河南食管癌高发区居民多灶性食管癌前病变和癌组织p53基因的突变分析*
作者：郑作昱 王立东 SHI Stephanie T YANG Guang-Yu XUE Zhi-Hong 高珊珊 李永欣 YANG Chung S
单位：河南医科大学癌症研究室 河南省郑州市 450052
关键词：食管肿瘤；癌前状态；p53基因；突变
世界华人消化杂志990402 摘 要
目的 探讨肿瘤抑制基因p53在同一患者多灶性食管癌前病变和癌组织中的突变特征，以加深对其在食管癌发生过程中作用的认识.
方法 采用免疫组织化学、选择性免疫组化、DNA(PCR-SSCP-DNA)测序方法，对来自食管癌高发区林州市的43例食管癌手术切除标本的癌组织及癌旁非癌病变作P53蛋白表达及突变分析. 癌前病变和p53表达较弱的癌组织(阳性细胞<30%)，采用紫外线照射办法提高阳性细胞数再作DNA制备.
, 百拇医药
结果 受检的43例鳞癌中，30例检出有p53基因突变(70%)，其中29例P53蛋白表达阳性鳞癌中的25例检出有p53基因突变(86%). 对癌旁P53蛋白表达阳性的癌前病变分析显示，16例基底细胞增生中的7例(47%)，12例间变中的8例(67%)，7例原位癌中的6例(86%)检出有p53基因突变. 尽管有2例受检组织突变只见于癌组织，而其癌旁的间变组织未发现突变，但间变和原位癌中检出的p53基因突变与鳞癌中检出的p53基因突变类型相同. 7例基底细胞增生组织中，只有3例检出的p53基因突变类型与其邻近的癌组织相同，其余4例突变类型不同于邻近的癌组织.
结论 发生间变和原位癌组织的p53基因突变与食管鳞癌非常一致，而发生在基底细胞过度增生病变的p53基因突变的生物学意义尚有待进一步研究证实.
中国图书资料分类号 R735.1
p53 gene mutations in multifocal esophageal precancerous and cancerous lesions in patients with esophageal cancer in high-risk northern China*
, 百拇医药
Zheng Zuo-yu 1, WANG Li-Dong1, SHI Stephanie T.2 YANG Guang-Yu2, XUE Zhi-Hong2, GAO Shan-Shan1, LI Yong-Xin1 and YANG Chung S2
1Laboratory for Cancer Research, Henan Medical University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
2Laboratory for Cancer Research, College of Pharmacy, Rutgers University, Piscataway, NJ 08854, USA
, 百拇医药
Subject headings esophageal neoplasms; precancerous condition; p53 gene; mutation
Abstract
AIM To characterize p53 gene mutations in multifocal esophageal precancerous and cancerous lesions from the same patients to further understand its role in esophageal carcinogenesis.
METHODS With immunohistochemistry, immunohisto-selective sequencing and PCR-SSCP-DNA sequencing methods, p53 protein accumulation and p53 gene mutation were determined on 43 surgically-resected human esophageal specimens, which contain squamous cell carcinoma and precancerous lesions in different parts from a high-incidence area, Linzhou, Henan. For all the precancerous lesions and some of the tumor sections with low percentage of p53 immunostain-positive cells (<30%), UV irradiation was used to enrich the p53 immunostain-positive cells in the DNA preparation.
, 百拇医药
RESULTS p53 gene mutations were detected in 30 out of 43 (70%) SCC cases. Among 29 SCC cases that were stained positive for p53 protein, 25 (86%) were found to contain p53 mutations. In p53 immunostain-positive precancerous lesions adjacent to cancer, p53 mutations were detected in 7 of 16 (47%) basal cell hyperplasia (BCH), 8 of 12 (67%) dysplasia (DYS) and 6 of 7 (86%) carcinoma in situ (CIS). All mutations found in lesions with DYS and CIS were the same as those in the nearby SCC, although in 2 cases the mutations were only detected in SCC but not the nearby lesions with DYS. In 7 cases of BCH containing mutations, only 3 had the same mutations as the nearby SCC, and the other 4 had mutations different from the nearby SCC.
, 百拇医药
CONCLUSION The p53 mutations in DYS and CIS are strongly associated with SCC. p53 mutations in BCH need to be further characterized to elucidate its biological consequence.
0 引言
食管上皮癌变是一个多阶段进行性过程，常经历正常上皮基底细胞增生间变原位癌，最后形成浸润性癌[1-4]. 已往的研究显示，P53蛋白的累积和基因突变发生在食管癌变的极早期阶段，甚至轻度的基底细胞增生和形态学上接近正常的上皮也有这种改变[5-14]. 对于无症状非癌患者食管不同部位发生的间变组织p53基因突变类型不同[15]. 最近，作者建立了一种免疫组化选择性筛选方法，以提高癌前病变组织中P53蛋白阳性表达细胞的突变分析的精确性[16]. 依此方法，作者分析了43例食管鳞状细胞癌手术切除标本原发灶及邻近的P53蛋白阳性染色的癌前病变组织中的p53基因的突变状况. 由于癌组织和癌前病变组织来自同一患者，从而提高了不同病变组织中p53基因突变状况的可比性，并对加深p53基因在食管癌变过程不同时期作用的了解具有重要意义.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 人食管组织标本取自河南食管癌高发区患者，用850mL/L酒精固定. 组织经常规组织学处理和石蜡包埋，作HE 染色和P53免疫染色. 所有组织块均切成5μm厚的切片，并粘附至透明塑料片上(Xerox公司提供)，于60℃烘烤30min，再冷却至室温作免疫染色. 免疫组化采用ABC法[16]，ABC 试剂盒和DAB底物试剂盒购自 Vecter Laboratories, P53抗体，Ab-6由Oncogene Science提供，实验过程中使用试剂提供者建议的2倍镍量，以增强染色强度.
1.2 方法
1.2.1 组织的DNA制备 ①先将癌组织切片作P53免疫染色，再将阳性染色区域切下，以确保制备液中至少有80%的P53阳性染色细胞. 切下的组织小碎片置入Eppendorf管，用100μL～200μL消化缓冲液(10mmol/L Tris-HCl, 2mmol/L EDTA, pH 8.0, 0.4g/L蛋白酶K)消化，55℃孵育3h. ②癌前病变组织(包括基底细胞增生、间变和原位癌)和P53阳性染色细胞不足30%的肿瘤组织，均作紫外线照射，以提高阳性细胞数量. 详细操作方法见作者以往报道[16]. 此后，将含有P53阳性细胞的组织用无菌剪刀剪成碎片，置于Eppendrof管，用25μL～50μL消化缓冲液消化，55℃孵育3h.
, 百拇医药
1.2.2 p53基因PCR-SSCP-DNA测序 p53基因PCR扩增所用引物分别为：5’-ACT TCC TGA AAA CAA CGT TC-3’和5’-CAG GCA TTG AAG TCT CAT GG-3’用于第4外显子；5’-GTT TCT TTG CTG CCG TGT TC-3’和5’-AGGCCTGGGGAC-CCTGGGCA-3’用于第5外显子；5’-TGG TTG CCC AGG GTC CCC AG-3’和5’-GGA GGG CCA CTG ACA ACC A-3’用于第6外显子；5’-AGG CGC ACT GGC CTC ATC TT-3’和5’-AGG GGT CAT CGG CAA GCA GA-3’用于第7外显子；5’-TTG GGA GTA GAT GGA GCC T-3’和5’-AGG CAT AAC TGC ACC CTT GG-3’用于第8外显子；5’-GCA GTT ATG CCT CAG ATT CA-3’和5’-GGC ATT TTG AGT GTT AGA CT-3’用于第9外显子. PCR在20uL的反应缓冲液中进行(50μmol/L Tris, pH 9.0， 30mmol/L MgCl2)，其中含各种引物各8pmol, dNTP各200μmol/L,37kBq的α-32P-dATP和0.5U的Taq聚合酶. 热循环程序为：加入Taq多聚酶前于95℃循环3min，继而于94℃ 1min，60℃ 1min循环40次，每次PCR均作无DNA样本的阴性对照循环1min，观察到突变的样本DNA均重复作PCR扩增，以验证结果. 标记的PCR产物置于含有甘油的polyacrylamide凝胶上. 作SSCP和DNA测序过程中，以人胎盘DNA作阴性对照. 将不同于胎盘DNA对照的移动带洗脱提取，再作PCR分析，于94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，热循环35次. 用Wizard PCR Preps DNA纯化系统(Promega提供)纯化PCR产物作DNA测序. 基因组DNA均重复进行PCR并作SSCP分析，以排除由Taq多聚酶引入的假阳性移动带.
, 百拇医药
用于测序的引物序列为：5’-CCT CTG ACT GCT CTT TTC AC-3’用于第4外显子；5’-TGT TCA CTT GTG CCC TGA CT-3’用于第5外显子；5’-GCC TCT GAT TCC TCA CTG AT-3’用于第6外显子；5’-TGT GCA GGG TGG CAA GTG GC-3’用于第7外显子；5’-TTC CTT ACT GCC TCT TGC TT-3’用于第8外显子；5’-TTA TCA CCT TTC CTT GCC TC-3’用于第9外显子. DNA测序试剂盒由Amersham Life Science提供. 循环测序过程为：94℃热循环2min；94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min循环20次；94℃ 1min，72℃ 1min，72℃ 1min循环10次. 反应混合物置于60g/L的polyacrylamide测序凝胶上(由美国Diagnostics, Atlanta提供). 直接测序方法为：纯化PCR扩增产物，直接测序.
2 结果
, 百拇医药
2.1 食管鳞癌的p53基因突变 受检的43例食管鳞癌中，有P53蛋白聚积的样本29例，其中的25例检出有P53蛋白突变，无P53蛋白聚集的13例，其中的5例或有缺失，或有内含子突变，或有中止密码子突变(表1). 全部受检鳞癌，总的p53突变检出率为70%(30/43)，且蛋白聚集与基因突变有明显的相关性(Fisher's T检验，表2). 有2例标本各检出2种突变，1例标本检出有3种突变. 观察到的34种突变中，发生在第5外显子的11种，第6外显子4种，第7外显子7种，第8外显子9种，4，5，6外显子各1种. 按突变性质分，其中27例为点突变(14例为G:C转化为A:T)，6例为缺失突变，1例为插入突变. 迄今在人类肿瘤中检出的p53基因突变为5961种，其中发生在175，245，248，249，273和282位密码子的突变被认为是热点突变[7]. 我们发现9例热点突变，1例位于175位密码子，2例位于248位密码子，4例位于273位密码子，2例位于282位密码子，这些密码子均编码精氨酸.
表1 食管鳞癌及癌旁癌前病变中的P53蛋白聚集和p53基因突变 标本
, http://www.100md.com
编号
病变
P53免
疫染色
外显子/密码子
p53基因突变
p53
核苷酸/氨基酸的变化
LOH
MSI
910497
SCC
+
, 百拇医药
5/159
GCC-ACC/Ala-Thr
CIS
+
5/159
GCC-ACC/Ala-Thr
DYS
+
5/159
GCC-ACC/Ala-Thr
+
-
, 百拇医药 91069
SCC
+
7/234
TAC-TGC/Tyr-Cys
+
-
DYS
+
7/234
TAC-TGC/Tyr-Cys
BCH
+
, 百拇医药
未检测
910618
SCC
-
Intron 5
T-G
910623
SCC
-
5/158
CGC-CTC/Arg-Leu
DYS
+
, http://www.100md.com
5/158
CGC-CTC/Arg-Leu
910666
SCC
-
未检测
+
-
DYS
+
未检测
910673
SCC
, 百拇医药
-
6/190
CCT-ACT/Pro-Thr
+
-
DYS
+
6/190
CCT-ACT/Pro-Thr
910682
SCC
-
6/212
, 百拇医药
2-bp缺失
+
-
910715
SCC
+
8/279
GGG-GAG/Gly-Glu
+
-
910731
SCC
-
, http://www.100md.com
6/212
2-bp缺失
+
-
91755
SCC
+
7/245-246
10-bp插入
+
-
91799
SCC
, 百拇医药
+
5/159
GCC-GTC/Ala-Val
NIa
-
91787
SCC
+
5/135
TGC-TTC/Cys-Phe
-
-
DYS
, 百拇医药
+
5/135
TGC-TTC/Cys-Phe
910793
SCC
-
未检测
NIa
-
91799
SCC
-
未检测
, http://www.100md.com
+
-
910840
SCC
+
7/258
GAA-AAA/Glu-Lys
+
-
910843
SCC
+
7/248
, 百拇医药
CGG-TGG/Arg-Trp
NIa
-
8/278
CCT-ACT/Pro-Thr
CIS
+
7/248
CGG-TGG/Arg-Trp
NIa
-
8/278
, 百拇医药
CCT-ACT/Pro-Thr
DYS
+
7/248
CGG-TGG/Arg-Trp
NIa
-
8/278
CCT-ACT/Pro-Thr
920920
SCC
+
, 百拇医药
8/273
CGT-CAT/Arg-His
-
-
DYS
+
未检测
BCH
+
未检测
920922
SCC
+
, 百拇医药
8/273
CGT-CAT/Arg-His
NIa
-
CIS
+
8/273
CGT-CAT/Arg-His
NIa
-
DYS
+
, 百拇医药
8/273
CGT-CAT/Arg-His
NIa
-
920925
SCC
+
8/282
CGG-TGG/Arg-Trp
+
-
BCH
, 百拇医药 +
5/158
CGC-CTC/Arg-Leu
-
-
920928
SCC
+
5/176-182
18-bp眶内缺失
+
-
BCH
, http://www.100md.com
+
5/158
CGC-CTC/Arg-Leu
+
-
920934
SCC
-
未检测
-
-
920935
SCC
, http://www.100md.com
+
8/305
AAG-AAC/Lys-Asn
NIa
-
920937
SCC
+
Intron 6
G-C
+
-
7/234
, 百拇医药
3-bp眶内缺失
BCH
+
Intron 6
G-C
-
-
920942
SCC
-
未检测
NIa
-
, 百拇医药
920943
SCC
+
8/273
CGT-CAT/Arg-His
+
-
BCH
+
未检测
-
-
920947
, 百拇医药
SCC
+
未检测
+
-
BCH
+
未检测
-
-
920950
SCC
+
5/175
, 百拇医药
CGC-CAC/Arg-His
-
-
920951
SCC
+
7/255
ATC-TTC/Ile-Phe
+
-
CIS
+
7/255
, http://www.100md.com
ATC-TTC/Ile-Phe
+
-
920953
SCC
+
未检测
+
-
CIS
+
未检测
-
, 百拇医药
-
BCH1
+
未检测
-
-
BCH2
+
5/158
CGC-CAC/Arg-His
-
-
BCH3
, 百拇医药
+
未检测
-
-
921957
SCC
+
8/282
CGG-TGG/Arg-Trp
-
-
920972
SCC
, http://www.100md.com
+
5/158
CGC-CTC/Arg-Leu
+
-
5/176-182
18-bp眶内缺失
8/273
CGT-TGT/Arg-Cys
BCH
+
5/158
, 百拇医药 CGC-CTC/Arg-Leu
+
-
920973
SCC
+
6/217
GTG-GGG/Val-Gly
-
+
CIS1
+
6/217
, http://www.100md.com
GTG-GGG/Val-Gly
-
+
CIS2
+
6/217
GTG-GGG/Val-Gly
-
+
920976
SCC
-
未检测
, 百拇医药
-
+
DYS
+
未检测
-
+
933131
SCC
-
未检测
-
-
BCH1
, 百拇医药
+
5/158
CGC-CTC/Arg-Leu
-
-
BCH2
+
未检测
-
-
933174
SCC
-
, 百拇医药
Intron 4
C-G
NIa
-
DYS
+
未检测
NIa
-
BCH
+
未检测
NIa
, 百拇医药
-
933334
SCC
-
未检测
NIa
-
BCH
+
未检测
NIa
-
933495
, 百拇医药
SCC
+
5/165-166
3-bp缺失
NIa
-
4
SCC
+
7/248
CGG-CAG/Arg-Gln
NIa
, 百拇医药
-
BCH
+
未检测
-
+
5
SCC
+
未检测
-
+
6
SCC
, 百拇医药
-
5/146
TGG-TGA/Trp-中止子
-
-
BCH
+
5/146
TGG-TGA/Trp-中止子
-
-
704
SCC
, 百拇医药
-
未检测
-
-
705
SCC
+
5/155
ACC-AAC/Thr-Asn
-
+
DYS
+
, 百拇医药
5/155
ACC-AAC/Thr-Asn
aNI表示未报道.
表2 食管鳞癌组织P53蛋白聚集和p53基因突变的比较 p53基因突变
P53免疫染色阳性
P53免疫染色阴性
总数
阳性
25
4
30(70%)
, http://www.100md.com 阴性
4
9
13(30%)
总数
29(67%)
14(33%)
43
aP<0.01，Fisher's精确检验，P53蛋白的聚集和p53基因突变之间.
2.2 食管癌前病变的p53基因突变 本研究在癌前病变基底细胞增生、间变和原位癌中检出的p53突变率(表1，3)分别为47%(7/16)，67%(8/12)和86%(6/7). 早期病变(基底细胞增生和间变)的p53突变率通常低于较重病变(原位癌和鳞癌)的p53突变率. 间变和原位癌中检出的突变与相应鳞癌中检出的突变相同(表1，3). 而检出突变的8例基底细胞增生组织中，突变类型不同于原发灶的有4例，且突变均发生在第5外显子的158位密码子(表1). 这4例中的3例被检出发生了G至T突变，并导致精氨酸变为亮氨酸，其余均为G至A突变，并使精氨酸变为组氨酸. 标本920937，不仅原发灶和癌旁基底细胞增生组织同时检出有内含子突变，而且原发灶中尚检出有第7外显子缺失突变. 标本920972，不仅原发灶和癌旁基底细胞增生组织同时检出158位密码子突变，而且原发灶中尚检出有第5外显子的176，182位密码子缺失突变和第8外显子的273位密码子的点突变.
, 百拇医药
表3 食管鳞癌和癌旁组织p53突变总结 病变
BCHa
DYSa
CISa
SCCa
SCC(总)b
p53基因突变
7/16(47%)
8/12
(67%)
6/7
, 百拇医药
(86%)
25/29
(86%)
30/43
(70%)
(同原发灶突变)/(相同的例数 )
3
8
6
N/A
N/A
aP53染色阳性病变，bP53阳性和阴性的所有鳞癌.
, 百拇医药
3 讨论
本研究显示，河南食管癌高发区居民食管鳞癌的p53基因突变率为70%，所观察到的突变均位于编码DNA结合区的5～8外显子. 其中热点突变9例，1例位于175密码子，2例位于248密码子，4例位于273密码子，2例位于282密码子，这些均是编码DNA结合部位精氨酸的重要密码子[18]. 所观察到的27例点突变中，14例为G:C至A:T的转换，它们中的10例位于CpG位点，这一现象提示，O6-烷基脱氧鸟嘌呤可能是某些环境致癌原所致的DNA烷基化的重要加成物. 事实上，已观察到林州食管癌高发区患者的O6-甲基脱氧鸟嘌呤水平明显升高. 此外，食管炎症产生的氧化氮所致的CpG位置5-甲基胞嘧啶的脱氨基可能也是G:C突变为A:T的原因. 作者以前对来自食管癌高发区林县的食管癌标本的分析显示[8]，其p53突变率为55%(16/29)，突变部位除1例发生在第8外显子外，其余均发生在第5或第7外显子. 这种突变检出率和分布上的差异可能是以前进行SSCP的条件不利于检出第6和第8外显子的突变所致. 本次所分析的43例食管鳞癌中，有P53蛋白累积的样本29例，其中的25例检出有p53基因突变；无P53蛋白累积的样本13例，其中的5例或有缺失、或有内含子突变、或有中止密码子突变. 另有9例样本未检出P53蛋白累积和基因突变. 总之，约有30%的食管鳞癌未发现p53基因突变，其中的21%甚至无蛋白聚集. 某些食管鳞癌中无p53基因突变的事实提示除p53功能失调外，尚有其他机制参与食管癌的形成. 有蛋白聚集而无p53基因突变的受检组织，可能是野生型P53蛋白与诸如mdm-2或人乳头瘤病毒结合，导致其稳定性增高、肿瘤抑制功能丧失的结果. 而既无蛋白聚集又无突变检出的癌组织，可能与p53上游或下游的信号途径异常有关. p16-Rb途径异常是逃避p53监控的一种主要机制，此途径可激活促使细胞周期从G1期到S期转化的基因转录，而这种作用不受p53或p21WAF1状态的影响. 事实上，本实验室观察到的结果显示，Rb基因的等位缺失和p16基因的失活在食管鳞癌中是一个常见现象(部分结果即将发表). 这些现象提示：p53功能失调和p16-Rb途径的异常可能均是食管癌变的起动因素. 另一个使增生细胞逃避p53监控的候选基因是p21WAF1. 作者最近的研究结果显示，正常食管上皮可见p21WAF1蛋白免疫反应，但癌细胞中无p21WAF1蛋白免疫染色. 尽管部分癌细胞具有功能正常的野生型p53，但由于缺乏p21WAF1的诱导，使得这些细胞的生长抑制信号不能传递到下游的效应基因.
, http://www.100md.com
有报道认为，在P53蛋白表达方面，间变与癌组织具有明显的相似性[11-14]，而且间变与原位癌的细胞增生活性无本质区别[19]. 作者观察到，癌旁间变和原位癌中检出的突变与原发灶中观察到的p53基因突变相同，这一结果为间变是食管癌较严重的癌前病变提供了重要的分子学基础. 本结果表明，尽管有P53蛋白累积，但大约一半的基底细胞增生病变无p53突变，而那些检出的突变也不同于原发灶中观察到的突变. 来自同一患者的癌旁早期病变和原发灶中出现不同类型p53基因突变的现象文献已有过报道[5，20]. 其可能原因是，高发区居民其食管全段均暴露于致癌原，不同位置的病变是独立发展的，这些病变中的部分最终发展成癌. 作者观察到基底细胞增生这样的早期病变即可检出p53基因突变，但只有那些发生在175，273密码子，具有高转录活性的突变才可能使病变向间变或原位癌发展并最终形成浸润性癌. 175位密码子和273位密码子突变后，其转录频率分别是野生型P53蛋白转录频率的22倍和8倍[21,22]. 通常不能在手术切除标本的基底细胞增生病变中，而只能在活检样本中检出这类突变的原因可能是包含这类突变的基底细胞增生已经发展成了更为严重的病变[8]. 另一方面，158位密码子突变致肿瘤发生的作用较弱，从而使发生这种突变的基底细胞增生可能不会有任何进展，而维持在早期病变状态. 158位密码子包含CpG位置，此位置对突变具有高敏感性，肺癌组织常发生这一部位的突变. 但是，p53基因突变的数据库显示，迄今只在2例食管癌中检出这种突变[17]. 这一现象表明该突变在食管癌变过程中作用较小. 总之，有关发生在基底细胞增生阶段的p53基因突变的生物学意义尚需更多的研究结果来阐明.
, 百拇医药
作者简介:郑作昱，女，1972-09-13生，河南省郑州市人，汉族. 1995年湖南医科大学毕业，1998年河南医科大学第一附属医院消化内科硕士，主要从事消化道肿瘤基础与临床研究，现为河南医科大学癌症研究室在读博士研究生，已发表论文5篇.
*国家自然科学基金课题，No.39840012和39670296. 美国NCI，CA65871和国家人事部重点资助优秀留学回国人员课题.
通讯作者 王立东，450052，河南省郑州市，河南医科大学癌症研究室.
*Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39840012, 39670296 and fund from NCI of USA, CA65781.
, 百拇医药
Correspondence to:WANG Li-Dong, Laboratory for Cancer Research, Henan Medical University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
Tel. +86.371.6970165
作者单位:郑作昱 王立东 高珊珊 李永欣
SHI Stephanie T YANG Guang-Yu XUE Zhi-HongYANG Chung S Laboratory for Cancer Research, College of Pharmacy, Rutgers University, Piscataway, NJ 08854 USA
, http://www.100md.com
4 参考文献
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收稿日期 1998-08-17, 百拇医药
单位：河南医科大学癌症研究室 河南省郑州市 450052
关键词：食管肿瘤；癌前状态；p53基因；突变
世界华人消化杂志990402 摘 要
目的 探讨肿瘤抑制基因p53在同一患者多灶性食管癌前病变和癌组织中的突变特征，以加深对其在食管癌发生过程中作用的认识.
方法 采用免疫组织化学、选择性免疫组化、DNA(PCR-SSCP-DNA)测序方法，对来自食管癌高发区林州市的43例食管癌手术切除标本的癌组织及癌旁非癌病变作P53蛋白表达及突变分析. 癌前病变和p53表达较弱的癌组织(阳性细胞<30%)，采用紫外线照射办法提高阳性细胞数再作DNA制备.
, 百拇医药
结果 受检的43例鳞癌中，30例检出有p53基因突变(70%)，其中29例P53蛋白表达阳性鳞癌中的25例检出有p53基因突变(86%). 对癌旁P53蛋白表达阳性的癌前病变分析显示，16例基底细胞增生中的7例(47%)，12例间变中的8例(67%)，7例原位癌中的6例(86%)检出有p53基因突变. 尽管有2例受检组织突变只见于癌组织，而其癌旁的间变组织未发现突变，但间变和原位癌中检出的p53基因突变与鳞癌中检出的p53基因突变类型相同. 7例基底细胞增生组织中，只有3例检出的p53基因突变类型与其邻近的癌组织相同，其余4例突变类型不同于邻近的癌组织.
结论 发生间变和原位癌组织的p53基因突变与食管鳞癌非常一致，而发生在基底细胞过度增生病变的p53基因突变的生物学意义尚有待进一步研究证实.
中国图书资料分类号 R735.1
p53 gene mutations in multifocal esophageal precancerous and cancerous lesions in patients with esophageal cancer in high-risk northern China*
, 百拇医药
Zheng Zuo-yu 1, WANG Li-Dong1, SHI Stephanie T.2 YANG Guang-Yu2, XUE Zhi-Hong2, GAO Shan-Shan1, LI Yong-Xin1 and YANG Chung S2
1Laboratory for Cancer Research, Henan Medical University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
2Laboratory for Cancer Research, College of Pharmacy, Rutgers University, Piscataway, NJ 08854, USA
, 百拇医药
Subject headings esophageal neoplasms; precancerous condition; p53 gene; mutation
Abstract
AIM To characterize p53 gene mutations in multifocal esophageal precancerous and cancerous lesions from the same patients to further understand its role in esophageal carcinogenesis.
METHODS With immunohistochemistry, immunohisto-selective sequencing and PCR-SSCP-DNA sequencing methods, p53 protein accumulation and p53 gene mutation were determined on 43 surgically-resected human esophageal specimens, which contain squamous cell carcinoma and precancerous lesions in different parts from a high-incidence area, Linzhou, Henan. For all the precancerous lesions and some of the tumor sections with low percentage of p53 immunostain-positive cells (<30%), UV irradiation was used to enrich the p53 immunostain-positive cells in the DNA preparation.
, 百拇医药
RESULTS p53 gene mutations were detected in 30 out of 43 (70%) SCC cases. Among 29 SCC cases that were stained positive for p53 protein, 25 (86%) were found to contain p53 mutations. In p53 immunostain-positive precancerous lesions adjacent to cancer, p53 mutations were detected in 7 of 16 (47%) basal cell hyperplasia (BCH), 8 of 12 (67%) dysplasia (DYS) and 6 of 7 (86%) carcinoma in situ (CIS). All mutations found in lesions with DYS and CIS were the same as those in the nearby SCC, although in 2 cases the mutations were only detected in SCC but not the nearby lesions with DYS. In 7 cases of BCH containing mutations, only 3 had the same mutations as the nearby SCC, and the other 4 had mutations different from the nearby SCC.
, 百拇医药
CONCLUSION The p53 mutations in DYS and CIS are strongly associated with SCC. p53 mutations in BCH need to be further characterized to elucidate its biological consequence.
0 引言
食管上皮癌变是一个多阶段进行性过程，常经历正常上皮基底细胞增生间变原位癌，最后形成浸润性癌[1-4]. 已往的研究显示，P53蛋白的累积和基因突变发生在食管癌变的极早期阶段，甚至轻度的基底细胞增生和形态学上接近正常的上皮也有这种改变[5-14]. 对于无症状非癌患者食管不同部位发生的间变组织p53基因突变类型不同[15]. 最近，作者建立了一种免疫组化选择性筛选方法，以提高癌前病变组织中P53蛋白阳性表达细胞的突变分析的精确性[16]. 依此方法，作者分析了43例食管鳞状细胞癌手术切除标本原发灶及邻近的P53蛋白阳性染色的癌前病变组织中的p53基因的突变状况. 由于癌组织和癌前病变组织来自同一患者，从而提高了不同病变组织中p53基因突变状况的可比性，并对加深p53基因在食管癌变过程不同时期作用的了解具有重要意义.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 人食管组织标本取自河南食管癌高发区患者，用850mL/L酒精固定. 组织经常规组织学处理和石蜡包埋，作HE 染色和P53免疫染色. 所有组织块均切成5μm厚的切片，并粘附至透明塑料片上(Xerox公司提供)，于60℃烘烤30min，再冷却至室温作免疫染色. 免疫组化采用ABC法[16]，ABC 试剂盒和DAB底物试剂盒购自 Vecter Laboratories, P53抗体，Ab-6由Oncogene Science提供，实验过程中使用试剂提供者建议的2倍镍量，以增强染色强度.
1.2 方法
1.2.1 组织的DNA制备 ①先将癌组织切片作P53免疫染色，再将阳性染色区域切下，以确保制备液中至少有80%的P53阳性染色细胞. 切下的组织小碎片置入Eppendorf管，用100μL～200μL消化缓冲液(10mmol/L Tris-HCl, 2mmol/L EDTA, pH 8.0, 0.4g/L蛋白酶K)消化，55℃孵育3h. ②癌前病变组织(包括基底细胞增生、间变和原位癌)和P53阳性染色细胞不足30%的肿瘤组织，均作紫外线照射，以提高阳性细胞数量. 详细操作方法见作者以往报道[16]. 此后，将含有P53阳性细胞的组织用无菌剪刀剪成碎片，置于Eppendrof管，用25μL～50μL消化缓冲液消化，55℃孵育3h.
, 百拇医药
1.2.2 p53基因PCR-SSCP-DNA测序 p53基因PCR扩增所用引物分别为：5’-ACT TCC TGA AAA CAA CGT TC-3’和5’-CAG GCA TTG AAG TCT CAT GG-3’用于第4外显子；5’-GTT TCT TTG CTG CCG TGT TC-3’和5’-AGGCCTGGGGAC-CCTGGGCA-3’用于第5外显子；5’-TGG TTG CCC AGG GTC CCC AG-3’和5’-GGA GGG CCA CTG ACA ACC A-3’用于第6外显子；5’-AGG CGC ACT GGC CTC ATC TT-3’和5’-AGG GGT CAT CGG CAA GCA GA-3’用于第7外显子；5’-TTG GGA GTA GAT GGA GCC T-3’和5’-AGG CAT AAC TGC ACC CTT GG-3’用于第8外显子；5’-GCA GTT ATG CCT CAG ATT CA-3’和5’-GGC ATT TTG AGT GTT AGA CT-3’用于第9外显子. PCR在20uL的反应缓冲液中进行(50μmol/L Tris, pH 9.0， 30mmol/L MgCl2)，其中含各种引物各8pmol, dNTP各200μmol/L,37kBq的α-32P-dATP和0.5U的Taq聚合酶. 热循环程序为：加入Taq多聚酶前于95℃循环3min，继而于94℃ 1min，60℃ 1min循环40次，每次PCR均作无DNA样本的阴性对照循环1min，观察到突变的样本DNA均重复作PCR扩增，以验证结果. 标记的PCR产物置于含有甘油的polyacrylamide凝胶上. 作SSCP和DNA测序过程中，以人胎盘DNA作阴性对照. 将不同于胎盘DNA对照的移动带洗脱提取，再作PCR分析，于94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，热循环35次. 用Wizard PCR Preps DNA纯化系统(Promega提供)纯化PCR产物作DNA测序. 基因组DNA均重复进行PCR并作SSCP分析，以排除由Taq多聚酶引入的假阳性移动带.
, 百拇医药
用于测序的引物序列为：5’-CCT CTG ACT GCT CTT TTC AC-3’用于第4外显子；5’-TGT TCA CTT GTG CCC TGA CT-3’用于第5外显子；5’-GCC TCT GAT TCC TCA CTG AT-3’用于第6外显子；5’-TGT GCA GGG TGG CAA GTG GC-3’用于第7外显子；5’-TTC CTT ACT GCC TCT TGC TT-3’用于第8外显子；5’-TTA TCA CCT TTC CTT GCC TC-3’用于第9外显子. DNA测序试剂盒由Amersham Life Science提供. 循环测序过程为：94℃热循环2min；94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min循环20次；94℃ 1min，72℃ 1min，72℃ 1min循环10次. 反应混合物置于60g/L的polyacrylamide测序凝胶上(由美国Diagnostics, Atlanta提供). 直接测序方法为：纯化PCR扩增产物，直接测序.
2 结果
, 百拇医药
2.1 食管鳞癌的p53基因突变 受检的43例食管鳞癌中，有P53蛋白聚积的样本29例，其中的25例检出有P53蛋白突变，无P53蛋白聚集的13例，其中的5例或有缺失，或有内含子突变，或有中止密码子突变(表1). 全部受检鳞癌，总的p53突变检出率为70%(30/43)，且蛋白聚集与基因突变有明显的相关性(Fisher's T检验，表2). 有2例标本各检出2种突变，1例标本检出有3种突变. 观察到的34种突变中，发生在第5外显子的11种，第6外显子4种，第7外显子7种，第8外显子9种，4，5，6外显子各1种. 按突变性质分，其中27例为点突变(14例为G:C转化为A:T)，6例为缺失突变，1例为插入突变. 迄今在人类肿瘤中检出的p53基因突变为5961种，其中发生在175，245，248，249，273和282位密码子的突变被认为是热点突变[7]. 我们发现9例热点突变，1例位于175位密码子，2例位于248位密码子，4例位于273位密码子，2例位于282位密码子，这些密码子均编码精氨酸.
表1 食管鳞癌及癌旁癌前病变中的P53蛋白聚集和p53基因突变 标本
, http://www.100md.com
编号
病变
P53免
疫染色
外显子/密码子
p53基因突变
p53
核苷酸/氨基酸的变化
LOH
MSI
910497
SCC
+
, 百拇医药
5/159
GCC-ACC/Ala-Thr
CIS
+
5/159
GCC-ACC/Ala-Thr
DYS
+
5/159
GCC-ACC/Ala-Thr
+
-
, 百拇医药 91069
SCC
+
7/234
TAC-TGC/Tyr-Cys
+
-
DYS
+
7/234
TAC-TGC/Tyr-Cys
BCH
+
, 百拇医药
未检测
910618
SCC
-
Intron 5
T-G
910623
SCC
-
5/158
CGC-CTC/Arg-Leu
DYS
+
, http://www.100md.com
5/158
CGC-CTC/Arg-Leu
910666
SCC
-
未检测
+
-
DYS
+
未检测
910673
SCC
, 百拇医药
-
6/190
CCT-ACT/Pro-Thr
+
-
DYS
+
6/190
CCT-ACT/Pro-Thr
910682
SCC
-
6/212
, 百拇医药
2-bp缺失
+
-
910715
SCC
+
8/279
GGG-GAG/Gly-Glu
+
-
910731
SCC
-
, http://www.100md.com
6/212
2-bp缺失
+
-
91755
SCC
+
7/245-246
10-bp插入
+
-
91799
SCC
, 百拇医药
+
5/159
GCC-GTC/Ala-Val
NIa
-
91787
SCC
+
5/135
TGC-TTC/Cys-Phe
-
-
DYS
, 百拇医药
+
5/135
TGC-TTC/Cys-Phe
910793
SCC
-
未检测
NIa
-
91799
SCC
-
未检测
, http://www.100md.com
+
-
910840
SCC
+
7/258
GAA-AAA/Glu-Lys
+
-
910843
SCC
+
7/248
, 百拇医药
CGG-TGG/Arg-Trp
NIa
-
8/278
CCT-ACT/Pro-Thr
CIS
+
7/248
CGG-TGG/Arg-Trp
NIa
-
8/278
, 百拇医药
CCT-ACT/Pro-Thr
DYS
+
7/248
CGG-TGG/Arg-Trp
NIa
-
8/278
CCT-ACT/Pro-Thr
920920
SCC
+
, 百拇医药
8/273
CGT-CAT/Arg-His
-
-
DYS
+
未检测
BCH
+
未检测
920922
SCC
+
, 百拇医药
8/273
CGT-CAT/Arg-His
NIa
-
CIS
+
8/273
CGT-CAT/Arg-His
NIa
-
DYS
+
, 百拇医药
8/273
CGT-CAT/Arg-His
NIa
-
920925
SCC
+
8/282
CGG-TGG/Arg-Trp
+
-
BCH
, 百拇医药 +
5/158
CGC-CTC/Arg-Leu
-
-
920928
SCC
+
5/176-182
18-bp眶内缺失
+
-
BCH
, http://www.100md.com
+
5/158
CGC-CTC/Arg-Leu
+
-
920934
SCC
-
未检测
-
-
920935
SCC
, http://www.100md.com
+
8/305
AAG-AAC/Lys-Asn
NIa
-
920937
SCC
+
Intron 6
G-C
+
-
7/234
, 百拇医药
3-bp眶内缺失
BCH
+
Intron 6
G-C
-
-
920942
SCC
-
未检测
NIa
-
, 百拇医药
920943
SCC
+
8/273
CGT-CAT/Arg-His
+
-
BCH
+
未检测
-
-
920947
, 百拇医药
SCC
+
未检测
+
-
BCH
+
未检测
-
-
920950
SCC
+
5/175
, 百拇医药
CGC-CAC/Arg-His
-
-
920951
SCC
+
7/255
ATC-TTC/Ile-Phe
+
-
CIS
+
7/255
, http://www.100md.com
ATC-TTC/Ile-Phe
+
-
920953
SCC
+
未检测
+
-
CIS
+
未检测
-
, 百拇医药
-
BCH1
+
未检测
-
-
BCH2
+
5/158
CGC-CAC/Arg-His
-
-
BCH3
, 百拇医药
+
未检测
-
-
921957
SCC
+
8/282
CGG-TGG/Arg-Trp
-
-
920972
SCC
, http://www.100md.com
+
5/158
CGC-CTC/Arg-Leu
+
-
5/176-182
18-bp眶内缺失
8/273
CGT-TGT/Arg-Cys
BCH
+
5/158
, 百拇医药 CGC-CTC/Arg-Leu
+
-
920973
SCC
+
6/217
GTG-GGG/Val-Gly
-
+
CIS1
+
6/217
, http://www.100md.com
GTG-GGG/Val-Gly
-
+
CIS2
+
6/217
GTG-GGG/Val-Gly
-
+
920976
SCC
-
未检测
, 百拇医药
-
+
DYS
+
未检测
-
+
933131
SCC
-
未检测
-
-
BCH1
, 百拇医药
+
5/158
CGC-CTC/Arg-Leu
-
-
BCH2
+
未检测
-
-
933174
SCC
-
, 百拇医药
Intron 4
C-G
NIa
-
DYS
+
未检测
NIa
-
BCH
+
未检测
NIa
, 百拇医药
-
933334
SCC
-
未检测
NIa
-
BCH
+
未检测
NIa
-
933495
, 百拇医药
SCC
+
5/165-166
3-bp缺失
NIa
-
4
SCC
+
7/248
CGG-CAG/Arg-Gln
NIa
, 百拇医药
-
BCH
+
未检测
-
+
5
SCC
+
未检测
-
+
6
SCC
, 百拇医药
-
5/146
TGG-TGA/Trp-中止子
-
-
BCH
+
5/146
TGG-TGA/Trp-中止子
-
-
704
SCC
, 百拇医药
-
未检测
-
-
705
SCC
+
5/155
ACC-AAC/Thr-Asn
-
+
DYS
+
, 百拇医药
5/155
ACC-AAC/Thr-Asn
aNI表示未报道.
表2 食管鳞癌组织P53蛋白聚集和p53基因突变的比较 p53基因突变
P53免疫染色阳性
P53免疫染色阴性
总数
阳性
25
4
30(70%)
, http://www.100md.com 阴性
4
9
13(30%)
总数
29(67%)
14(33%)
43
aP<0.01，Fisher's精确检验，P53蛋白的聚集和p53基因突变之间.
2.2 食管癌前病变的p53基因突变 本研究在癌前病变基底细胞增生、间变和原位癌中检出的p53突变率(表1，3)分别为47%(7/16)，67%(8/12)和86%(6/7). 早期病变(基底细胞增生和间变)的p53突变率通常低于较重病变(原位癌和鳞癌)的p53突变率. 间变和原位癌中检出的突变与相应鳞癌中检出的突变相同(表1，3). 而检出突变的8例基底细胞增生组织中，突变类型不同于原发灶的有4例，且突变均发生在第5外显子的158位密码子(表1). 这4例中的3例被检出发生了G至T突变，并导致精氨酸变为亮氨酸，其余均为G至A突变，并使精氨酸变为组氨酸. 标本920937，不仅原发灶和癌旁基底细胞增生组织同时检出有内含子突变，而且原发灶中尚检出有第7外显子缺失突变. 标本920972，不仅原发灶和癌旁基底细胞增生组织同时检出158位密码子突变，而且原发灶中尚检出有第5外显子的176，182位密码子缺失突变和第8外显子的273位密码子的点突变.
, 百拇医药
表3 食管鳞癌和癌旁组织p53突变总结 病变
BCHa
DYSa
CISa
SCCa
SCC(总)b
p53基因突变
7/16(47%)
8/12
(67%)
6/7
, 百拇医药
(86%)
25/29
(86%)
30/43
(70%)
(同原发灶突变)/(相同的例数 )
3
8
6
N/A
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aP53染色阳性病变，bP53阳性和阴性的所有鳞癌.
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3 讨论
本研究显示，河南食管癌高发区居民食管鳞癌的p53基因突变率为70%，所观察到的突变均位于编码DNA结合区的5～8外显子. 其中热点突变9例，1例位于175密码子，2例位于248密码子，4例位于273密码子，2例位于282密码子，这些均是编码DNA结合部位精氨酸的重要密码子[18]. 所观察到的27例点突变中，14例为G:C至A:T的转换，它们中的10例位于CpG位点，这一现象提示，O6-烷基脱氧鸟嘌呤可能是某些环境致癌原所致的DNA烷基化的重要加成物. 事实上，已观察到林州食管癌高发区患者的O6-甲基脱氧鸟嘌呤水平明显升高. 此外，食管炎症产生的氧化氮所致的CpG位置5-甲基胞嘧啶的脱氨基可能也是G:C突变为A:T的原因. 作者以前对来自食管癌高发区林县的食管癌标本的分析显示[8]，其p53突变率为55%(16/29)，突变部位除1例发生在第8外显子外，其余均发生在第5或第7外显子. 这种突变检出率和分布上的差异可能是以前进行SSCP的条件不利于检出第6和第8外显子的突变所致. 本次所分析的43例食管鳞癌中，有P53蛋白累积的样本29例，其中的25例检出有p53基因突变；无P53蛋白累积的样本13例，其中的5例或有缺失、或有内含子突变、或有中止密码子突变. 另有9例样本未检出P53蛋白累积和基因突变. 总之，约有30%的食管鳞癌未发现p53基因突变，其中的21%甚至无蛋白聚集. 某些食管鳞癌中无p53基因突变的事实提示除p53功能失调外，尚有其他机制参与食管癌的形成. 有蛋白聚集而无p53基因突变的受检组织，可能是野生型P53蛋白与诸如mdm-2或人乳头瘤病毒结合，导致其稳定性增高、肿瘤抑制功能丧失的结果. 而既无蛋白聚集又无突变检出的癌组织，可能与p53上游或下游的信号途径异常有关. p16-Rb途径异常是逃避p53监控的一种主要机制，此途径可激活促使细胞周期从G1期到S期转化的基因转录，而这种作用不受p53或p21WAF1状态的影响. 事实上，本实验室观察到的结果显示，Rb基因的等位缺失和p16基因的失活在食管鳞癌中是一个常见现象(部分结果即将发表). 这些现象提示：p53功能失调和p16-Rb途径的异常可能均是食管癌变的起动因素. 另一个使增生细胞逃避p53监控的候选基因是p21WAF1. 作者最近的研究结果显示，正常食管上皮可见p21WAF1蛋白免疫反应，但癌细胞中无p21WAF1蛋白免疫染色. 尽管部分癌细胞具有功能正常的野生型p53，但由于缺乏p21WAF1的诱导，使得这些细胞的生长抑制信号不能传递到下游的效应基因.
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有报道认为，在P53蛋白表达方面，间变与癌组织具有明显的相似性[11-14]，而且间变与原位癌的细胞增生活性无本质区别[19]. 作者观察到，癌旁间变和原位癌中检出的突变与原发灶中观察到的p53基因突变相同，这一结果为间变是食管癌较严重的癌前病变提供了重要的分子学基础. 本结果表明，尽管有P53蛋白累积，但大约一半的基底细胞增生病变无p53突变，而那些检出的突变也不同于原发灶中观察到的突变. 来自同一患者的癌旁早期病变和原发灶中出现不同类型p53基因突变的现象文献已有过报道[5，20]. 其可能原因是，高发区居民其食管全段均暴露于致癌原，不同位置的病变是独立发展的，这些病变中的部分最终发展成癌. 作者观察到基底细胞增生这样的早期病变即可检出p53基因突变，但只有那些发生在175，273密码子，具有高转录活性的突变才可能使病变向间变或原位癌发展并最终形成浸润性癌. 175位密码子和273位密码子突变后，其转录频率分别是野生型P53蛋白转录频率的22倍和8倍[21,22]. 通常不能在手术切除标本的基底细胞增生病变中，而只能在活检样本中检出这类突变的原因可能是包含这类突变的基底细胞增生已经发展成了更为严重的病变[8]. 另一方面，158位密码子突变致肿瘤发生的作用较弱，从而使发生这种突变的基底细胞增生可能不会有任何进展，而维持在早期病变状态. 158位密码子包含CpG位置，此位置对突变具有高敏感性，肺癌组织常发生这一部位的突变. 但是，p53基因突变的数据库显示，迄今只在2例食管癌中检出这种突变[17]. 这一现象表明该突变在食管癌变过程中作用较小. 总之，有关发生在基底细胞增生阶段的p53基因突变的生物学意义尚需更多的研究结果来阐明.
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作者简介:郑作昱，女，1972-09-13生，河南省郑州市人，汉族. 1995年湖南医科大学毕业，1998年河南医科大学第一附属医院消化内科硕士，主要从事消化道肿瘤基础与临床研究，现为河南医科大学癌症研究室在读博士研究生，已发表论文5篇.
*国家自然科学基金课题，No.39840012和39670296. 美国NCI，CA65871和国家人事部重点资助优秀留学回国人员课题.
通讯作者 王立东，450052，河南省郑州市，河南医科大学癌症研究室.
*Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39840012, 39670296 and fund from NCI of USA, CA65781.
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Correspondence to:WANG Li-Dong, Laboratory for Cancer Research, Henan Medical University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
Tel. +86.371.6970165
作者单位:郑作昱 王立东 高珊珊 李永欣
SHI Stephanie T YANG Guang-Yu XUE Zhi-HongYANG Chung S Laboratory for Cancer Research, College of Pharmacy, Rutgers University, Piscataway, NJ 08854 USA
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收稿日期 1998-08-17, 百拇医药