急性髓系白血病多药耐药表达与白血病克隆生长的关系
作者：黄梅 羊裔明 孟文彤
单位：黄梅 同济医科大学附属同济医院内科 邮政编码：430030；羊裔明 孟文彤 西医科大学附一院血液科 孟文彤 邮政编码：610041
关键词：白血病，急性/髓细胞；多药耐药；干细胞培养；预后
临床血液学杂志990412 多药耐药(MDR)及白血病细胞高度增殖能力所产生的再生耐药，是急性髓系白血病(AML)化疗失败的重要原因。我们采用植物血凝素——白细胞条件培养液(PHA-LCM)为生长刺激因子，体外培养白血病祖细胞(L-CFU)。同时使用JSB-1单克隆抗体免疫组化ABC法检测AML病人骨髓细胞中P170表达，以探讨两者间关系及其临床意义。
1 材料与方法
1.1 研究对象 21例AML均经细胞形态学、免疫学分型确诊。FAB分型M1 6例，M2 5例，M3 5例，M4 1例，CML急变4例。其中初治18例，复发2例，难治性1例。
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1.2 治疗方法 诱导缓解采用DA3+7方案，疗程间歇2～3周，两个疗程不能达PR者，视为难治性AML。M3首选维甲酸(RA)60 mg/d，分次口服至CR。若用药2个月仍不能缓解者改用DA3+7方案。对复发或难治性病例，DNR改为米托蒽醌10 mg/d。
1.3 疗效标准 化疗结束后10～20 d行血象和骨髓象检查。按全国血液病诊断及疗效标准分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、未缓解(NR)。
1.4 P170测定 所有病人化疗前抽取骨髓涂于封胶玻片上，自然晾干后置于低温冰箱(-20℃)保存。抗P170单抗JSB-1购自德国Boehringer公司，ABC试剂盒为美国Vector公司生产，按生物素—亲和素过氧化物酶复合物(ABC)法作P170免疫组化染色。结果判定：每批P170试验标本均设立已知阳性(肾上腺组织切片)和阴性对照(用PBS液代替第一抗体)。细胞浆中着棕黄色者为阳性细胞，阴性者不着色。在光学显微镜下计数500个白血病细胞，计算P170阳性细胞百分率。根据我科运用本方法检测P170制作的受试者工作特异曲线，选定P170阳性细胞率≥5%为该病人P170阳性〔1〕。
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1.5 AML-CFU培养 所有病人化疗前抽取骨髓2～5 ml置于无菌肝素抗凝试管中，去血浆后，用Ficoil淋巴细胞分离液分离出单个核细胞(MNC)，再用PRMI 1640液洗3次，制成MNC悬液，混匀，计数后加入培养体系。培养体系包括：PRMI 1640培养液，20%小牛血清，15%PHA-LCM，0.3%琼脂。终末细胞浓度为2×105 MNC/ml。将建立好的体系1 ml加入33 mm的培养皿中，每例标本培养3份，置于饱和湿度、37℃、5%CO2的二氧化碳培养箱中培养7 d。期间用倒置显微镜观察生长情况，7 d后取出并计数。>40个细胞为集落，计数3个培养皿后取平均值为每例标本培养的集落数。
2 结果
2.1 P170表达与AML-CFU关系 21例AML-CFU培养所得集落数平均值为15.90±7.34。P170阳性12例，1例未长出集落，其余11例集落数范围4.5～61.5/2×105 MNC，12例标本均值为23.12±10.55。P170阴性9例，2例未长出集落，其余7例集落数范围1.5～25.5/2×105 MNC，9例标本均值为6.28±3.95。两组间差异有显著性(P<0.05)。
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2.2 P170表达、AML-CFU与疗效关系 本组6例未治疗自动出院，2例高白血病细胞者死于颅内出血。行诱导缓解化疗的13例中，P170阳性8例，其中6例NR，2例CR。而P170阴性5例，其中4例NR，1例NR。该13例中AML-CFU培养所得集落数>15.90的病人5例，全部为NR。<15.90者8例，其中6例CR，2例NR。
3 讨论
P170表达及AML-CFU对AML病人预后意义：据报告AML病人P170阳性表达和AML原始细胞体外培养自主增殖能力，对于化疗后缓解率是独立的负性预后指标〔2，3〕，我们的初步结果与之相符。P170阳性病人化疗缓解率低于P170阴性者，体外培养增殖能力强的病人化疗缓解率亦低于增殖力低的病人。P170阳性表达和具有高度自主增殖能力的AML细胞，常同时伴随某些不成熟的表型标志，如CD34，HLA-DR等〔4，5〕。Boekhorst〔6〕在研究AML病人具有高度增殖能力的MDR细胞对化疗反应中发现，CD+34/P170+双重表达病人在高度自主增殖组中比例高(P<0.01)，预后差。直接提出P170表达与AML-CFU增殖能力这两个预后负性因素存在联系〔6〕。我们实验结果显示，P170阳性组AML-CFU集落数平均值23.12，P170阴性组AML-CFU集落数平均值6.28，与Boekhorst结论一致，即P170表达阳性细胞体外增殖能力较强(P<0.05)。
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参考文献
1 张连生，吴谨诸，李晓明，等.P170在急性白血病细胞中的表达及临床意义.中华血液学杂志，1996，17：86～86
2 Campous L,Guyotat O,Archimant E,et al.Clinical significance of Acute Nonlyphoblastic Leukemia at diagnoris.Blood,1992,79(2):473～476
3 Hunter AE,Stephen Y,Rogers,et al.Autonomous Growth of Blast cell is associated with reduced survival in acute myeloblastic leukemia.Blood,1993,82:899～903
4 Almeida J,Canizo CD,Orfao A,et al.In vitro autonomous proliferation in ANLL:clinical and biological srgnificance.Leukemic Res,1995,19:411～416
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5 Poeta GD,Sasi R,venditti A,et al.Prognostic value of cell Marker Analysis in De Novo Acute Myeloid Leukemia.Leukemiu,1994,8(3):388～394
6 Boekhorst DT,Lowenberg B,Kepet JV,et al.Multidrug resis with high proliferative capacity determine response to therapy in acute myeloid leukemia.Leukemia,1995,9:1025～1031
(1998-10-07 收稿 1999-01-07修回), http://www.100md.com
单位：黄梅 同济医科大学附属同济医院内科 邮政编码：430030；羊裔明 孟文彤 西医科大学附一院血液科 孟文彤 邮政编码：610041
关键词：白血病，急性/髓细胞；多药耐药；干细胞培养；预后
临床血液学杂志990412 多药耐药(MDR)及白血病细胞高度增殖能力所产生的再生耐药，是急性髓系白血病(AML)化疗失败的重要原因。我们采用植物血凝素——白细胞条件培养液(PHA-LCM)为生长刺激因子，体外培养白血病祖细胞(L-CFU)。同时使用JSB-1单克隆抗体免疫组化ABC法检测AML病人骨髓细胞中P170表达，以探讨两者间关系及其临床意义。
1 材料与方法
1.1 研究对象 21例AML均经细胞形态学、免疫学分型确诊。FAB分型M1 6例，M2 5例，M3 5例，M4 1例，CML急变4例。其中初治18例，复发2例，难治性1例。
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1.2 治疗方法 诱导缓解采用DA3+7方案，疗程间歇2～3周，两个疗程不能达PR者，视为难治性AML。M3首选维甲酸(RA)60 mg/d，分次口服至CR。若用药2个月仍不能缓解者改用DA3+7方案。对复发或难治性病例，DNR改为米托蒽醌10 mg/d。
1.3 疗效标准 化疗结束后10～20 d行血象和骨髓象检查。按全国血液病诊断及疗效标准分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、未缓解(NR)。
1.4 P170测定 所有病人化疗前抽取骨髓涂于封胶玻片上，自然晾干后置于低温冰箱(-20℃)保存。抗P170单抗JSB-1购自德国Boehringer公司，ABC试剂盒为美国Vector公司生产，按生物素—亲和素过氧化物酶复合物(ABC)法作P170免疫组化染色。结果判定：每批P170试验标本均设立已知阳性(肾上腺组织切片)和阴性对照(用PBS液代替第一抗体)。细胞浆中着棕黄色者为阳性细胞，阴性者不着色。在光学显微镜下计数500个白血病细胞，计算P170阳性细胞百分率。根据我科运用本方法检测P170制作的受试者工作特异曲线，选定P170阳性细胞率≥5%为该病人P170阳性〔1〕。
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1.5 AML-CFU培养 所有病人化疗前抽取骨髓2～5 ml置于无菌肝素抗凝试管中，去血浆后，用Ficoil淋巴细胞分离液分离出单个核细胞(MNC)，再用PRMI 1640液洗3次，制成MNC悬液，混匀，计数后加入培养体系。培养体系包括：PRMI 1640培养液，20%小牛血清，15%PHA-LCM，0.3%琼脂。终末细胞浓度为2×105 MNC/ml。将建立好的体系1 ml加入33 mm的培养皿中，每例标本培养3份，置于饱和湿度、37℃、5%CO2的二氧化碳培养箱中培养7 d。期间用倒置显微镜观察生长情况，7 d后取出并计数。>40个细胞为集落，计数3个培养皿后取平均值为每例标本培养的集落数。
2 结果
2.1 P170表达与AML-CFU关系 21例AML-CFU培养所得集落数平均值为15.90±7.34。P170阳性12例，1例未长出集落，其余11例集落数范围4.5～61.5/2×105 MNC，12例标本均值为23.12±10.55。P170阴性9例，2例未长出集落，其余7例集落数范围1.5～25.5/2×105 MNC，9例标本均值为6.28±3.95。两组间差异有显著性(P<0.05)。
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2.2 P170表达、AML-CFU与疗效关系 本组6例未治疗自动出院，2例高白血病细胞者死于颅内出血。行诱导缓解化疗的13例中，P170阳性8例，其中6例NR，2例CR。而P170阴性5例，其中4例NR，1例NR。该13例中AML-CFU培养所得集落数>15.90的病人5例，全部为NR。<15.90者8例，其中6例CR，2例NR。
3 讨论
P170表达及AML-CFU对AML病人预后意义：据报告AML病人P170阳性表达和AML原始细胞体外培养自主增殖能力，对于化疗后缓解率是独立的负性预后指标〔2，3〕，我们的初步结果与之相符。P170阳性病人化疗缓解率低于P170阴性者，体外培养增殖能力强的病人化疗缓解率亦低于增殖力低的病人。P170阳性表达和具有高度自主增殖能力的AML细胞，常同时伴随某些不成熟的表型标志，如CD34，HLA-DR等〔4，5〕。Boekhorst〔6〕在研究AML病人具有高度增殖能力的MDR细胞对化疗反应中发现，CD+34/P170+双重表达病人在高度自主增殖组中比例高(P<0.01)，预后差。直接提出P170表达与AML-CFU增殖能力这两个预后负性因素存在联系〔6〕。我们实验结果显示，P170阳性组AML-CFU集落数平均值23.12，P170阴性组AML-CFU集落数平均值6.28，与Boekhorst结论一致，即P170表达阳性细胞体外增殖能力较强(P<0.05)。
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参考文献
1 张连生，吴谨诸，李晓明，等.P170在急性白血病细胞中的表达及临床意义.中华血液学杂志，1996，17：86～86
2 Campous L,Guyotat O,Archimant E,et al.Clinical significance of Acute Nonlyphoblastic Leukemia at diagnoris.Blood,1992,79(2):473～476
3 Hunter AE,Stephen Y,Rogers,et al.Autonomous Growth of Blast cell is associated with reduced survival in acute myeloblastic leukemia.Blood,1993,82:899～903
4 Almeida J,Canizo CD,Orfao A,et al.In vitro autonomous proliferation in ANLL:clinical and biological srgnificance.Leukemic Res,1995,19:411～416
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5 Poeta GD,Sasi R,venditti A,et al.Prognostic value of cell Marker Analysis in De Novo Acute Myeloid Leukemia.Leukemiu,1994,8(3):388～394
6 Boekhorst DT,Lowenberg B,Kepet JV,et al.Multidrug resis with high proliferative capacity determine response to therapy in acute myeloid leukemia.Leukemia,1995,9:1025～1031
(1998-10-07 收稿 1999-01-07修回), http://www.100md.com