癌基因c-erbB-2特异性核酶对胃癌细胞恶性表型的逆转
作者：毕锋 张学庸 惠宏襄 王成济 陈峥 樊代明
单位：710032 西安，第四军医大学附属西京医院全军消化疾病研究所(毕锋、张学庸、陈峥、樊代明)，生化教研室(惠宏襄、王成济)
关键词：基 因，erbB-2类；核酶；胃肿瘤；基因疗法
中华医学杂志/990423 【摘要】 目的 探讨c-erbB-2 特异性核酶对胃癌细胞恶性表型的影响。方法 根据计算机设计的人癌基因c-erbB-2 特异性核酶RZ1，合成RZ1基因并构建其真核表达载体pDOR-RZ1，在Lipofect AMINETM的介导下转染胃癌细胞SGC-7901。流式细胞仪分析转染的胃癌细胞c-erbB-2产物P185的表达。在裸鼠体内观察转染胃癌细胞的致瘤性。结果 在Lipofect AMINETM的介导下pDOR-RZ1成功地转染了胃癌细胞SGC-7901，经G418筛选出单克隆并称为SGC/RZ1。其蛋白产物P185的表达率被抑制达62.7%；生长速度被抑制达55%；在裸鼠体内的成瘤时间明显延迟，所成肿瘤的体积亦较对照组明显为小，表明其致瘤性明显减弱。结论 c-erbB-2 特异性核酶RZ1对胃癌细胞的恶性表型有明显逆转作用。为胃癌的基因治疗提供了一个新的选择。
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Reversion of the malignant phenotype of gastric cancer by c-erbB-2 specific ribozyme BI Feng*, ZHANG Xueyong , HUI Hongxiang, et al. * Institute of Digestive Diseases of PLA, Fourth Military Medical University, Xi′an 710032
【Abstract】 Objective To probe the effect of c-erbB-2 specific ribozyme to the malignant phenotype of gastric cancer. Methods The eucaryotic expresion vector of c-erbB-2 specific ribozyme RZ1 was designed by computer and named pDOR-RZ1.The transfection of the gastric cancer cell line SGC-7901 was mediated by Lipofect AMINETM .Flow cytometry was used to analyse the expression of the c-erbB-2 product P185. In vivo study of tumorogenecity of the transfected cells was performed in nude mice. Results pDOR-RZ1 was successfully transfected into the gastric cancer cell line SGC-7901 and then the single clones were selected by G418 and named SGC/RZ1. Flow cytometry analysis showed that the expression of P185 was suppressed by 62.7%. The growth rate of SGC/RZ1 was inhibited by 55%. The tumor-forming time in SGC/RZ1 in nude mice was delayed remarkably and the tumor size was also much smaller than that in the control group, indicating the inhibition of the tumorogenecity of SGC/RZ1 in nude mice. Conclusion c-erbB-2 specific ribozyme is very efficient in reversing the malignant phenotype of gastric cancer. This might provide a new approach for gene therapy of gastric cancer.
, 百拇医药
【Key words】 Genes, erbB-2 Ribozymes Stomech neoplasms Gene therapy
(Natl Med J China, 1999, 79：295-297)
c-erbB-2原癌基因的产物是一种跨膜生长因子受体，在某些肿瘤细胞间的信号传递中起着重要作用。 已发现该基因的扩增或蛋白的过度表达与乳腺癌、胃癌等多种肿瘤的发生、发展、转移及预后密切相关[1，2]。核酶(ribozyme)是具有特异性切割核酸分子作用的RNA。核酶的发现不仅为病毒性疾病的治疗带来了希望, 也为肿瘤的基因治疗提供了新的武器[3，4]。我们选择了在胃癌中高表达的c-erbB-2 mRNA作为靶分子，在体外合成并构建了核酶RZ1基因的真核表达载体，探讨其对胃癌细胞恶性表型的影响。
材料和方法
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一、材料
1.细胞系及实验动物：人胃癌细胞系SGC-7901由军事医学科学院毒物药物研究所引入； BALB/c 裸小鼠由上海肿瘤研究所提供，本校动物实验中心饲养。
2.试剂：鼠抗人c-neu单克隆抗体为北京中山生物技术公司产品；RPMI 1640、Opti-MEM、脂质体LipofectAMINETM为美国Gibco公司产品；G418为美国Sigma公司产品。
二、方法
1.核酶真核表达载体的构建及鉴定：根据计算机设计的人癌基因c-erbB-2特异性核酶RZ1，合成RZ1[5]，合成RZ1基因后测序鉴定，构建其真核表达载体pDOR-RZ1，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
2.Lipofect AMINETM介导的SGC-7901细胞转染 实验设3组：重组载体pDOR-RZ1；对照组用空载体pDOR-Neo质粒；空白组为未加质粒的SGC-7901细胞，具体步骤按试剂说明书进行；最后加入G418 400 μg/ml筛选3周，挑选单细胞克隆，扩大培养。
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3.细胞生长速度测定：在24孔培养板中，每孔接种3×104个细胞，每份3个复孔，每天收集细胞一次，连续计数12天，计算出均值和标准差，绘制出生长曲线。
4.裸鼠体内移植生长试验：试验分3组，每组5只裸鼠，SGC/RZ1、SGC/Neo和SGC-7901细胞分别以5×106细胞数接种于3组裸小鼠背部皮下，每只裸鼠接种1处，连续观察4周，记录一般情况、成瘤时间及瘤体大小变化。
结果
1.胃癌细胞SGC-7901转染：pDOR-RZ1、pDOR-neo在阳离子质脂体Lipofect AMINETM的介导下成功地转染了胃癌细胞SGC7901，经G418筛选3周后选出单克隆，分别命名为SGC/RZ1和SGC/ Neo。
2.转染胃癌细胞P185的表达：流式细胞仪检测SGC-7901细胞和两组转染后的细胞P185的表达结果显示，以SGC/RZ1的表达率最低，其P185的表达率被抑制达62.7%(图1)。
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A. SGC-7901 (63.2%) B. SGC/neo (58.3%) C. SGC/RZ1 (23.6%)
图1 转染胃癌细胞P185的表达
3.转染胃癌细胞生长速度测定：根据细胞计算的均值和标准差绘制出生长曲线。由图2可以看出，转染胃癌细胞SGC/RZ1的生长速度较对照组SGC-7901明显减慢，在第5天时抑制率为72.8%，第12天时抑制率为55.5%。而SGC/neo的生长速度较亲本细胞SGC7901无明显差别。
图2 转染胃癌细胞生长速度测定
4.转染胃癌细胞裸鼠体内抑瘤试验：3组细胞致瘤性试验发现，SGC/RZ1的裸鼠成瘤时间明显延迟，所成肿瘤的体积亦较对照组明显为小，表明其致瘤性明显减弱，而对照组的致瘤性未受影响(表1)
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表1 转染胃癌细胞裸鼠体内抑瘤试验 分组
鼠数
(只)
成瘤时间
肿瘤直径大小
平均值(cm，
±s)
2周
3周
4周
SGC/7901
5
, http://www.100md.com 5/5
5/5
5/5
2.0±0.5
SGC/neo
5
5/5
5/5
5/5
2.1±0.5
SGC/RZ1
5
0/5
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1/5
4/5
0.6±0.3*
注：与SGC-7901和SGC/Neo组相比，P均<0.01
讨论
原癌基因的激活和抑癌基因的缺失和突变可能是肿瘤产生的机理之一。因此，阻断癌基因的表达成了基因治疗中 活跃的研究领域。自核酶发现后,有些学者曾尝试将其应用于肿瘤的基因治疗[6，7]。取得了比反义核酸更有效的作用。其中Koizumi等[8]设计的针对c-Ha-ras第12位突变子密码子的核酶 仅切割突变株而不切割野生株,说明了核酶作用的高度特异性和有效性。
靶基因的选择也很重要。我们在复习文献的基础上发现在c-erbB-2胃腺癌中表达率很高，与胃癌的发生、转移以及预后关系非常密切[2，9，10]，因此，选择其为靶基因。我们的实验结果也证实了这一点。在胃癌细胞转染pDOR-RZ1的瞬时表达时也看到胃癌细胞的大量死亡，稳定表达克隆的生长速率被明显抑制，裸鼠体内致瘤性也明显下降。这些结果均说明了c-erbB-2特异性核酶对胃癌细胞的恶性表型有明显的抑制作用，从而有可能为胃癌的基因治疗提供一个新的选择。
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本课题为国家自然科学基金资助项目(39500066)
参考文献
[1] Allred DC, Clark GM, Molina R, et al. Overexpression of HER-2/neu and its relationship with other prognostic factors change during the progression of in situ to invasive breast cancer. Hum Pathol，1992，23: 974-979.
[2] Mizutani T, Onda M, Tokunaga A, et al. Relationship of C-erbB-2 protein expression and gene amplification to invasion and metastasis in human gastric cancer. Cancer，1993，72:2083-2088.
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[3] Sarver N, Cantin EM, Chang PS, et al. Ribozymes as potential anti-HIV-1 therapeutic agents. Science, 1990, 247:1222-1225.
[4] Feng M, Cabrera G, Deshane J, et al. Neoplastic reversion accomplished by high efficiency adenoviral-mediated delivery of an anti-ras ribozyme. Cancer Res，1995, 55:2024～2028.
[5] 毕锋, 张学庸, 樊代明等. 抗 c-erbB-2 Ribozyme 的计算机设计.第四军医大学学报，1997, 18:6-9.
[6] Snyder DS,Wu Y,Wang JL, et al.Ribozyme-mediated inhibition of bcr-abl gene expression in a philadelphia chromosome-positive cell line.Blood ，1993，82:600-605.
, 百拇医药
[7] Kashani S M,Funato T,Florenes VA, et al.Suppression of the neoplastic phenotype in vivo by an anti-ras ribozyme.Cancer Res，1994，54:900-902.
[8] Koizumi M,Kamiya H，Ohtsuka E.Ribozymes designed to inhibit transformation of NIH3T3 cells by the activated c-Ha-ras gene. Gene，1992，117:179-184.
[9] Chiu KY,Loke SL，Ho FC.Immunohistochemical demonstration of c-erbB-2 oncoprotein in gastric adenocarcinoma:comparison of cryostat and paraffin wax sections and effect of fixation. J Clin Pathol，1994，47:117-121.
[10] Lee HR,Kim JH,Uhm HD，et al.Overexpression of c-ErbB-2 protein in gastric cancer by immunohistochemical stain.Oncology,1996，53:192-197.
(收稿：1998-05-08 修回：1998-12-09), 百拇医药
单位：710032 西安，第四军医大学附属西京医院全军消化疾病研究所(毕锋、张学庸、陈峥、樊代明)，生化教研室(惠宏襄、王成济)
关键词：基 因，erbB-2类；核酶；胃肿瘤；基因疗法
中华医学杂志/990423 【摘要】 目的 探讨c-erbB-2 特异性核酶对胃癌细胞恶性表型的影响。方法 根据计算机设计的人癌基因c-erbB-2 特异性核酶RZ1，合成RZ1基因并构建其真核表达载体pDOR-RZ1，在Lipofect AMINETM的介导下转染胃癌细胞SGC-7901。流式细胞仪分析转染的胃癌细胞c-erbB-2产物P185的表达。在裸鼠体内观察转染胃癌细胞的致瘤性。结果 在Lipofect AMINETM的介导下pDOR-RZ1成功地转染了胃癌细胞SGC-7901，经G418筛选出单克隆并称为SGC/RZ1。其蛋白产物P185的表达率被抑制达62.7%；生长速度被抑制达55%；在裸鼠体内的成瘤时间明显延迟，所成肿瘤的体积亦较对照组明显为小，表明其致瘤性明显减弱。结论 c-erbB-2 特异性核酶RZ1对胃癌细胞的恶性表型有明显逆转作用。为胃癌的基因治疗提供了一个新的选择。
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Reversion of the malignant phenotype of gastric cancer by c-erbB-2 specific ribozyme BI Feng*, ZHANG Xueyong , HUI Hongxiang, et al. * Institute of Digestive Diseases of PLA, Fourth Military Medical University, Xi′an 710032
【Abstract】 Objective To probe the effect of c-erbB-2 specific ribozyme to the malignant phenotype of gastric cancer. Methods The eucaryotic expresion vector of c-erbB-2 specific ribozyme RZ1 was designed by computer and named pDOR-RZ1.The transfection of the gastric cancer cell line SGC-7901 was mediated by Lipofect AMINETM .Flow cytometry was used to analyse the expression of the c-erbB-2 product P185. In vivo study of tumorogenecity of the transfected cells was performed in nude mice. Results pDOR-RZ1 was successfully transfected into the gastric cancer cell line SGC-7901 and then the single clones were selected by G418 and named SGC/RZ1. Flow cytometry analysis showed that the expression of P185 was suppressed by 62.7%. The growth rate of SGC/RZ1 was inhibited by 55%. The tumor-forming time in SGC/RZ1 in nude mice was delayed remarkably and the tumor size was also much smaller than that in the control group, indicating the inhibition of the tumorogenecity of SGC/RZ1 in nude mice. Conclusion c-erbB-2 specific ribozyme is very efficient in reversing the malignant phenotype of gastric cancer. This might provide a new approach for gene therapy of gastric cancer.
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【Key words】 Genes, erbB-2 Ribozymes Stomech neoplasms Gene therapy
(Natl Med J China, 1999, 79：295-297)
c-erbB-2原癌基因的产物是一种跨膜生长因子受体，在某些肿瘤细胞间的信号传递中起着重要作用。 已发现该基因的扩增或蛋白的过度表达与乳腺癌、胃癌等多种肿瘤的发生、发展、转移及预后密切相关[1，2]。核酶(ribozyme)是具有特异性切割核酸分子作用的RNA。核酶的发现不仅为病毒性疾病的治疗带来了希望, 也为肿瘤的基因治疗提供了新的武器[3，4]。我们选择了在胃癌中高表达的c-erbB-2 mRNA作为靶分子，在体外合成并构建了核酶RZ1基因的真核表达载体，探讨其对胃癌细胞恶性表型的影响。
材料和方法
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一、材料
1.细胞系及实验动物：人胃癌细胞系SGC-7901由军事医学科学院毒物药物研究所引入； BALB/c 裸小鼠由上海肿瘤研究所提供，本校动物实验中心饲养。
2.试剂：鼠抗人c-neu单克隆抗体为北京中山生物技术公司产品；RPMI 1640、Opti-MEM、脂质体LipofectAMINETM为美国Gibco公司产品；G418为美国Sigma公司产品。
二、方法
1.核酶真核表达载体的构建及鉴定：根据计算机设计的人癌基因c-erbB-2特异性核酶RZ1，合成RZ1[5]，合成RZ1基因后测序鉴定，构建其真核表达载体pDOR-RZ1，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
2.Lipofect AMINETM介导的SGC-7901细胞转染 实验设3组：重组载体pDOR-RZ1；对照组用空载体pDOR-Neo质粒；空白组为未加质粒的SGC-7901细胞，具体步骤按试剂说明书进行；最后加入G418 400 μg/ml筛选3周，挑选单细胞克隆，扩大培养。
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3.细胞生长速度测定：在24孔培养板中，每孔接种3×104个细胞，每份3个复孔，每天收集细胞一次，连续计数12天，计算出均值和标准差，绘制出生长曲线。
4.裸鼠体内移植生长试验：试验分3组，每组5只裸鼠，SGC/RZ1、SGC/Neo和SGC-7901细胞分别以5×106细胞数接种于3组裸小鼠背部皮下，每只裸鼠接种1处，连续观察4周，记录一般情况、成瘤时间及瘤体大小变化。
结果
1.胃癌细胞SGC-7901转染：pDOR-RZ1、pDOR-neo在阳离子质脂体Lipofect AMINETM的介导下成功地转染了胃癌细胞SGC7901，经G418筛选3周后选出单克隆，分别命名为SGC/RZ1和SGC/ Neo。
2.转染胃癌细胞P185的表达：流式细胞仪检测SGC-7901细胞和两组转染后的细胞P185的表达结果显示，以SGC/RZ1的表达率最低，其P185的表达率被抑制达62.7%(图1)。
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A. SGC-7901 (63.2%) B. SGC/neo (58.3%) C. SGC/RZ1 (23.6%)
图1 转染胃癌细胞P185的表达
3.转染胃癌细胞生长速度测定：根据细胞计算的均值和标准差绘制出生长曲线。由图2可以看出，转染胃癌细胞SGC/RZ1的生长速度较对照组SGC-7901明显减慢，在第5天时抑制率为72.8%，第12天时抑制率为55.5%。而SGC/neo的生长速度较亲本细胞SGC7901无明显差别。
图2 转染胃癌细胞生长速度测定
4.转染胃癌细胞裸鼠体内抑瘤试验：3组细胞致瘤性试验发现，SGC/RZ1的裸鼠成瘤时间明显延迟，所成肿瘤的体积亦较对照组明显为小，表明其致瘤性明显减弱，而对照组的致瘤性未受影响(表1)
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表1 转染胃癌细胞裸鼠体内抑瘤试验 分组
鼠数
(只)
成瘤时间
肿瘤直径大小
平均值(cm，
±s)2周
3周
4周
SGC/7901
5
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5/5
5/5
2.0±0.5
SGC/neo
5
5/5
5/5
5/5
2.1±0.5
SGC/RZ1
5
0/5
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1/5
4/5
0.6±0.3*
注：与SGC-7901和SGC/Neo组相比，P均<0.01
讨论
原癌基因的激活和抑癌基因的缺失和突变可能是肿瘤产生的机理之一。因此，阻断癌基因的表达成了基因治疗中 活跃的研究领域。自核酶发现后,有些学者曾尝试将其应用于肿瘤的基因治疗[6，7]。取得了比反义核酸更有效的作用。其中Koizumi等[8]设计的针对c-Ha-ras第12位突变子密码子的核酶 仅切割突变株而不切割野生株,说明了核酶作用的高度特异性和有效性。
靶基因的选择也很重要。我们在复习文献的基础上发现在c-erbB-2胃腺癌中表达率很高，与胃癌的发生、转移以及预后关系非常密切[2，9，10]，因此，选择其为靶基因。我们的实验结果也证实了这一点。在胃癌细胞转染pDOR-RZ1的瞬时表达时也看到胃癌细胞的大量死亡，稳定表达克隆的生长速率被明显抑制，裸鼠体内致瘤性也明显下降。这些结果均说明了c-erbB-2特异性核酶对胃癌细胞的恶性表型有明显的抑制作用，从而有可能为胃癌的基因治疗提供一个新的选择。
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本课题为国家自然科学基金资助项目(39500066)
参考文献
[1] Allred DC, Clark GM, Molina R, et al. Overexpression of HER-2/neu and its relationship with other prognostic factors change during the progression of in situ to invasive breast cancer. Hum Pathol，1992，23: 974-979.
[2] Mizutani T, Onda M, Tokunaga A, et al. Relationship of C-erbB-2 protein expression and gene amplification to invasion and metastasis in human gastric cancer. Cancer，1993，72:2083-2088.
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[3] Sarver N, Cantin EM, Chang PS, et al. Ribozymes as potential anti-HIV-1 therapeutic agents. Science, 1990, 247:1222-1225.
[4] Feng M, Cabrera G, Deshane J, et al. Neoplastic reversion accomplished by high efficiency adenoviral-mediated delivery of an anti-ras ribozyme. Cancer Res，1995, 55:2024～2028.
[5] 毕锋, 张学庸, 樊代明等. 抗 c-erbB-2 Ribozyme 的计算机设计.第四军医大学学报，1997, 18:6-9.
[6] Snyder DS,Wu Y,Wang JL, et al.Ribozyme-mediated inhibition of bcr-abl gene expression in a philadelphia chromosome-positive cell line.Blood ，1993，82:600-605.
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[7] Kashani S M,Funato T,Florenes VA, et al.Suppression of the neoplastic phenotype in vivo by an anti-ras ribozyme.Cancer Res，1994，54:900-902.
[8] Koizumi M,Kamiya H，Ohtsuka E.Ribozymes designed to inhibit transformation of NIH3T3 cells by the activated c-Ha-ras gene. Gene，1992，117:179-184.
[9] Chiu KY,Loke SL，Ho FC.Immunohistochemical demonstration of c-erbB-2 oncoprotein in gastric adenocarcinoma:comparison of cryostat and paraffin wax sections and effect of fixation. J Clin Pathol，1994，47:117-121.
[10] Lee HR,Kim JH,Uhm HD，et al.Overexpression of c-ErbB-2 protein in gastric cancer by immunohistochemical stain.Oncology,1996，53:192-197.
(收稿：1998-05-08 修回：1998-12-09), 百拇医药