照细胞G2/M期阻滞的影响
加入10mmol/LCAF，照后48h，实验组G2/M期比例为12.0%，明显低于单纯照射组。单纯CAF作用组细胞周期无明显改变(图1)。
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图1 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡的改变
A：未照射，B：20Gy照射，C：10mmol/LCAF,D：20Gy+10mmol/LCAF
2.3 咖啡因对受照细胞凋亡的影响
2.3.1 形态学变化：实验组照射后48h，细胞出现凋亡的典型形态学改变，电镜下表现为细胞体积缩小，胞浆浓缩，胞核固缩碎裂，染色质凝聚，并有凋亡小体形成(图2)。光镜下的形态学改变同电镜观察一致，计数凋亡细胞比例为20.1%±3.5%，明显高于单纯照射组(2.0%±1.1%)和CAF单独作用组(4.5%±0.5%)(P<0.01)。
图2 K562细胞凋亡的形态学表现(箭头)×6000
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2.3.2 DNA电泳：实验组出现凋亡特有的ladder,三个对照组均未出现(图3)。
图3 K562细胞DNA电泳表现
A：对照，B：CAFC：20Gy照射，D：20Gy+CAF,M：Marker
2.3.3 凋亡蛋白APO2.7的检测：APO2.7是细胞线粒体膜上的一种蛋白，分子量38kDa，在细胞凋亡的早期表达，参与凋亡的发生过程。实验组APO2.7的表达率为34.4%，单纯照射组、单纯CAF组和未照射组分别是22.5%、2.7%和6.5%。
2.3.4 流式细胞仪检测：图1可见凋亡细胞出现在sub-G1期，实验组凋亡细胞比例为13.5%，高于单纯照射组(2.6%)及CAF作用组(2.8%)。
, 百拇医药
3 讨论
放疗是肿瘤治疗的三大手段之一。同化疗一样，某些肿瘤细胞对放疗不敏感，限制了其应用。因此，如何提高肿瘤细胞的放射敏感性一直是研究的热点。以往的研究多是从氧效应方面寻找福射增敏剂，而细胞凋亡与增殖周期的相关研究有可能为增强放射敏感性的研究提供一个新思路。
K562细胞是辐射耐受的人白血病细胞株。我们用20Gyγ射线照射K562细胞，出现明显的G2/M期阻滞，没有细胞凋亡发生。Han[5]等观察了辐射敏感的HL-60细胞和辐射耐受的HL-60细胞的突变株HCW-2细胞，两者受X射线照射后均发生G2/M期阻滞和相同比例的DNA双链断裂，但HL-60细胞在从G2/M期阻滞退出后发生凋亡，而HCW-2细胞又重新回到细胞周期，未发生凋亡。这些都表明，肿瘤细胞受照后只出现细胞周期阻滞而不发生凋亡可能是其放疗疗效差的原因之一。
, http://www.100md.com
对于G2/M期和凋亡的关系，有文献报道，辐射所致凋亡与细胞从G2/M期阻滞的快速退出有关[6]。我们的结果显示，照射前加入咖啡因，抑制辐射所致的G2/M期阻滞，促使原来未发生凋亡的细胞发生凋亡。其机制可能是由于缩短G2/M期阴滞时间，使损伤的DNA在染色体分离前不能得到完全修复，而启动了凋亡程序。提示G2/M期阻滞也可能是DNA的修复期。临床上给放疗的病人应用咖啡因一类的药物，有可能提高肿瘤对放疗的敏感性。
参考文献
1 Olive PL, Durand RE. Apoptosis：an indicator of radiosensitivity in vitro [J] ?. Int J Radiat Biol, 1997,71：695～707.
, 百拇医药 2 Yarnold J. Molecular aspects of cellular responses to radiotherapy[J] .Radiother Oncol,1997,44：1～7.
3 赵卫红主编.细胞凋亡[M].第1版，河南：河南医科大学出版社，1997：173.
4 Zhang C,Ao Z, Seth A, et al. A mitochondrial membrane protein defined by a novel monoclonal antibody is preferentially detected in apoptotic cells [J] .J Immunol, 1996,157：3980～3987.
5 Han Z, Chatterjee D, He DM, et al. Evidence for a G2 checkpoint in p53-independent apoptosis induction by X-irradiation [J] .Mol Cell Biol, 1995,15：5849～5857.
6 Bernhard EJ,Muschel RJ,Bakanauskas VJ, et al. Reducing the radiation-induced G2 delay causes Hela cells to undergo apoptosis instead of mitotic death [J] .Int J Radiat Biol, 1996,69：575～584.
收稿日期：1998-07-17；修回日期：1998-12-15, http://www.100md.com
单位：军事医学科学院放射医学研究所(北京，100850)
关键词：细胞凋亡；G2/M期阻滞；咖啡因；放射敏感性
癌症990418
【摘要】目的：探讨肿瘤细胞受照后G2/M期阻滞和凋亡的关系及调控。方法：以K562细胞为对象，用流式细胞仪、形态学、DNA电泳和凋亡蛋白2.7(APO2.7)等方法检测细胞周期和凋亡。结果：(1)20Gyγ射线照射K562细胞后引起G2/M期阻滞，48hG2/M期比例为71.2%，流式细胞仪、形态学和APO2.7检测凋亡比例分别为2.6%、2.0%±1.1%和22.5%；(2)照前加入10mmol/L咖啡因，G2/M比例降低至12.0%，凋亡比例增至13.5%、20.1%±3.5%和34.4%，明显高于单纯照射组(P<0.01)。咖啡因本身对细胞周期和凋亡没有影响。结论：抑制G2/M期阻滞可促进辐射诱导的凋亡，为提高肿瘤细胞的辐射敏感性提供一个新思路。
, http://www.100md.com
中图分类号：R730.5；R811.5 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)04-0415-03
Caffeine promoting tumor cells apoptosis induced by irradiation
ZHAO Wei-hong, CHEN Jia-pei, CONG Yu-wen,et al
Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850,P.R.China
【Abstract】 Objectives：To investigate the modulation and relationship between G2/M arrest and apoptosis induced by irradiation(IR). Methods：K562 cell line was used as the model.Cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry, DNA electrophoresis, morphology, and apoptotic protein 2.7(APO 2.7). Results：(1) 20 Gy gamma-ray IR resulted in G2/M arrest of K562 cells.The fraction of cells in G2/M phase at 48h after IR was 71.2%.Apoptitic cells were measured 2.6%, 2.0%± 1.1%and 22.5%by flow cytometry, morphology and APO2.7, respectively.(2)When K562 cells were treated with 10 mmol/L caffeine and 20 Gy gamma rays, the percentage of cells in G2/M phase was decreased to 12.0%, while,the percentage of apoptotic cells was increased as high as 13.5%, 20.1%± 3.5%and 34.4%, which was more than that of cells treated with IR alone (P<0.01).Caffeine had no effect on cell cycle and apoptosis.Conclusions： Inhibition of G2/M arrest could promote apoptosis induced by IR.It would give us a new method of enhencement of tumor cell radiosensitivity.
, 百拇医药
Key words：Apoptosis; G2/M arrest; Caffeine;Radiosensitivity
调控细胞周期和凋亡在肿瘤治疗研究中越来越受到重视。辐射可引起几乎所有真核细胞出现周期阻滞，但只能诱导对其敏感细胞的凋亡，不敏感的细胞在照后经过一段时间的修复，阻滞被解除，进入下一个增殖周期，并不发生凋亡[1，2]，如何促进这部分细胞进入凋亡程序对肿瘤放疗具有重要意义。本文以辐射耐受的人白血病细胞株K562为对象，观察了咖啡因(CAF)抑制辐射所致的G2/M期阻滞、促进凋亡的作用。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
K562细胞为本实验室冻存，照射后继续培养48h。CAF用RPMI-1640配成浓度为100mmol/L的储存液，照前加入培养瓶中。照射并加入10mmol/LCAF组作为实验组，单纯照射、10mmol/LCAF组及未照射组为三个对照组。
, 百拇医药
1.2 照射条件
60Goγ射线，照射剂量为20Gy，剂量率451.2cGy/min。
1.3 形态学观察(光镜、电镜)及DNA琼脂糖凝胶电泳检测
参照文献[3]进行。
1.4 细胞凋亡蛋白2.7(APO2.7)测定
参考Zhang等[4]方法，收集106细胞，4℃1%多聚甲醛固定15min；10μg/ml毛地黄苷4℃作用5min；加入FITC标记的鼠抗人APO2.7单抗，4℃染色30min，以FITC标记的非特异鼠抗人IgG1作为阴性对照，流式细胞仪检测调亡蛋白APO2.7的含量。
1.5 细胞周期测定
, 百拇医药
参照文献[3]进行。
1.6 统计学处理
采用两均数比较的t检验。
2 结果
2.1 γ射线对细胞周期和凋亡的作用
20Gy照后6h，细胞就出现G2/M期阻滞，G2/M期比例由照射前的6.4%升至24.5%，随时间延长，比例逐渐增加，至48h，达到71.2%。形态学、DNA电泳及流式细胞仪未观察到典型细胞凋亡发生。
2.2 咖啡因对受照细胞G2/M期阻滞的影响
加入10mmol/LCAF，照后48h，实验组G2/M期比例为12.0%，明显低于单纯照射组。单纯CAF作用组细胞周期无明显改变(图1)。
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图1 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡的改变
A：未照射，B：20Gy照射，C：10mmol/LCAF,D：20Gy+10mmol/LCAF
2.3 咖啡因对受照细胞凋亡的影响
2.3.1 形态学变化：实验组照射后48h，细胞出现凋亡的典型形态学改变，电镜下表现为细胞体积缩小，胞浆浓缩，胞核固缩碎裂，染色质凝聚，并有凋亡小体形成(图2)。光镜下的形态学改变同电镜观察一致，计数凋亡细胞比例为20.1%±3.5%，明显高于单纯照射组(2.0%±1.1%)和CAF单独作用组(4.5%±0.5%)(P<0.01)。
图2 K562细胞凋亡的形态学表现(箭头)×6000
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2.3.2 DNA电泳：实验组出现凋亡特有的ladder,三个对照组均未出现(图3)。
图3 K562细胞DNA电泳表现
A：对照，B：CAFC：20Gy照射，D：20Gy+CAF,M：Marker
2.3.3 凋亡蛋白APO2.7的检测：APO2.7是细胞线粒体膜上的一种蛋白，分子量38kDa，在细胞凋亡的早期表达，参与凋亡的发生过程。实验组APO2.7的表达率为34.4%，单纯照射组、单纯CAF组和未照射组分别是22.5%、2.7%和6.5%。
2.3.4 流式细胞仪检测：图1可见凋亡细胞出现在sub-G1期，实验组凋亡细胞比例为13.5%，高于单纯照射组(2.6%)及CAF作用组(2.8%)。
, 百拇医药
3 讨论
放疗是肿瘤治疗的三大手段之一。同化疗一样，某些肿瘤细胞对放疗不敏感，限制了其应用。因此，如何提高肿瘤细胞的放射敏感性一直是研究的热点。以往的研究多是从氧效应方面寻找福射增敏剂，而细胞凋亡与增殖周期的相关研究有可能为增强放射敏感性的研究提供一个新思路。
K562细胞是辐射耐受的人白血病细胞株。我们用20Gyγ射线照射K562细胞，出现明显的G2/M期阻滞，没有细胞凋亡发生。Han[5]等观察了辐射敏感的HL-60细胞和辐射耐受的HL-60细胞的突变株HCW-2细胞，两者受X射线照射后均发生G2/M期阻滞和相同比例的DNA双链断裂，但HL-60细胞在从G2/M期阻滞退出后发生凋亡，而HCW-2细胞又重新回到细胞周期，未发生凋亡。这些都表明，肿瘤细胞受照后只出现细胞周期阻滞而不发生凋亡可能是其放疗疗效差的原因之一。
, http://www.100md.com
对于G2/M期和凋亡的关系，有文献报道，辐射所致凋亡与细胞从G2/M期阻滞的快速退出有关[6]。我们的结果显示，照射前加入咖啡因，抑制辐射所致的G2/M期阻滞，促使原来未发生凋亡的细胞发生凋亡。其机制可能是由于缩短G2/M期阴滞时间，使损伤的DNA在染色体分离前不能得到完全修复，而启动了凋亡程序。提示G2/M期阻滞也可能是DNA的修复期。临床上给放疗的病人应用咖啡因一类的药物，有可能提高肿瘤对放疗的敏感性。
参考文献
1 Olive PL, Durand RE. Apoptosis：an indicator of radiosensitivity in vitro [J] ?. Int J Radiat Biol, 1997,71：695～707.
, 百拇医药 2 Yarnold J. Molecular aspects of cellular responses to radiotherapy[J] .Radiother Oncol,1997,44：1～7.
3 赵卫红主编.细胞凋亡[M].第1版，河南：河南医科大学出版社，1997：173.
4 Zhang C,Ao Z, Seth A, et al. A mitochondrial membrane protein defined by a novel monoclonal antibody is preferentially detected in apoptotic cells [J] .J Immunol, 1996,157：3980～3987.
5 Han Z, Chatterjee D, He DM, et al. Evidence for a G2 checkpoint in p53-independent apoptosis induction by X-irradiation [J] .Mol Cell Biol, 1995,15：5849～5857.
6 Bernhard EJ,Muschel RJ,Bakanauskas VJ, et al. Reducing the radiation-induced G2 delay causes Hela cells to undergo apoptosis instead of mitotic death [J] .Int J Radiat Biol, 1996,69：575～584.
收稿日期：1998-07-17；修回日期：1998-12-15, http://www.100md.com