α-干扰素对NIH3T3成纤维细胞生长的影响
作者：黄团新 周永兴 贾战生 连建奇 张盈华
单位：430061 武汉,武警湖北总队医院(黄团新)；第四军医大学唐都医院(周永兴、贾战生、连建奇、张盈华)
关键词：α-干扰素；成纤维细胞；肝硬化；流式细胞仪
临床内科杂志/990409 【摘要】 目的 探讨α-干扰素抗肝纤维化的作用及其机制。方法 用重组α-干扰素2b(α-IFN2b)作用于NIH3T3成纤维细胞,用MTT法及流式细胞仪(FCM)对细胞的生长速度、生长周期及DNA含量进行检测和分析。结果 α-IFN2b有明显抑制NIH3T3成纤维细胞增殖作用,其机制主要是通过阻止NIH3T3成纤细胞由G1期向S期分裂。结论 α-IFN2b抑制成纤维细胞增殖可能是其抗肝纤维化作用机制之一。
The effects of α-IFN on NIH3T3 fibroblast proliferation
, 百拇医药
Huang Tuanxin,Zhou Yongxing,Jia Zhansheng,et al.
Department of Infectious Diseases,Hubei Provincial Corps Hospitial,Chi nese Peoples Armed Police For ces,Wuhan 430061
【Abstract】 Objective The purpose is to investigate the effect and mechnism of antihepatic fibrosis.Methods The influence of α-IFN(2b)on NIH3T3 fibroblast in growth speed,cell cycle and quantity of DNA was studied by MTT and the flow cytometer(FCM).Results It was found that α-IFN(2b)significantly inhibited NIH3T3 fibroblast growth from gapl phase to synthesis phase,and that the quantity of DNA cell proliferation. Conclusion The results suggust that the inhibition of fibroblast growth by α-IFN(2b)is probably one mechanism of ifs antihepatic fibrosis functio.
, 百拇医药
【Key words】 α-interferon Fibroblast Liver cirrhosis Flow cytometer
在我国,慢性病毒性肝炎是一种常见多发病,抗病毒治疗尚无突破性进展,阻止其向肝硬化发展的抗纤维化治疗就显得更加重要。80年代以来,在IFN广泛被应用于慢性病毒性肝炎抗病毒治疗同时,发现其有一定抗肝纤维化作用。为探讨IFN的抗肝纤维化作用及其机制,我们采用NIH3T3成纤维细胞作为实验对象,研究了α-IFN2b的抗纤维化作用。
材料与方法
一、材料:(1)α-IFN2b美国先灵保雅公司产品。(2)NIH3T3成纤维细胞由第四军医大学口腔医学院细胞室提供。(3)流式细胞仪(FCM)EPICS-ProfileⅡ型,由美国Coulter公司产品。
二、方法
, http://www.100md.com
(一)细胞株的培养:NIH3T3成纤维细胞来源于Swiss小鼠胚胎肺组织,用RPMI 1640加三蒸水配成培养液,再加灭活之小牛血清配成含10%小牛血清的完全培养基,在37℃、5%CO2孵箱中培养传代,1～2天换液一次,3～5天传代一次。
(二)四坐盐(MTT)试验:(1)接种细胞:用0.25%胰酶消化NIH3T3细胞,用完全RPMI 1640培养液配成单个细胞悬液,以每孔104个细胞接种于96孔培养板中,每孔体积200 μl。(2)培养细胞:将培养板移入CO2孵箱中,培养2天后,分别加入不同浓度的α-IFN 2b(10～1024 U/ml,四倍增法)及秋水仙碱(0.195～200 μmol/L,四倍增法),继续孵化24小时。(3)呈色:按MTT检测法步骤进行。比色:选择49 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光值(OD),计算抑制率。每一剂量重复2遍。设空白对照,比色时用空白孔调零。
, 百拇医药 (三)FCM检测:(1)接种细胞:将NIH3T3成纤维细胞配制成单个细胞悬液,以每孔5×10个细胞接种于6孔培养板中,每孔体积2ml。(2)培养及加药:将培养板移入孵箱中,培养24小时后分别加入不同浓度的α-IFN2b(同MTT法),每孔200μl,并设对照组(不加药)。继续培养24小时后,用胰酶消化成单个细胞悬液,作台酚蓝染色并计数细胞。(3)处理细胞及FCM检测:按FCM专用试剂盒要求,进行细胞分离及染色,在FCM上以每秒1万个细胞的测量速度测定每个细胞生长周期(G1,S,G2+M)的百分比、DNA含量,每一剂量重复一遍。
结果
一、MTT试验:不同浓度α-IFN 2b对NIH3T3成纤维细胞的抑制率。根据OD值计算出抑制率(见附表),可见秋水仙碱对NIH3T3成纤维细胞的抑制作用是肯定的,并随着其浓度的增加而增强。α-IFN 2b对NIH3T3成纤维细胞有明显抑制作用,在α-IFN浓度在10～640 U/ml时,随着其浓度的增加其抑制率逐渐增强,在640～10240 U/ml时,抑制率无明显变化。
, 百拇医药
二、FCM测定
(一)α-IFN 2b对NIH3T3成纤维细胞生长周期的影响:对照组NIH3T3成纤维细胞进入G1期、S期及G2期的细胞比例分别是43.3%、51.1%、5.6%。试验组α-IFN 2b浓度为160 U/ml组进入G1、S及G2期的分别是61.0%、25.7%、13.3%;640 U/ml组分别是56.4%、25.9%、17.7%;2 560 U/ml组分别是61.0%、26.9%、12.1%。可见试验组中细胞周期中被阻止于G1期的细胞数增多,进入S期的明显减少,有明显的细胞增殖抑制作用。三种剂量的α-IFN作用效果无明显差异。
附表 MTT法测定α-IFN(2b)及秋水仙素对NIH3T3的作用 α-IFN(2b)
秋水仙碱
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剂量(U/ml)
抑制率(%)
剂量(U/ml)
抑制率(%)
10
2.1
0.195
6.4
40
5.5
0.781
18.7
160
, 百拇医药
10.2
3.125
29.3
640
34.7
12.5
42.5
2 560
32.4
50.0
90.2
10 240
33.2
, 百拇医药
200.0
100.0
(二)α-IFN2b对NIH3T3成纤维细胞G1、G2期DNA合成的影响:对照组G1期DNA为41.1频道数(下同),G2期为84.8,G2/G1为2.064。160 U/ml组G1期为45.3,G2期为84.2,G2/G1为1.864;640 U/ml组G1期为43.1,G2期为80.8,G2/G1为1.874;2 560 U/ml组G1期为42.2,G2期为80.3,G2/G1为1.903。可见α-IFN2b使细胞周期G1期DNA合成增加,G2期DNA合成减少,故G2/G1比值下降,进一步说明被阻止于G1期的细胞增加,进入G1期的减少,抑制有丝分裂。讨论
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繁殖是细胞的基本特征,包括细胞生长、DNA复制和细胞分裂三部分。细胞的繁殖是通过细胞周期来实现的,DNA是它的物质基础,G1期为DNA合成前期,此期合成RNA、蛋白质及其所需要的前体物质;S期为DNA合成期,是细胞周期的关键;G2期为DNA合成后期,为有丝分裂作好准备。
干扰素具有广泛的生物活性,除抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用外,发现其有抗成纤维细胞活性。有学者报道[1]α-IFN有抑制Ito细胞增殖、抑制胶原mRNA及α平滑肌纤蛋白的表达作用。实验证明[2]α、β、-IFN均能抑制3T3L1前脂细胞Ⅰ型胶原mRNA、转化生长因子β 1mRNA的表达及细胞生长,减少细胞外基质的合成。α干扰素还能通过抗病毒、抗炎作用来减轻炎症、坏死的刺激来达到抗纤维化作用[3]。有人认为[4],IFN抗细胞增殖作用是作为信号分子来调控细胞内2,5-寡腺苷酸合成酶水平,抑制鸟氨酸合成酶活性,促进吲哚-2,3-过氧化酶的合成,来达到抑制细胞增殖作用。
, 百拇医药
本试验中,用MTT法测定α-IFN 2b对NIH3T3的作用,其抑制率的变化说明α-IFN 2b有明显抑制细胞增殖作用,但α-IFN 2b在浓度为160 U/ml以下时,对NIF3T3的抑制作用不明显,在640 U/ml以上时,有明显抑制作用,但无明显量效关系。用FCM测定其对细胞周期及DNA合成的影响,与对照组相比,提示试验组被阻止于G1期的细胞数明显增多,进入S期的减少,DNA合成减少,进一步影响下一个细胞周期,抑制NIH3T3的增殖。三种剂量(160 U/ml、640 U/ml、2 560 U/ml)组无明显差异;以上结果均支持α-IFN 2b抑制细胞增殖是作为一种信号分子发挥作用的论点。提示α-IFN 2b具有抑制成纤维细胞增殖的作用,这可能是其抗纤维化作用的机制之一。
参考文献
1.Guido M,Rugge M,Chemello L,et al.Liver stellate cells in chronic viral hepatitis:the effect of interferon theripy.J-Hepatol.1996,24(3)∶301.
, http://www.100md.com
2.Nunaguchi S,Okuno M,Moriwaki H,et al.Modulation of collagen synthesis and degradation by retinoids and cytokines in 3T3L1 preadipocytes.Intern-Med,1994,33(6)∶309.
3.Hiramatsu N,Hayashi N,Kasahara A,et al.Improvement of liver fibrosis in chronic hepatitis C patients treated with natu ralinterferon alpha.J-hepatol,1995,22(2)∶135.
4.Samuel Baron,MD,Stephen K,Tyring,MD,PhD,et al.干扰素作用机理和临床应用.美国医学杂志(中文版),1992,8(4)∶214.
收稿:1998-08-25 修回:1999-05-04, 百拇医药
单位：430061 武汉,武警湖北总队医院(黄团新)；第四军医大学唐都医院(周永兴、贾战生、连建奇、张盈华)
关键词：α-干扰素；成纤维细胞；肝硬化；流式细胞仪
临床内科杂志/990409 【摘要】 目的 探讨α-干扰素抗肝纤维化的作用及其机制。方法 用重组α-干扰素2b(α-IFN2b)作用于NIH3T3成纤维细胞,用MTT法及流式细胞仪(FCM)对细胞的生长速度、生长周期及DNA含量进行检测和分析。结果 α-IFN2b有明显抑制NIH3T3成纤维细胞增殖作用,其机制主要是通过阻止NIH3T3成纤细胞由G1期向S期分裂。结论 α-IFN2b抑制成纤维细胞增殖可能是其抗肝纤维化作用机制之一。
The effects of α-IFN on NIH3T3 fibroblast proliferation
, 百拇医药
Huang Tuanxin,Zhou Yongxing,Jia Zhansheng,et al.
Department of Infectious Diseases,Hubei Provincial Corps Hospitial,Chi nese Peoples Armed Police For ces,Wuhan 430061
【Abstract】 Objective The purpose is to investigate the effect and mechnism of antihepatic fibrosis.Methods The influence of α-IFN(2b)on NIH3T3 fibroblast in growth speed,cell cycle and quantity of DNA was studied by MTT and the flow cytometer(FCM).Results It was found that α-IFN(2b)significantly inhibited NIH3T3 fibroblast growth from gapl phase to synthesis phase,and that the quantity of DNA cell proliferation. Conclusion The results suggust that the inhibition of fibroblast growth by α-IFN(2b)is probably one mechanism of ifs antihepatic fibrosis functio.
, 百拇医药
【Key words】 α-interferon Fibroblast Liver cirrhosis Flow cytometer
在我国,慢性病毒性肝炎是一种常见多发病,抗病毒治疗尚无突破性进展,阻止其向肝硬化发展的抗纤维化治疗就显得更加重要。80年代以来,在IFN广泛被应用于慢性病毒性肝炎抗病毒治疗同时,发现其有一定抗肝纤维化作用。为探讨IFN的抗肝纤维化作用及其机制,我们采用NIH3T3成纤维细胞作为实验对象,研究了α-IFN2b的抗纤维化作用。
材料与方法
一、材料:(1)α-IFN2b美国先灵保雅公司产品。(2)NIH3T3成纤维细胞由第四军医大学口腔医学院细胞室提供。(3)流式细胞仪(FCM)EPICS-ProfileⅡ型,由美国Coulter公司产品。
二、方法
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(一)细胞株的培养:NIH3T3成纤维细胞来源于Swiss小鼠胚胎肺组织,用RPMI 1640加三蒸水配成培养液,再加灭活之小牛血清配成含10%小牛血清的完全培养基,在37℃、5%CO2孵箱中培养传代,1～2天换液一次,3～5天传代一次。
(二)四坐盐(MTT)试验:(1)接种细胞:用0.25%胰酶消化NIH3T3细胞,用完全RPMI 1640培养液配成单个细胞悬液,以每孔104个细胞接种于96孔培养板中,每孔体积200 μl。(2)培养细胞:将培养板移入CO2孵箱中,培养2天后,分别加入不同浓度的α-IFN 2b(10～1024 U/ml,四倍增法)及秋水仙碱(0.195～200 μmol/L,四倍增法),继续孵化24小时。(3)呈色:按MTT检测法步骤进行。比色:选择49 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光值(OD),计算抑制率。每一剂量重复2遍。设空白对照,比色时用空白孔调零。
, 百拇医药 (三)FCM检测:(1)接种细胞:将NIH3T3成纤维细胞配制成单个细胞悬液,以每孔5×10个细胞接种于6孔培养板中,每孔体积2ml。(2)培养及加药:将培养板移入孵箱中,培养24小时后分别加入不同浓度的α-IFN2b(同MTT法),每孔200μl,并设对照组(不加药)。继续培养24小时后,用胰酶消化成单个细胞悬液,作台酚蓝染色并计数细胞。(3)处理细胞及FCM检测:按FCM专用试剂盒要求,进行细胞分离及染色,在FCM上以每秒1万个细胞的测量速度测定每个细胞生长周期(G1,S,G2+M)的百分比、DNA含量,每一剂量重复一遍。
结果
一、MTT试验:不同浓度α-IFN 2b对NIH3T3成纤维细胞的抑制率。根据OD值计算出抑制率(见附表),可见秋水仙碱对NIH3T3成纤维细胞的抑制作用是肯定的,并随着其浓度的增加而增强。α-IFN 2b对NIH3T3成纤维细胞有明显抑制作用,在α-IFN浓度在10～640 U/ml时,随着其浓度的增加其抑制率逐渐增强,在640～10240 U/ml时,抑制率无明显变化。
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二、FCM测定
(一)α-IFN 2b对NIH3T3成纤维细胞生长周期的影响:对照组NIH3T3成纤维细胞进入G1期、S期及G2期的细胞比例分别是43.3%、51.1%、5.6%。试验组α-IFN 2b浓度为160 U/ml组进入G1、S及G2期的分别是61.0%、25.7%、13.3%;640 U/ml组分别是56.4%、25.9%、17.7%;2 560 U/ml组分别是61.0%、26.9%、12.1%。可见试验组中细胞周期中被阻止于G1期的细胞数增多,进入S期的明显减少,有明显的细胞增殖抑制作用。三种剂量的α-IFN作用效果无明显差异。
附表 MTT法测定α-IFN(2b)及秋水仙素对NIH3T3的作用 α-IFN(2b)
秋水仙碱
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剂量(U/ml)
抑制率(%)
剂量(U/ml)
抑制率(%)
10
2.1
0.195
6.4
40
5.5
0.781
18.7
160
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10.2
3.125
29.3
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34.7
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2 560
32.4
50.0
90.2
10 240
33.2
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200.0
100.0
(二)α-IFN2b对NIH3T3成纤维细胞G1、G2期DNA合成的影响:对照组G1期DNA为41.1频道数(下同),G2期为84.8,G2/G1为2.064。160 U/ml组G1期为45.3,G2期为84.2,G2/G1为1.864;640 U/ml组G1期为43.1,G2期为80.8,G2/G1为1.874;2 560 U/ml组G1期为42.2,G2期为80.3,G2/G1为1.903。可见α-IFN2b使细胞周期G1期DNA合成增加,G2期DNA合成减少,故G2/G1比值下降,进一步说明被阻止于G1期的细胞增加,进入G1期的减少,抑制有丝分裂。讨论
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繁殖是细胞的基本特征,包括细胞生长、DNA复制和细胞分裂三部分。细胞的繁殖是通过细胞周期来实现的,DNA是它的物质基础,G1期为DNA合成前期,此期合成RNA、蛋白质及其所需要的前体物质;S期为DNA合成期,是细胞周期的关键;G2期为DNA合成后期,为有丝分裂作好准备。
干扰素具有广泛的生物活性,除抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用外,发现其有抗成纤维细胞活性。有学者报道[1]α-IFN有抑制Ito细胞增殖、抑制胶原mRNA及α平滑肌纤蛋白的表达作用。实验证明[2]α、β、-IFN均能抑制3T3L1前脂细胞Ⅰ型胶原mRNA、转化生长因子β 1mRNA的表达及细胞生长,减少细胞外基质的合成。α干扰素还能通过抗病毒、抗炎作用来减轻炎症、坏死的刺激来达到抗纤维化作用[3]。有人认为[4],IFN抗细胞增殖作用是作为信号分子来调控细胞内2,5-寡腺苷酸合成酶水平,抑制鸟氨酸合成酶活性,促进吲哚-2,3-过氧化酶的合成,来达到抑制细胞增殖作用。
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本试验中,用MTT法测定α-IFN 2b对NIH3T3的作用,其抑制率的变化说明α-IFN 2b有明显抑制细胞增殖作用,但α-IFN 2b在浓度为160 U/ml以下时,对NIF3T3的抑制作用不明显,在640 U/ml以上时,有明显抑制作用,但无明显量效关系。用FCM测定其对细胞周期及DNA合成的影响,与对照组相比,提示试验组被阻止于G1期的细胞数明显增多,进入S期的减少,DNA合成减少,进一步影响下一个细胞周期,抑制NIH3T3的增殖。三种剂量(160 U/ml、640 U/ml、2 560 U/ml)组无明显差异;以上结果均支持α-IFN 2b抑制细胞增殖是作为一种信号分子发挥作用的论点。提示α-IFN 2b具有抑制成纤维细胞增殖的作用,这可能是其抗纤维化作用的机制之一。
参考文献
1.Guido M,Rugge M,Chemello L,et al.Liver stellate cells in chronic viral hepatitis:the effect of interferon theripy.J-Hepatol.1996,24(3)∶301.
, http://www.100md.com
2.Nunaguchi S,Okuno M,Moriwaki H,et al.Modulation of collagen synthesis and degradation by retinoids and cytokines in 3T3L1 preadipocytes.Intern-Med,1994,33(6)∶309.
3.Hiramatsu N,Hayashi N,Kasahara A,et al.Improvement of liver fibrosis in chronic hepatitis C patients treated with natu ralinterferon alpha.J-hepatol,1995,22(2)∶135.
4.Samuel Baron,MD,Stephen K,Tyring,MD,PhD,et al.干扰素作用机理和临床应用.美国医学杂志(中文版),1992,8(4)∶214.
收稿:1998-08-25 修回:1999-05-04, 百拇医药