间变性大细胞淋巴瘤EB病毒基因表达产物的检测及其意义
作者：饶慧兰 黄奕莉 侯景辉 林汉良
单位：饶慧兰 黄奕莉 侯景辉 中山医科大学肿瘤防治中心病理科(广州，510060)；林汉良 中山医科大学病理教研室(广州，510089)
关键词：Epstein-Barr病毒；间变性大细胞淋巴瘤；免疫组化；原位杂交；
癌症990415
【摘要】目的：了解间变性大细胞淋巴瘤与埃泼斯坦-巴尔(EB)病毒的关系。方法：采用原位杂交及免疫组化LSAB法对12例间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)进行EBV编码的RNA(EBERs)及EBV潜伏膜蛋白(LMP1)和潜在膜抗原(EBNA2)检测。结果：本组12例ALCL中EBERs阳性率为25%(3/12)；12例ALCLLMP1检出率为8.3%，EBNA2检出率为0(0/12)；12例ALCL免疫表型，8例为T源性，3例为B源性，1例非B非T；12例BerH2均阳性。结论：本结果表明EB病毒感染与部分ALCL关系密切，可能在其发病中起着重要作用。
, http://www.100md.com
中图分类号：R733.4文献标识码：A文章编号：1000-467X(1999)04-0407-02
The significance of detection of EB virus and its products in anaplastic large cell lyphoma
RAO Hui-lan, HUANG Yi-li, HOU Jing-hui,et al.
Department of Pathology,Cancer Centre,Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060,P.R.China
【Abstract】 Objective：To study the relationship between EB virus and anaplastic large cell lymphomal (ALCL). Methods：In situ hybridization and immunohistochemical methods were used to detect EBV-encoded EBERs and latent membrane protein 1(LMP1).Results：(1)Positive rate of EBERs by in situ hybridization in 12 cases of ALCL was 25% .(2)LMP1 expression was detected in 8.3% (1/12) of ALCL, no expression of EBNA2 was found.(3)Immunophenotypically,8 cases were of T lineage,3 cases were of B lineage,1 case was of null lineage.All cases were CD30 positive. Conclusion：Our results suggested that EBV might play on important role in the pathogenesis of some cases of ALCL.
, 百拇医药
Key words：Epstein-Barr virus;Anaplastic large cell lymphoma;In situ hybridization;Immunohistochemistry
间变性大细胞淋巴瘤(largecellanaplasticlymphoma,ALCL)是近年来新描述的淋巴瘤亚型。这一型淋巴瘤有其临床和形态学特征，瘤细胞体积大，胞浆丰富，核畸形明显，核仁大，常有花冠状多核巨细胞、胚胎样巨核细胞和R-S样细胞。瘤细胞与Ki-1单克隆抗体(CD30)起反应，因此又被称为Ki-1淋巴瘤[1]。目前国内对其与EB病毒关系的研究报道尚少，本研究对12例间变性大细胞淋巴瘤的EB病毒DNA转录及表达产物进行检测，并探讨ALCL与EB病毒感染的关系，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
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本组标本均选自中山医科大学附属肿瘤医院病理科1993～1996年存档活检标本，标本以常规固定，脱水，石蜡包埋，HE复检后的蜡块组织12例，占同期本科非何杰金氏淋巴瘤的4%(12/300)。12例作HE染色、免疫组化及原位杂交。
1.2 临床资料
本组12例ALCL，男性6例，女性6例，年龄范围8～52岁，平均292岁，平均病程3.7个月。受累部位包括淋巴结、软组织、纵隔、皮肤、鼻腔及鼻窦，有随访结果6例，4～55月健在。
1.3 方法
1.3.1 原位杂交检测：切取4μm厚组织贴于氨丙基三乙氧基硅烷(APES)处理的载玻片上，常规脱蜡、水化，蛋白酶K消化，逐级乙醇脱水，每片滴加15～20μl探针，37℃杂交2小时，1%Anti-FITC/AP孵育，2%BCIP/NBT显色，1%甲基绿复染，中性树胶封片。原位杂交试剂使用DAKO公司商品化的FITC标记的寡核苷酸探针(CodeNo.Y017)以及原位杂交检测试剂盒(CodeNo.K046)。EB阳性对照细胞株使用B95-8细胞株。
, 百拇医药
1.3.2 免疫组化检测：采用LSAB法，按DAKO公司说明书步骤进行。免疫组化检测试剂使用DAKO公司LSAB(labeledstrept-avidincomplex)试剂盒(CodeNo.K681),检测一抗LCA、L26、UCHL1、BerH2、LMP1、EBNA2，采用微波预处理。
1.3.3 阳性判断标准：原位杂交(EBERs)阳性信号表现为瘤细胞核呈蓝紫色颗粒着色；LMP1阳性染色棕黄色颗粒存在于胞膜和胞浆内；BerH2阳性染色见于胞膜，部分瘤细胞胞浆内核旁还可见一点状染色；LCA、L26、UCHL1胞膜阳性；EBNA2阳性为核着色。
2 结果
2.1 组织学观察
淋巴结结构破坏或部分破坏，瘤细胞散在分布或形成巢状边界；有时瘤细胞沿窦和滤泡间浸润。瘤细胞体积大，多形性，胞浆嗜双色，核仁大，核分裂像多见。常有花冠状多核巨细胞、胚胎样巨核细胞和R-S样细胞(图1)。
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2.2 原位杂交检测EBERs
本组12例中3例ALCL阳性(图2)，9例ALCL未见阳性信号。
2.3 免疫组化
本组12例中8例表达T细胞膜抗原，3例表达B细胞膜抗原，1例均不表达。BerH212例大部分瘤细胞阳性着色(图3)。12例中有1例检出LMP1(图4)。12例均未检出EBNA2(详见表1)。
图1.间变性大细胞淋巴瘤，瘤细胞形态多样，异型性明显，核仁大HE×200；图2.间变性大细胞淋巴瘤原位杂交阳性信号见于瘤细胞核内(×40)；图3.间变性大细胞淋巴瘤细胞BerH2阳性(×100)；图4.间变性大细胞淋巴瘤细胞表达LM1(×200)
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表1 12例间变性大细胞淋巴瘤免疫组化结果 抗体
总例数
阳性例数
阴性例数
阳性率(%)
LCA
12
12
0
100
L26
12
3
, 百拇医药
9
25
UCHL1
12
8
4
66.7
BerH2
12
12
0
100
LMP1
, 百拇医药 12
1
11
8.3
EBNA2
12
0
12
0
3 讨论
CD30是一种来自抗何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin'sdisease,HD)细胞株的单克隆抗体，此种抗体能与HD的R-S细胞和HD细胞起反应。许多实验均已证明EB病毒在体外具有转化功能，并且其可能对何杰金氏淋巴瘤具有病因学意义[1～3]。由于CD30+ALCL形态学及免疫表型特征与HD相似，因此有人推测EB病毒与CD30+—ALCL可能也存在病因学关系，可能EB病毒感染淋巴类细胞后直接或间接上调CD30活化相关性抗原[4]。
, 百拇医药
作为非杰金氏淋巴瘤的一种特殊亚型，ALCL与EB病毒关系仍在争论中。Herbst[5]等采用原位杂交检测ALCLEB病毒DNA，阳性率为19%，DiGiuseppe[6]和Nakamura[7]各自报道1例ALCL存在EB病毒潜伏感染，Carbone等[8]检测了5例带有HIV感染的ALCL患者，4例检出EB病毒DNA，而LopateguiJ[2]与Chirife[9]报道ALCL中EBERs检出率分别为12%(4/34)，10%(1/10)，Brousset等[11]检测11例儿童发生的ALCL组织中EBERs,阳性率为0/11，后者认为EB病毒与ALCL不存在密切的病因学关系。
我们对12例ALCL原位杂交检测EBERs，3例阳性(25%)，其中B细胞性1例(8.3%)，T细胞性2例(16.7%)，其中有1例表达LMP1，虽比文献报道的HD中EBV原位杂交检出率50%左右低，但与非何杰金氏淋巴瘤EBV检出率7%～25%相一致[9～11]。本组结果说明与非何杰金氏淋巴瘤一样，只有部分ALCL中有EB病毒潜伏感染，LMP1表达率较低，可能EB病毒与ALCL关系不如与HD那样密切。
, 百拇医药
LMP1是一重要的转化蛋白，本组1例检出LMP1，EBNA2未检出，提示可能LMP1在ALCL发生发展中起着重要作用。
间变性大细胞淋巴瘤较少见，本组病例占本科非何杰金氏淋巴瘤的4%，与文献报道1%～8%结果结果一致[1]。多为T细胞来源，少数带有B细胞抗原，1例完全缺乏抗原表达，大多数瘤细胞强烈表达Ki-1抗原(即CD30+)。
国际分类中，间变性大细胞淋巴瘤为高度恶性淋巴瘤。本组12例患者对化疗敏感，预后较高度恶性的T细胞淋巴瘤要好，6名随访患者至今仍生存。
参考文献
1 梁国桢.间变性大细胞淋巴瘤〔J〕.贵州医药.1990，14(2)：122.
2 Lopategui JR,Gaffey MJ, Chan JK, et al. Infrequent association of EBV with CD30-positive anaplastic large cell lymphomas from American and Asian patients 〔J〕 . Am J Surg Pathol,1995,19(1)：42～49.
, http://www.100md.com
3 Fellbaum C, Hansmann ML, Niedermeyer H, et al. Influence of EBV genomes on patient survival in Hodgkin's disease 〔J〕 . Am J Clin Pathol,1992,98：319～323.
4 Kanavoros P,Jiwa NM,de Bruin PC, et al. High incidence of EBV genome in CD30-positive non-Hodgdin's lymphomas 〔J〕 .J Pathol, 1992,168：307～315.
5 Herbst H, Stein H,Niedobitek G. Epstein-Barr virus and CD30+ malignant lymphomas 〔J〕 .Crit Rev Oncog,1993,4 ：191～239.
, 百拇医药
6 DiGiuseppe JA, Wu TC, Zehnbauer BA,et al. Epstein -Barr virus and progression of non-Hodgkin's lymphoma to Ki-1-positve, anaplastic large cell phenotype 〔J〕 .Mod Pathol,1995,8(5)：553～559.
7 Nakamura S, Sasajima Y, Koshikawa T,et al.Ki-1(CD30) positive anaplastic large cell lymphoma of T-cell phenotype developing in association with long-standing tuberculous pyothorax：report of a case with detection of Epstein-Barr virus genome in the tumor cells 〔J〕 .Hum Pathol,1995,26(12) ：1382～1385.
, 百拇医药
8 Carbone A, Dolcetti R, Gloghini A, et al. Immunophenotypic and molecular analyses of acquired immune deficiency syndrome-related and Epstein-Barr virus-associated lymphomas：a comparative study 〔J〕 .Hum Pathol,1996,27(2) ：133.
9 Chirife AM,Schmitz L, Gimenez L, et al. Incidence of characterization of large cell anaplastic lymphoma 〔J〕 .Sangre Barc, 1995,40(4) ：275～279.
10 Brousset P, Rochaix P, Chittal S, et al. High incidence of Epstein-Barr virus detection in Hodgkin's disease and absence of detection in anaplastic large-cell lymphoma in children 〔J〕 . Histopathology,1993,23：189～191.
11 Teramoto N, Sarker AB, Tonoyama Y, et al. Epstein-Barr virus infection in the neoplastic and nonneoplastic cells of lymphoid malignancies 〔J〕 . Cancer.1996,1;77(11) ：2339～2347.
收稿日期：1998-06-30；修回日期：1998-08-01, 百拇医药
单位：饶慧兰 黄奕莉 侯景辉 中山医科大学肿瘤防治中心病理科(广州，510060)；林汉良 中山医科大学病理教研室(广州，510089)
关键词：Epstein-Barr病毒；间变性大细胞淋巴瘤；免疫组化；原位杂交；
癌症990415
【摘要】目的：了解间变性大细胞淋巴瘤与埃泼斯坦-巴尔(EB)病毒的关系。方法：采用原位杂交及免疫组化LSAB法对12例间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)进行EBV编码的RNA(EBERs)及EBV潜伏膜蛋白(LMP1)和潜在膜抗原(EBNA2)检测。结果：本组12例ALCL中EBERs阳性率为25%(3/12)；12例ALCLLMP1检出率为8.3%，EBNA2检出率为0(0/12)；12例ALCL免疫表型，8例为T源性，3例为B源性，1例非B非T；12例BerH2均阳性。结论：本结果表明EB病毒感染与部分ALCL关系密切，可能在其发病中起着重要作用。
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中图分类号：R733.4文献标识码：A文章编号：1000-467X(1999)04-0407-02
The significance of detection of EB virus and its products in anaplastic large cell lyphoma
RAO Hui-lan, HUANG Yi-li, HOU Jing-hui,et al.
Department of Pathology,Cancer Centre,Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060,P.R.China
【Abstract】 Objective：To study the relationship between EB virus and anaplastic large cell lymphomal (ALCL). Methods：In situ hybridization and immunohistochemical methods were used to detect EBV-encoded EBERs and latent membrane protein 1(LMP1).Results：(1)Positive rate of EBERs by in situ hybridization in 12 cases of ALCL was 25% .(2)LMP1 expression was detected in 8.3% (1/12) of ALCL, no expression of EBNA2 was found.(3)Immunophenotypically,8 cases were of T lineage,3 cases were of B lineage,1 case was of null lineage.All cases were CD30 positive. Conclusion：Our results suggested that EBV might play on important role in the pathogenesis of some cases of ALCL.
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Key words：Epstein-Barr virus;Anaplastic large cell lymphoma;In situ hybridization;Immunohistochemistry
间变性大细胞淋巴瘤(largecellanaplasticlymphoma,ALCL)是近年来新描述的淋巴瘤亚型。这一型淋巴瘤有其临床和形态学特征，瘤细胞体积大，胞浆丰富，核畸形明显，核仁大，常有花冠状多核巨细胞、胚胎样巨核细胞和R-S样细胞。瘤细胞与Ki-1单克隆抗体(CD30)起反应，因此又被称为Ki-1淋巴瘤[1]。目前国内对其与EB病毒关系的研究报道尚少，本研究对12例间变性大细胞淋巴瘤的EB病毒DNA转录及表达产物进行检测，并探讨ALCL与EB病毒感染的关系，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
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本组标本均选自中山医科大学附属肿瘤医院病理科1993～1996年存档活检标本，标本以常规固定，脱水，石蜡包埋，HE复检后的蜡块组织12例，占同期本科非何杰金氏淋巴瘤的4%(12/300)。12例作HE染色、免疫组化及原位杂交。
1.2 临床资料
本组12例ALCL，男性6例，女性6例，年龄范围8～52岁，平均292岁，平均病程3.7个月。受累部位包括淋巴结、软组织、纵隔、皮肤、鼻腔及鼻窦，有随访结果6例，4～55月健在。
1.3 方法
1.3.1 原位杂交检测：切取4μm厚组织贴于氨丙基三乙氧基硅烷(APES)处理的载玻片上，常规脱蜡、水化，蛋白酶K消化，逐级乙醇脱水，每片滴加15～20μl探针，37℃杂交2小时，1%Anti-FITC/AP孵育，2%BCIP/NBT显色，1%甲基绿复染，中性树胶封片。原位杂交试剂使用DAKO公司商品化的FITC标记的寡核苷酸探针(CodeNo.Y017)以及原位杂交检测试剂盒(CodeNo.K046)。EB阳性对照细胞株使用B95-8细胞株。
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1.3.2 免疫组化检测：采用LSAB法，按DAKO公司说明书步骤进行。免疫组化检测试剂使用DAKO公司LSAB(labeledstrept-avidincomplex)试剂盒(CodeNo.K681),检测一抗LCA、L26、UCHL1、BerH2、LMP1、EBNA2，采用微波预处理。
1.3.3 阳性判断标准：原位杂交(EBERs)阳性信号表现为瘤细胞核呈蓝紫色颗粒着色；LMP1阳性染色棕黄色颗粒存在于胞膜和胞浆内；BerH2阳性染色见于胞膜，部分瘤细胞胞浆内核旁还可见一点状染色；LCA、L26、UCHL1胞膜阳性；EBNA2阳性为核着色。
2 结果
2.1 组织学观察
淋巴结结构破坏或部分破坏，瘤细胞散在分布或形成巢状边界；有时瘤细胞沿窦和滤泡间浸润。瘤细胞体积大，多形性，胞浆嗜双色，核仁大，核分裂像多见。常有花冠状多核巨细胞、胚胎样巨核细胞和R-S样细胞(图1)。
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2.2 原位杂交检测EBERs
本组12例中3例ALCL阳性(图2)，9例ALCL未见阳性信号。
2.3 免疫组化
本组12例中8例表达T细胞膜抗原，3例表达B细胞膜抗原，1例均不表达。BerH212例大部分瘤细胞阳性着色(图3)。12例中有1例检出LMP1(图4)。12例均未检出EBNA2(详见表1)。
图1.间变性大细胞淋巴瘤，瘤细胞形态多样，异型性明显，核仁大HE×200；图2.间变性大细胞淋巴瘤原位杂交阳性信号见于瘤细胞核内(×40)；图3.间变性大细胞淋巴瘤细胞BerH2阳性(×100)；图4.间变性大细胞淋巴瘤细胞表达LM1(×200)
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表1 12例间变性大细胞淋巴瘤免疫组化结果 抗体
总例数
阳性例数
阴性例数
阳性率(%)
LCA
12
12
0
100
L26
12
3
, 百拇医药
9
25
UCHL1
12
8
4
66.7
BerH2
12
12
0
100
LMP1
, 百拇医药 12
1
11
8.3
EBNA2
12
0
12
0
3 讨论
CD30是一种来自抗何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin'sdisease,HD)细胞株的单克隆抗体，此种抗体能与HD的R-S细胞和HD细胞起反应。许多实验均已证明EB病毒在体外具有转化功能，并且其可能对何杰金氏淋巴瘤具有病因学意义[1～3]。由于CD30+ALCL形态学及免疫表型特征与HD相似，因此有人推测EB病毒与CD30+—ALCL可能也存在病因学关系，可能EB病毒感染淋巴类细胞后直接或间接上调CD30活化相关性抗原[4]。
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作为非杰金氏淋巴瘤的一种特殊亚型，ALCL与EB病毒关系仍在争论中。Herbst[5]等采用原位杂交检测ALCLEB病毒DNA，阳性率为19%，DiGiuseppe[6]和Nakamura[7]各自报道1例ALCL存在EB病毒潜伏感染，Carbone等[8]检测了5例带有HIV感染的ALCL患者，4例检出EB病毒DNA，而LopateguiJ[2]与Chirife[9]报道ALCL中EBERs检出率分别为12%(4/34)，10%(1/10)，Brousset等[11]检测11例儿童发生的ALCL组织中EBERs,阳性率为0/11，后者认为EB病毒与ALCL不存在密切的病因学关系。
我们对12例ALCL原位杂交检测EBERs，3例阳性(25%)，其中B细胞性1例(8.3%)，T细胞性2例(16.7%)，其中有1例表达LMP1，虽比文献报道的HD中EBV原位杂交检出率50%左右低，但与非何杰金氏淋巴瘤EBV检出率7%～25%相一致[9～11]。本组结果说明与非何杰金氏淋巴瘤一样，只有部分ALCL中有EB病毒潜伏感染，LMP1表达率较低，可能EB病毒与ALCL关系不如与HD那样密切。
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LMP1是一重要的转化蛋白，本组1例检出LMP1，EBNA2未检出，提示可能LMP1在ALCL发生发展中起着重要作用。
间变性大细胞淋巴瘤较少见，本组病例占本科非何杰金氏淋巴瘤的4%，与文献报道1%～8%结果结果一致[1]。多为T细胞来源，少数带有B细胞抗原，1例完全缺乏抗原表达，大多数瘤细胞强烈表达Ki-1抗原(即CD30+)。
国际分类中，间变性大细胞淋巴瘤为高度恶性淋巴瘤。本组12例患者对化疗敏感，预后较高度恶性的T细胞淋巴瘤要好，6名随访患者至今仍生存。
参考文献
1 梁国桢.间变性大细胞淋巴瘤〔J〕.贵州医药.1990，14(2)：122.
2 Lopategui JR,Gaffey MJ, Chan JK, et al. Infrequent association of EBV with CD30-positive anaplastic large cell lymphomas from American and Asian patients 〔J〕 . Am J Surg Pathol,1995,19(1)：42～49.
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3 Fellbaum C, Hansmann ML, Niedermeyer H, et al. Influence of EBV genomes on patient survival in Hodgkin's disease 〔J〕 . Am J Clin Pathol,1992,98：319～323.
4 Kanavoros P,Jiwa NM,de Bruin PC, et al. High incidence of EBV genome in CD30-positive non-Hodgdin's lymphomas 〔J〕 .J Pathol, 1992,168：307～315.
5 Herbst H, Stein H,Niedobitek G. Epstein-Barr virus and CD30+ malignant lymphomas 〔J〕 .Crit Rev Oncog,1993,4 ：191～239.
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6 DiGiuseppe JA, Wu TC, Zehnbauer BA,et al. Epstein -Barr virus and progression of non-Hodgkin's lymphoma to Ki-1-positve, anaplastic large cell phenotype 〔J〕 .Mod Pathol,1995,8(5)：553～559.
7 Nakamura S, Sasajima Y, Koshikawa T,et al.Ki-1(CD30) positive anaplastic large cell lymphoma of T-cell phenotype developing in association with long-standing tuberculous pyothorax：report of a case with detection of Epstein-Barr virus genome in the tumor cells 〔J〕 .Hum Pathol,1995,26(12) ：1382～1385.
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8 Carbone A, Dolcetti R, Gloghini A, et al. Immunophenotypic and molecular analyses of acquired immune deficiency syndrome-related and Epstein-Barr virus-associated lymphomas：a comparative study 〔J〕 .Hum Pathol,1996,27(2) ：133.
9 Chirife AM,Schmitz L, Gimenez L, et al. Incidence of characterization of large cell anaplastic lymphoma 〔J〕 .Sangre Barc, 1995,40(4) ：275～279.
10 Brousset P, Rochaix P, Chittal S, et al. High incidence of Epstein-Barr virus detection in Hodgkin's disease and absence of detection in anaplastic large-cell lymphoma in children 〔J〕 . Histopathology,1993,23：189～191.
11 Teramoto N, Sarker AB, Tonoyama Y, et al. Epstein-Barr virus infection in the neoplastic and nonneoplastic cells of lymphoid malignancies 〔J〕 . Cancer.1996,1;77(11) ：2339～2347.
收稿日期：1998-06-30；修回日期：1998-08-01, 百拇医药