500例良恶性肿瘤ICM－DNA分析研究
作者：许良中 周晓燕 杨文涛 朱伟萍 施宗高 李小秋
单位：上海医科大学肿瘤医院分子病理研究室(上海，200032)周晓燕,通讯作者
关键词：ICM-DNA；肿瘤
癌症990408
【摘要】目的：观察各种恶性肿瘤及相应良性病变中DNA含量及倍体的变化，分析其对诊断、分级和预后判断的价值。方法：利用DIPAS-200生物图像处理分析系统，对常见恶性肿瘤及其良性病变共500例作ICM-DNA分析研究。结果：(1)宫颈鳞癌、卵巢常见恶性肿瘤(浆液性及粘液性囊腺癌)、滤泡性淋巴瘤的DNA含量和超二倍体率均显著高于相应起源组织或良性肿瘤；(2)结直肠高分化腺癌与良性病变之间、各种类型甲状腺癌与正常甲状腺滤泡上皮和良性肿瘤之间的DNA含量和倍体无显著差异；(3)乳腺浸润性导管癌、宫颈鳞癌、结直肠腺癌的分化程度越低，DNA含量均越高，超二倍体率也越高。结论：ICM-DNA检测能在定量水平分析肿瘤，可有助于良恶性肿瘤的鉴别，特别是对一些交界性肿瘤和临床疑难病例的诊断可提供有价值的参考指标，DNA含量和DNA倍体特征与某些恶性肿瘤的分化状态有关。
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中图分类号：R735.1 文献标识码：A 文章编号：1000X(1999)04-0385-04
Studies on ICM-DNA analysis of 500 cases of benign and malignant tumors
XU Liang-zhong, ZHOU Xiao-yan, YANG Wen-tao, et al.
Department of Molecular Pathologgy,Cancer Hospital,Shanghai Medical University, Shanghai 200032,P.R.China
【Abstract】 Objective：To analyze DNA content and the ratio of hyperdiploid and their value in diagnosis and prognosis of malignant tumors and benign lesions. Methods：DNA image cytometry (ICM-DNA) was applied to analyze 500 cases of malignant tumors and corresponding benign lesions.Results：(1)DNA contents and the ratio of hyperdiploid were higher in cervical squamous carcinoma, serous and mucinous ovarian cystadenocarcinoma and follicular lymphoma than those of their corresponding original tissues or benign lesions.(2)No significant difference in DNA contents and the ratio of hyperdiploid was found between well differentiated colon or rectum adenocarcinoma and benign lesions and between all types of thyroid carcinoma and normal thyroid follicular epithelium or benign tumors.(3) In invasive breast ductal carcinoma, cervical squamous carcinoma and colon or rectum carcinoma,the lower differentiation, the higher DNA contents and the ratio of hyperdiploid were found. Conclusions：DNA quantitation can be analyzed using ICM-DNA.ICM-DNA is helpful in differentiating malignancy and benignity.It can especially provide valuable reference indices for differentiation in some borderline neoplasms and difficult cases.DNA contents and the characteristics of the DNA ploidy are associated with the degree of differentiation in some malignant neoplasms.
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Key words：ICM-DNA;Neoplasm
目前，恶性肿瘤的病理诊断主要依靠形态学，其预后根据病理类型、分级及临床分期来判断。但这些指标缺乏定量概念，一方面不利于对疾病本质的认识，另一方面各个观察者之间常存在一定的偏差，交流不方便，而且一些交界性疾病的诊断和预后判断常常较为困难。
目前的研究资料表明肿瘤细胞DNA非整倍体是恶性肿瘤的特征性标志之一。测量和分析细胞核DNA含量与倍体对恶性肿瘤的病理诊断、恶性程度的判断、疗效估计、预测预后均具有重要价值[1，2，3]。流式细胞术(flow cytometry,FCM)和细胞图像测量术(image cytometry,ICM)是测量和分析肿瘤细胞的DNA含量和倍体的两种主要方法，两者的检测结果相似或具有相关性[4，5]。ICM能在显微镜下准确地选择本切片中具有代表性的肿瘤细胞，细胞数量可多可少，还可测量细胞核面积和某些形状因子，并具有检测简单、操作客观、重复性好等优点，因此，近年来ICM-DNA技术得到了飞速的发展。本研究利用DIPAS-200生物图像处理分析系统，对常见恶性肿瘤及其良性病变共500例作ICM-DNA分析研究，旨在：(1)观察各种肿瘤及其良恶性病变中有关指标的客观数据；(2)分析各指标对诊断、分级和预后判断的价值。
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1 材料与方法
1.1 病理标本及切片制作
收集上海医科大学肿瘤医院病理科存档蜡块，包括各种类型淋巴瘤及反应性滤泡增生200例，乳腺肿瘤100例，宫颈鳞状上皮及良恶性肿瘤48例，卵巢肿瘤40例，甲状腺肿瘤及正常甲状腺组织52例，结直肠肿瘤60例。每例作4μm厚切片2张，一张作HE染色，用以明确诊断及对照观察，另一张作细胞核DNAFeulgen染色，用于ICM分析。
1.2 使用仪器
DIPAS-200生物图像处理分析系统(定诚生物图像科技有限公司研制)。
1.3 主要操作步骤
1.3.1 调整仪器：调节稳压稳流电源及摄像机的对比度。
, 百拇医药
1.3.2 设定基准：选定同批染色切片中小淋巴细胞或肿瘤起源组织细胞为二倍体参照细胞，在系统220的基准值下测定其吸光光密度，所得的值乘参考矫正系数1.2，作为本组实验的二倍体基准。
1.3.3 采集图像：选择肿瘤代表性的高倍视野(×40)冻结图像。
1.3.4 二值化：处理分析系统对细胞图像进行二值化处理，如果细胞选不上，将二值化值作一定比例的提高，分析时将基准值相应的提高。
1.3.5 待测细胞的选择：在体现分类分型特征的前提下，采取随机的原则每例选择代表性的细胞100个，大约10个视野左右。
1.3.6 分析计算输出结果，输出指标包括：平均DNA含量，DNA指数，DNA直方图(二倍体、异倍体)，积分光密度的平均值(IOD)，核面积、周长、形状因子等。
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1.4 统计方法
计量资料之间的比较用t检验，计数资料之间的比较用χ2检验，各类型滤泡性淋巴瘤(FL)之间DNA含量比较采用析因分析。
2 结果
本研究分析各检测病例的原始数据，主要选取了DNA含量这一最为重要的数据，并根据二倍体基准值推算各病例的DNA倍体情况，对有关病例分析统计。结果如下：
卵巢肿瘤中最常见的恶性肿瘤(浆液性或粘液性囊腺癌)的DNA含量和超二倍体率高于常见良性肿瘤(浆液性或粘液性囊腺瘤)，低分化腺癌的DNA含量和超二倍体率显著高于良性肿瘤。卵巢的其它恶性肿瘤也有较高的DNA含量，并可表现为超二倍体，但因收集的例数较少，未做统计。良性肿瘤与中分化腺癌、中低分化腺癌之间DNA含量和超二倍体率无显著差异(表1)。
, http://www.100md.com 表1 卵巢肿瘤各病理类型之间DNA含量、二倍体/近二倍体和超二倍体率比较 组别
病理类型
总例数
DNA含量
(
±S)
二倍体/近二倍体
例数(DI≤1.1)
超二倍体例
数(DI>1.1)
1
囊腺瘤
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4
7.38±1.678
2
2
2
中分化腺癌
11
8.894±1.304
1
10
3
低分化腺癌
14
, 百拇医药
11.49±2.51
2
12
4
透明细胞癌
2
0
2
5
内胚窦癌
2
0
2
6
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胚胎性癌
1
0
1
7
粒层细胞瘤
2
1
1
8
卵泡膜细胞瘤
2
0
2
, 百拇医药
9
恶性纤维上皮瘤
1
0
1
10
恶性中胚叶混合瘤
1
1
0
1，2，3组DNA含量的比较：1vs(2+3)：P<0.05，1vs2：P>0.05，1vs3：P<0.05，2vs3：P>0.05
1，2，3组超二倍体率比较：1vs(2+3)：P<0.05,1vs2：P>0.05，1vs3：P<0.05，2vs3：P>0.05
, http://www.100md.com
浸润性导管癌是乳腺癌中最常见的类型，不同级别的浸润性导管癌DNA含量之间有显著差异，级别越高，即分化越差，其DNA含量越高，超二倍体肿瘤的比率也越高(表2)。其他类型的乳腺癌及良性肿瘤因病例数较少，未作统计。
表2 不同级别浸润性导管癌DNA含量、二倍体/近二倍体和超二倍体率的比较 分级
例数
DNA含量
(±S)
二倍体/近二倍体
例数(DI≤1.1)
超二倍体例
, http://www.100md.com
数(DI>1.1)
G1
22
8.26±2.17
8(36.4)
14(63.6)
G2
40
9.79±2.45
8(20)
32(80)
G3
27
, 百拇医药
14.43±3.17
1(3.7)
26(96.3)
各级别DNA含量和超二倍体比较：G1vsG2,G1vsG3,G2vsG3,P值均小于0.05
宫颈正常鳞状上皮及其良恶性肿瘤的DNA含量及超二倍体率分析比较，其结果是(1)正常鳞状上皮与乳头状瘤DNA含量无显著差异；(2)原位癌和鳞癌的DNA含量和超二倍体率均高于正常鳞状上皮和乳头状瘤；(3)原位癌的DNA含量和超二倍体率与浸润性鳞癌无显著性差别；(4)原位癌、Ⅰ、Ⅱ级鳞癌的DNA含量低于Ⅲ级鳞癌，而二倍体率未显示差异(表3，表4)。
表3 宫颈鳞状上皮及其良恶性肿瘤DNA含量、二倍体/近二倍体和超二倍体率的比较 组别
, 百拇医药 病理类型
例数
DNA含量
(±S)
二倍体/近二倍体
例数(DI≤1.1)
超二倍体例
数(DI>1.1)
1
正常鳞状上皮
7
5.07±0.74
, 百拇医药
7
0
2
乳头状瘤
3
6.21±2.07
3
0
3
原位癌
11
9.97±5.68
3
, 百拇医药 8
4
鳞癌
23
9.58±3.02
9
14
各组DNA含量和超二倍体率的比较：1vs2：P>0.05,1vs3：P<0.05，1vs4：P<0.05，2vs3：P<0.05，2vs4：P<0.05，3vs4：P>0.05表4 各级别鳞癌间DNA含量二倍体/近二倍体和超二倍体率的比较 组别
病理类型
例数
, http://www.100md.com DNA含量
(±S)
二倍体/近二倍体
例数(DI≤1.1)
超二倍体例
数(DI>1.1)
1
原位癌
11
9.58±3.02
3
8
, 百拇医药
2
Ⅰ
7
6.69±2.12
5
2
3
Ⅱ
8
8.10±1.64
3
4
4
Ⅲ
, 百拇医药
8
4.83±7.33
1
7
各组DNA含量的比较：1vs2、3：P>0.05,2vs3：P>0.05,1、2、3vs4：P<0.05。各组超二倍体率的比较无显著差异。
各种类型的甲状腺肿瘤共52例(包括腺瘤、乳头状腺癌、滤泡性癌、髓样癌)，各类型间DNA含量和超二倍体率无显著差异，乳头状腺癌是最常见的恶性肿瘤，其DNA含量反而比良性腺瘤的DNA值为低。甲状腺和淋巴结转移性乳头状腺癌的DNA含量及超二倍体率亦无差异。
直肠中、低分化腺癌的DNA含量和超二倍体率明显高于直肠良性病变。高分化腺癌与良性病变间、各分化程度的腺癌间两者均无明显差异(表5)。
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表5 直肠肿瘤各病理类型之间DNA含量、二倍体/近二倍体和超二体率比较
组别
病理类型
例数
DNA含量
(±S)
二倍体/近二倍体
例数(DI≤1.1)
超二倍体例
数(DI>1.1)
1
, 百拇医药
良性病变
7
7.446±1.571
6
1
2
高分化腺癌
15
7.446±2.404
8
7
3
中分化腺癌
, 百拇医药
25
8.607±2.276
10
15
4
低分化腺癌
13
9.898±3.830
3
10
各组DNA含量的比较：1vs(2+3+4)：P>0.05,1vs2：P>0.05,1vs3：P<0.05,1vs4： P< 0.05,2vs3： P>0.05,2vs4：P>0.05,3vs4：P>0.05,各组超二倍体部分比率比较：同上
, 百拇医药
淋巴瘤ICM-DNA分析结果：(1)滤泡性淋巴瘤(FL)及反应性滤泡增生(RFH)中生发中心细胞(GCC)的DNA含量比较，纯滤泡性的滤泡性淋巴瘤(F)瘤细胞DNA含量显著高于RFH，但小裂为主型滤泡性淋巴瘤(FSCL)与RFH之间无显著差别。对各类型FL之间DNA含量比较分析，发现FL出现弥漫区域(F-D)后，瘤细胞DNA含量无显著改变，而细胞学分类对肿瘤细胞DNA含量差别却有明显影响，FSCL的DNA含量显著低于混合小裂和大细胞型(FML)及大细胞为主型(FLCL)，但FML与FLCL间差别无统计学意义(表6)。(2)将FL与RFH中超二倍体率作比较，66.7%的FL病例为超二倍体，而RFH中90.5%是二倍体或亚二倍体，统计学检验两者有显著差异。按类型分析，FML、FLCL出现超二倍体比率较高，FSCL的DNA含量均不超出二倍体(表7)。(3)其它类型NHL的肿瘤细胞DNA含量随恶性程度增高而增高，但无统计学价值。各类型霍奇金病之间DNA含量和二倍体率也无统计学意义。
表6 各类型FL肿瘤DNA含量的比较 类型
, 百拇医药
F
F-D
总计
FSCL
8.72±1.97
-
7.16±0.50
FML
9.76±1.89
8.25±1.65
9.00±0.42
FLCL
-
, 百拇医药
9.92±1.03
9.92±1.03
FSCLvsFML,P<0.05；FSCL vs FLCL,P<0.05;FML vs FLCL,P>0.05表7 RFH及各类型FL的二倍体/近二倍体和超二倍体率的比较
类型
二倍体或近二倍体数
超二倍体数
FSCL
4
0
FML
3
, 百拇医药
10
FLCL
0
4
RFH
19
2
3 讨论
肿瘤细胞DNA含量和倍体分析是肿瘤病理学研究中的重要内容，ICM是根据Feulgen染细胞核后的颜色深浅来确定其DNA的含量，它的要求是具有较高的吸光度测量精度，具有准确性和重复性[6]。我们采用DIPAS-200对500例肿瘤及其良性病变进行检测，对相同标本反复检测代表性细胞，结果相同，因此，认为该仪器测定DNA含量准确可靠，具有重复性。
, 百拇医药
本研究结果表明宫颈鳞癌、卵巢常见恶性肿瘤(浆液性或粘液性囊腺癌)、滤泡性淋巴瘤的DNA含量和超二倍体率均显著高于相应起源组织或良性肿瘤。ICM-DNA的这一特征可有助于恶性肿瘤的鉴别，特别是对一些交界性肿瘤和临床疑难病例的诊断可提供有价值的参考指标[7，8]。本研究中宫颈原位癌的DNA含量显著高于鳞状上皮和良性增生的乳头状瘤，原位癌的DNA含量普遍较高，甚至高于低分化鳞癌的含量。有文献报道在乳腺癌中，导管原位癌的DNA倍体为异倍体和四倍体，而浸润性导管癌可以是二倍体。宫颈原位癌可能有相似的情况，它的恶性细胞虽然尚局限于上皮内，但细胞本身表现高度活跃的增生状态。原位癌的这一特性为其与良性增生的鉴别提供了有力的依据和可靠的指标。另外在FL中肿瘤性GCC的DNA含量显著高于RFH淋巴结中的正常增生性GCC(P<0.001)。在FL细胞中超二倍体率为66.7%，而在RFH细胞中二倍体与亚二倍体占90.5%，两者差异显著，这符合也反应了这两种疾病的本质。按类型分析，FML、FLCL超二倍体率相对较高，而FSC较细胞DNA均不超出二倍体，提示在FL中，一旦出现大细胞成分后，DNA含量会有所增加，即肿瘤细胞增殖活性和恶性程度有所上升，这与大量研究发现的小细胞成分为主的FL的预后明显优于大细胞成分为主的FL的事实相符。因此这些检测对FL与RFH的鉴别和预后判断具有实用价值。有文献报道用ICM-DNA诊断宫颈良性上皮、原位癌和浸润性鳞癌，无一例假阳性，即特异性为100%，仅有一例为假阴性，敏感性为98.6%，同时对13例交界性病变进行了随访观察，结果是从细胞学ICM诊断到组织形态学上能诊断约需21个月[9]，因此，对这些病例通过ICMDNA检测可以预见其发展预后，由此可得到提前诊断和治疗。
, 百拇医药
但不同部位、不同起源的肿瘤并不具有相同的DNA演变规律。本研究中结直肠高分化腺癌与良性病变间DNA含量和倍体无显著差异，各种类型甲状腺癌的DNA含量和DNA倍体均与正常甲状腺滤泡上皮和良性肿瘤也无显著差别，这表明在甲状腺癌中DNA并不呈活跃增生，这一现象与甲状腺癌的镜下和临床特征相一致，甲状腺癌在显微镜下常表现为细胞均匀一致，最为常见的乳头状腺癌癌细胞核通常淡染，呈毛玻璃样。甲状腺癌生长缓慢，侵袭性低，预后好。ICM-DNA分析甲状腺肿瘤虽不足于用来鉴别良恶性病变，但它反映了这类肿瘤的生物学特性。因此，作ICM-DNA时必须结合肿瘤部位，综合其它指标才能作出正确判断。
DNA含量和DNA倍体特征与某些恶性肿瘤的分化状态有关。本研究显示了乳腺浸润性导管癌、宫颈鳞癌、直肠腺癌的分化程度越低，DNA含量均越高，超二倍体率也越高。因此，DNA含量和倍体特征可作为恶性肿瘤病理分级的客观指标之一。本研究还仔细观察了每个病例的DNA含量，发现相同级别的恶性肿瘤之间DNA含量差异很大，而不同级别的恶性肿瘤之间DNA含量常有重叠，有时在高分化的病例中DNA含量较高，而在有的低分化病例中DNA含量并不高。那么DNA含量及其倍体特征是否与肿瘤的生物学行为、患者的预后、治疗反应有关呢?有些文献已肯定了这一价值，Alanen[10]报道ICM显示非整倍体的乳腺癌绝大部分预后较差，Boiko[1]报道DNA含量与治疗反应有关，治疗后DNA含量小于治疗前，有反应者小于无反应者。对于本研究中的肿瘤是否具有相同的特征，需要进一步研究证实。由于组织病理学的评价和分级不能确切提供癌症的进展情况，发掘ICM-DNA在这些方面的应用价值具有重要意义。
, 百拇医药
由上可见，ICM-DNA能客观地并在定量水平上分析肿瘤，包括诊断、鉴别诊断、生物学行为、预后、治疗反应等。但是肿瘤的发生、发展是复杂的，尚存在许多不可知的因素，在作ICM-DNA分析时最好做到如下结合：(1)肿瘤组织结构异型性和肿瘤细胞形态异型性与定量参数有机结合，以提高测量和分析结果的准确性和灵敏度；(2)与FCM测量相结合，使细胞的DNA含量和DNA倍体的结果和临床意义更加明确[9]；(3)与有关免疫组化结果结合分析，可以提高检测真正恶性肿瘤或癌前病变的敏感性[7]。本研究中对FL和RFH同时作了bcl-2蛋白的免疫组经标记，结果表明ICM-DNA和bcl-2标记对鉴别FL与RFH可起相互补充的作用。
参考文献
1 Boiko IV,Mitchell MF,Pandey DK,et al.DNA image cytometric measurement as a surrogate end point biomarker in a phase I trial of alpha-difluoromethylornithine for cervical intraepithelial neoplasia [J] .Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,1997,6(10)：849～855.
, 百拇医药
2 Bocking A,Chatelain R. Diagnostic and prognostic value of DNA cytometry in gynecologic cytology [J] .Anal Quant Cytol Histol,1989,11(3)：177～186.
3 Ahlgren G, Lindholm,Falkmer U,et al.A DNA cytometric proliferation index improves the value of the DNA ploidy pattern as a prognosticating tool in patients with carcinoma of the prostate [J] .Urology,1997， 50(3)：379～384.
4 Ishikuro A, Dosaka-Akita H, Kato M,et al. Ki-67 labeling indices in non-small cell lung cancer：comparison between image cytometry and flow cytometry [J] . Cytometry,1997， 30(4)：186～ 191.
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5 Marcos B,Gonzalez-Ageitos A, Garcia R,et al.Correlation of flow and static cytometry;their application to the study of anaplastic lymphomas [J] .Sangre(Barc),1998,43(1)：25～ 29.
6 夏潮涌.肿瘤细胞核DNA含量测定与倍体分析的现状[J].中华病理学杂志，1996，25(3)：182～184.
7 Munck-Wikland E,Kuylenstierna R, Lindholm J, et al. p53 immunostaining and image cytometry DNA analysis in precancerous and cancerous squmous epithelial lesions of the larynx [J] .Head Neck,1997,19(2)：107～115.
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8 Kiehl P, Vakilzadeh F,Richter K,et al. Identification of aneuploidy in recurrent clear cell hidradenoma by DNA image cytometry (ICM-DNA) [J] .J Cutan Pathol,1997,24：314～321.
9 Blocking A,Hilgarth M, Auffermann W, et al.DNA-cytometric diagnosis of prospective malignancy in borderline lesions of the uterine cervix [J] .Acta Cytol,1986,30(6)：608～615.
10 Alanen KA, Lintu M, Joensuu H.Image cytometry of breast carcinomas that are DNA diploid by flow cytometry：time to revise the concept of DNA diploid?[J] .Anal Quant Cytol Histol,1998,20(3)：178～ 186.
收稿日期：1999-03-22；, 百拇医药
单位：上海医科大学肿瘤医院分子病理研究室(上海，200032)周晓燕,通讯作者
关键词：ICM-DNA；肿瘤
癌症990408
【摘要】目的：观察各种恶性肿瘤及相应良性病变中DNA含量及倍体的变化，分析其对诊断、分级和预后判断的价值。方法：利用DIPAS-200生物图像处理分析系统，对常见恶性肿瘤及其良性病变共500例作ICM-DNA分析研究。结果：(1)宫颈鳞癌、卵巢常见恶性肿瘤(浆液性及粘液性囊腺癌)、滤泡性淋巴瘤的DNA含量和超二倍体率均显著高于相应起源组织或良性肿瘤；(2)结直肠高分化腺癌与良性病变之间、各种类型甲状腺癌与正常甲状腺滤泡上皮和良性肿瘤之间的DNA含量和倍体无显著差异；(3)乳腺浸润性导管癌、宫颈鳞癌、结直肠腺癌的分化程度越低，DNA含量均越高，超二倍体率也越高。结论：ICM-DNA检测能在定量水平分析肿瘤，可有助于良恶性肿瘤的鉴别，特别是对一些交界性肿瘤和临床疑难病例的诊断可提供有价值的参考指标，DNA含量和DNA倍体特征与某些恶性肿瘤的分化状态有关。
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中图分类号：R735.1 文献标识码：A 文章编号：1000X(1999)04-0385-04
Studies on ICM-DNA analysis of 500 cases of benign and malignant tumors
XU Liang-zhong, ZHOU Xiao-yan, YANG Wen-tao, et al.
Department of Molecular Pathologgy,Cancer Hospital,Shanghai Medical University, Shanghai 200032,P.R.China
【Abstract】 Objective：To analyze DNA content and the ratio of hyperdiploid and their value in diagnosis and prognosis of malignant tumors and benign lesions. Methods：DNA image cytometry (ICM-DNA) was applied to analyze 500 cases of malignant tumors and corresponding benign lesions.Results：(1)DNA contents and the ratio of hyperdiploid were higher in cervical squamous carcinoma, serous and mucinous ovarian cystadenocarcinoma and follicular lymphoma than those of their corresponding original tissues or benign lesions.(2)No significant difference in DNA contents and the ratio of hyperdiploid was found between well differentiated colon or rectum adenocarcinoma and benign lesions and between all types of thyroid carcinoma and normal thyroid follicular epithelium or benign tumors.(3) In invasive breast ductal carcinoma, cervical squamous carcinoma and colon or rectum carcinoma,the lower differentiation, the higher DNA contents and the ratio of hyperdiploid were found. Conclusions：DNA quantitation can be analyzed using ICM-DNA.ICM-DNA is helpful in differentiating malignancy and benignity.It can especially provide valuable reference indices for differentiation in some borderline neoplasms and difficult cases.DNA contents and the characteristics of the DNA ploidy are associated with the degree of differentiation in some malignant neoplasms.
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Key words：ICM-DNA;Neoplasm
目前，恶性肿瘤的病理诊断主要依靠形态学，其预后根据病理类型、分级及临床分期来判断。但这些指标缺乏定量概念，一方面不利于对疾病本质的认识，另一方面各个观察者之间常存在一定的偏差，交流不方便，而且一些交界性疾病的诊断和预后判断常常较为困难。
目前的研究资料表明肿瘤细胞DNA非整倍体是恶性肿瘤的特征性标志之一。测量和分析细胞核DNA含量与倍体对恶性肿瘤的病理诊断、恶性程度的判断、疗效估计、预测预后均具有重要价值[1，2，3]。流式细胞术(flow cytometry,FCM)和细胞图像测量术(image cytometry,ICM)是测量和分析肿瘤细胞的DNA含量和倍体的两种主要方法，两者的检测结果相似或具有相关性[4，5]。ICM能在显微镜下准确地选择本切片中具有代表性的肿瘤细胞，细胞数量可多可少，还可测量细胞核面积和某些形状因子，并具有检测简单、操作客观、重复性好等优点，因此，近年来ICM-DNA技术得到了飞速的发展。本研究利用DIPAS-200生物图像处理分析系统，对常见恶性肿瘤及其良性病变共500例作ICM-DNA分析研究，旨在：(1)观察各种肿瘤及其良恶性病变中有关指标的客观数据；(2)分析各指标对诊断、分级和预后判断的价值。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 病理标本及切片制作
收集上海医科大学肿瘤医院病理科存档蜡块，包括各种类型淋巴瘤及反应性滤泡增生200例，乳腺肿瘤100例，宫颈鳞状上皮及良恶性肿瘤48例，卵巢肿瘤40例，甲状腺肿瘤及正常甲状腺组织52例，结直肠肿瘤60例。每例作4μm厚切片2张，一张作HE染色，用以明确诊断及对照观察，另一张作细胞核DNAFeulgen染色，用于ICM分析。
1.2 使用仪器
DIPAS-200生物图像处理分析系统(定诚生物图像科技有限公司研制)。
1.3 主要操作步骤
1.3.1 调整仪器：调节稳压稳流电源及摄像机的对比度。
, 百拇医药
1.3.2 设定基准：选定同批染色切片中小淋巴细胞或肿瘤起源组织细胞为二倍体参照细胞，在系统220的基准值下测定其吸光光密度，所得的值乘参考矫正系数1.2，作为本组实验的二倍体基准。
1.3.3 采集图像：选择肿瘤代表性的高倍视野(×40)冻结图像。
1.3.4 二值化：处理分析系统对细胞图像进行二值化处理，如果细胞选不上，将二值化值作一定比例的提高，分析时将基准值相应的提高。
1.3.5 待测细胞的选择：在体现分类分型特征的前提下，采取随机的原则每例选择代表性的细胞100个，大约10个视野左右。
1.3.6 分析计算输出结果，输出指标包括：平均DNA含量，DNA指数，DNA直方图(二倍体、异倍体)，积分光密度的平均值(IOD)，核面积、周长、形状因子等。
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1.4 统计方法
计量资料之间的比较用t检验，计数资料之间的比较用χ2检验，各类型滤泡性淋巴瘤(FL)之间DNA含量比较采用析因分析。
2 结果
本研究分析各检测病例的原始数据，主要选取了DNA含量这一最为重要的数据，并根据二倍体基准值推算各病例的DNA倍体情况，对有关病例分析统计。结果如下：
卵巢肿瘤中最常见的恶性肿瘤(浆液性或粘液性囊腺癌)的DNA含量和超二倍体率高于常见良性肿瘤(浆液性或粘液性囊腺瘤)，低分化腺癌的DNA含量和超二倍体率显著高于良性肿瘤。卵巢的其它恶性肿瘤也有较高的DNA含量，并可表现为超二倍体，但因收集的例数较少，未做统计。良性肿瘤与中分化腺癌、中低分化腺癌之间DNA含量和超二倍体率无显著差异(表1)。
, http://www.100md.com 表1 卵巢肿瘤各病理类型之间DNA含量、二倍体/近二倍体和超二倍体率比较 组别
病理类型
总例数
DNA含量
(
±S)二倍体/近二倍体
例数(DI≤1.1)
超二倍体例
数(DI>1.1)
1
囊腺瘤
, http://www.100md.com
4
7.38±1.678
2
2
2
中分化腺癌
11
8.894±1.304
1
10
3
低分化腺癌
14
, 百拇医药
11.49±2.51
2
12
4
透明细胞癌
2
0
2
5
内胚窦癌
2
0
2
6
, http://www.100md.com
胚胎性癌
1
0
1
7
粒层细胞瘤
2
1
1
8
卵泡膜细胞瘤
2
0
2
, 百拇医药
9
恶性纤维上皮瘤
1
0
1
10
恶性中胚叶混合瘤
1
1
0
1，2，3组DNA含量的比较：1vs(2+3)：P<0.05，1vs2：P>0.05，1vs3：P<0.05，2vs3：P>0.05
1，2，3组超二倍体率比较：1vs(2+3)：P<0.05,1vs2：P>0.05，1vs3：P<0.05，2vs3：P>0.05
, http://www.100md.com
浸润性导管癌是乳腺癌中最常见的类型，不同级别的浸润性导管癌DNA含量之间有显著差异，级别越高，即分化越差，其DNA含量越高，超二倍体肿瘤的比率也越高(表2)。其他类型的乳腺癌及良性肿瘤因病例数较少，未作统计。
表2 不同级别浸润性导管癌DNA含量、二倍体/近二倍体和超二倍体率的比较 分级
例数
DNA含量
(
±S)二倍体/近二倍体
例数(DI≤1.1)
超二倍体例
, http://www.100md.com
数(DI>1.1)
G1
22
8.26±2.17
8(36.4)
14(63.6)
G2
40
9.79±2.45
8(20)
32(80)
G3
27
, 百拇医药
14.43±3.17
1(3.7)
26(96.3)
各级别DNA含量和超二倍体比较：G1vsG2,G1vsG3,G2vsG3,P值均小于0.05
宫颈正常鳞状上皮及其良恶性肿瘤的DNA含量及超二倍体率分析比较，其结果是(1)正常鳞状上皮与乳头状瘤DNA含量无显著差异；(2)原位癌和鳞癌的DNA含量和超二倍体率均高于正常鳞状上皮和乳头状瘤；(3)原位癌的DNA含量和超二倍体率与浸润性鳞癌无显著性差别；(4)原位癌、Ⅰ、Ⅱ级鳞癌的DNA含量低于Ⅲ级鳞癌，而二倍体率未显示差异(表3，表4)。
表3 宫颈鳞状上皮及其良恶性肿瘤DNA含量、二倍体/近二倍体和超二倍体率的比较 组别
, 百拇医药 病理类型
例数
DNA含量
(
±S)二倍体/近二倍体
例数(DI≤1.1)
超二倍体例
数(DI>1.1)
1
正常鳞状上皮
7
5.07±0.74
, 百拇医药
7
0
2
乳头状瘤
3
6.21±2.07
3
0
3
原位癌
11
9.97±5.68
3
, 百拇医药 8
4
鳞癌
23
9.58±3.02
9
14
各组DNA含量和超二倍体率的比较：1vs2：P>0.05,1vs3：P<0.05，1vs4：P<0.05，2vs3：P<0.05，2vs4：P<0.05，3vs4：P>0.05表4 各级别鳞癌间DNA含量二倍体/近二倍体和超二倍体率的比较 组别
病理类型
例数
, http://www.100md.com DNA含量
(
±S)二倍体/近二倍体
例数(DI≤1.1)
超二倍体例
数(DI>1.1)
1
原位癌
11
9.58±3.02
3
8
, 百拇医药
2
Ⅰ
7
6.69±2.12
5
2
3
Ⅱ
8
8.10±1.64
3
4
4
Ⅲ
, 百拇医药
8
4.83±7.33
1
7
各组DNA含量的比较：1vs2、3：P>0.05,2vs3：P>0.05,1、2、3vs4：P<0.05。各组超二倍体率的比较无显著差异。
各种类型的甲状腺肿瘤共52例(包括腺瘤、乳头状腺癌、滤泡性癌、髓样癌)，各类型间DNA含量和超二倍体率无显著差异，乳头状腺癌是最常见的恶性肿瘤，其DNA含量反而比良性腺瘤的DNA值为低。甲状腺和淋巴结转移性乳头状腺癌的DNA含量及超二倍体率亦无差异。
直肠中、低分化腺癌的DNA含量和超二倍体率明显高于直肠良性病变。高分化腺癌与良性病变间、各分化程度的腺癌间两者均无明显差异(表5)。
, http://www.100md.com
表5 直肠肿瘤各病理类型之间DNA含量、二倍体/近二倍体和超二体率比较
组别
病理类型
例数
DNA含量
(
±S)二倍体/近二倍体
例数(DI≤1.1)
超二倍体例
数(DI>1.1)
1
, 百拇医药
良性病变
7
7.446±1.571
6
1
2
高分化腺癌
15
7.446±2.404
8
7
3
中分化腺癌
, 百拇医药
25
8.607±2.276
10
15
4
低分化腺癌
13
9.898±3.830
3
10
各组DNA含量的比较：1vs(2+3+4)：P>0.05,1vs2：P>0.05,1vs3：P<0.05,1vs4： P< 0.05,2vs3： P>0.05,2vs4：P>0.05,3vs4：P>0.05,各组超二倍体部分比率比较：同上
, 百拇医药
淋巴瘤ICM-DNA分析结果：(1)滤泡性淋巴瘤(FL)及反应性滤泡增生(RFH)中生发中心细胞(GCC)的DNA含量比较，纯滤泡性的滤泡性淋巴瘤(F)瘤细胞DNA含量显著高于RFH，但小裂为主型滤泡性淋巴瘤(FSCL)与RFH之间无显著差别。对各类型FL之间DNA含量比较分析，发现FL出现弥漫区域(F-D)后，瘤细胞DNA含量无显著改变，而细胞学分类对肿瘤细胞DNA含量差别却有明显影响，FSCL的DNA含量显著低于混合小裂和大细胞型(FML)及大细胞为主型(FLCL)，但FML与FLCL间差别无统计学意义(表6)。(2)将FL与RFH中超二倍体率作比较，66.7%的FL病例为超二倍体，而RFH中90.5%是二倍体或亚二倍体，统计学检验两者有显著差异。按类型分析，FML、FLCL出现超二倍体比率较高，FSCL的DNA含量均不超出二倍体(表7)。(3)其它类型NHL的肿瘤细胞DNA含量随恶性程度增高而增高，但无统计学价值。各类型霍奇金病之间DNA含量和二倍体率也无统计学意义。
表6 各类型FL肿瘤DNA含量的比较 类型
, 百拇医药
F
F-D
总计
FSCL
8.72±1.97
-
7.16±0.50
FML
9.76±1.89
8.25±1.65
9.00±0.42
FLCL
-
, 百拇医药
9.92±1.03
9.92±1.03
FSCLvsFML,P<0.05；FSCL vs FLCL,P<0.05;FML vs FLCL,P>0.05表7 RFH及各类型FL的二倍体/近二倍体和超二倍体率的比较
类型
二倍体或近二倍体数
超二倍体数
FSCL
4
0
FML
3
, 百拇医药
10
FLCL
0
4
RFH
19
2
3 讨论
肿瘤细胞DNA含量和倍体分析是肿瘤病理学研究中的重要内容，ICM是根据Feulgen染细胞核后的颜色深浅来确定其DNA的含量，它的要求是具有较高的吸光度测量精度，具有准确性和重复性[6]。我们采用DIPAS-200对500例肿瘤及其良性病变进行检测，对相同标本反复检测代表性细胞，结果相同，因此，认为该仪器测定DNA含量准确可靠，具有重复性。
, 百拇医药
本研究结果表明宫颈鳞癌、卵巢常见恶性肿瘤(浆液性或粘液性囊腺癌)、滤泡性淋巴瘤的DNA含量和超二倍体率均显著高于相应起源组织或良性肿瘤。ICM-DNA的这一特征可有助于恶性肿瘤的鉴别，特别是对一些交界性肿瘤和临床疑难病例的诊断可提供有价值的参考指标[7，8]。本研究中宫颈原位癌的DNA含量显著高于鳞状上皮和良性增生的乳头状瘤，原位癌的DNA含量普遍较高，甚至高于低分化鳞癌的含量。有文献报道在乳腺癌中，导管原位癌的DNA倍体为异倍体和四倍体，而浸润性导管癌可以是二倍体。宫颈原位癌可能有相似的情况，它的恶性细胞虽然尚局限于上皮内，但细胞本身表现高度活跃的增生状态。原位癌的这一特性为其与良性增生的鉴别提供了有力的依据和可靠的指标。另外在FL中肿瘤性GCC的DNA含量显著高于RFH淋巴结中的正常增生性GCC(P<0.001)。在FL细胞中超二倍体率为66.7%，而在RFH细胞中二倍体与亚二倍体占90.5%，两者差异显著，这符合也反应了这两种疾病的本质。按类型分析，FML、FLCL超二倍体率相对较高，而FSC较细胞DNA均不超出二倍体，提示在FL中，一旦出现大细胞成分后，DNA含量会有所增加，即肿瘤细胞增殖活性和恶性程度有所上升，这与大量研究发现的小细胞成分为主的FL的预后明显优于大细胞成分为主的FL的事实相符。因此这些检测对FL与RFH的鉴别和预后判断具有实用价值。有文献报道用ICM-DNA诊断宫颈良性上皮、原位癌和浸润性鳞癌，无一例假阳性，即特异性为100%，仅有一例为假阴性，敏感性为98.6%，同时对13例交界性病变进行了随访观察，结果是从细胞学ICM诊断到组织形态学上能诊断约需21个月[9]，因此，对这些病例通过ICMDNA检测可以预见其发展预后，由此可得到提前诊断和治疗。
, 百拇医药
但不同部位、不同起源的肿瘤并不具有相同的DNA演变规律。本研究中结直肠高分化腺癌与良性病变间DNA含量和倍体无显著差异，各种类型甲状腺癌的DNA含量和DNA倍体均与正常甲状腺滤泡上皮和良性肿瘤也无显著差别，这表明在甲状腺癌中DNA并不呈活跃增生，这一现象与甲状腺癌的镜下和临床特征相一致，甲状腺癌在显微镜下常表现为细胞均匀一致，最为常见的乳头状腺癌癌细胞核通常淡染，呈毛玻璃样。甲状腺癌生长缓慢，侵袭性低，预后好。ICM-DNA分析甲状腺肿瘤虽不足于用来鉴别良恶性病变，但它反映了这类肿瘤的生物学特性。因此，作ICM-DNA时必须结合肿瘤部位，综合其它指标才能作出正确判断。
DNA含量和DNA倍体特征与某些恶性肿瘤的分化状态有关。本研究显示了乳腺浸润性导管癌、宫颈鳞癌、直肠腺癌的分化程度越低，DNA含量均越高，超二倍体率也越高。因此，DNA含量和倍体特征可作为恶性肿瘤病理分级的客观指标之一。本研究还仔细观察了每个病例的DNA含量，发现相同级别的恶性肿瘤之间DNA含量差异很大，而不同级别的恶性肿瘤之间DNA含量常有重叠，有时在高分化的病例中DNA含量较高，而在有的低分化病例中DNA含量并不高。那么DNA含量及其倍体特征是否与肿瘤的生物学行为、患者的预后、治疗反应有关呢?有些文献已肯定了这一价值，Alanen[10]报道ICM显示非整倍体的乳腺癌绝大部分预后较差，Boiko[1]报道DNA含量与治疗反应有关，治疗后DNA含量小于治疗前，有反应者小于无反应者。对于本研究中的肿瘤是否具有相同的特征，需要进一步研究证实。由于组织病理学的评价和分级不能确切提供癌症的进展情况，发掘ICM-DNA在这些方面的应用价值具有重要意义。
, 百拇医药
由上可见，ICM-DNA能客观地并在定量水平上分析肿瘤，包括诊断、鉴别诊断、生物学行为、预后、治疗反应等。但是肿瘤的发生、发展是复杂的，尚存在许多不可知的因素，在作ICM-DNA分析时最好做到如下结合：(1)肿瘤组织结构异型性和肿瘤细胞形态异型性与定量参数有机结合，以提高测量和分析结果的准确性和灵敏度；(2)与FCM测量相结合，使细胞的DNA含量和DNA倍体的结果和临床意义更加明确[9]；(3)与有关免疫组化结果结合分析，可以提高检测真正恶性肿瘤或癌前病变的敏感性[7]。本研究中对FL和RFH同时作了bcl-2蛋白的免疫组经标记，结果表明ICM-DNA和bcl-2标记对鉴别FL与RFH可起相互补充的作用。
参考文献
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7 Munck-Wikland E,Kuylenstierna R, Lindholm J, et al. p53 immunostaining and image cytometry DNA analysis in precancerous and cancerous squmous epithelial lesions of the larynx [J] .Head Neck,1997,19(2)：107～115.
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8 Kiehl P, Vakilzadeh F,Richter K,et al. Identification of aneuploidy in recurrent clear cell hidradenoma by DNA image cytometry (ICM-DNA) [J] .J Cutan Pathol,1997,24：314～321.
9 Blocking A,Hilgarth M, Auffermann W, et al.DNA-cytometric diagnosis of prospective malignancy in borderline lesions of the uterine cervix [J] .Acta Cytol,1986,30(6)：608～615.
10 Alanen KA, Lintu M, Joensuu H.Image cytometry of breast carcinomas that are DNA diploid by flow cytometry：time to revise the concept of DNA diploid?[J] .Anal Quant Cytol Histol,1998,20(3)：178～ 186.
收稿日期：1999-03-22；, 百拇医药