幽门螺杆菌flaA基因的变异
作者：余 毅 徐智民 欧锡祺 宋 姗 张妙英
单位：余 毅 欧锡祺 张妙英 广东省顺德市大良医院 528300； 宋 姗 徐智民 第一军医大学南方医院全军消化内科研究所 广东省广州市 10515
关键词：螺杆菌，幽门；鞭毛素A基因；胃疾病
世界华人消化杂志990415 摘 要
目的 鞭毛是幽门螺杆菌(Hp)的重要侵袭因子，本研究拟检测Hp鞭毛素A基因的变异性，进而研究其与Hp致病性的关系.
方法 我们对52例胃粘膜活检标本和18株Hp临床分离株进行Hp特异的16S rRNA基因和鞭毛素A基因PCR扩增和PCR-RFLP及PCR-RFLP-SSCP分析.
结果 对43例Hp(+)的flaA基因PCR-RFLP(HindⅢ)大约可分7个型(变异检出率为16.3%)，而PCR-RFLP-SSCP可分37个型(变异检出率为86.0%)，两者有非常显著性差异.
, http://www.100md.com
结论 flaA基因变异性极大，PCR-RFLP-SSCP优于PCR-RFLP，是检测其变异的有效方法.
中国图书资料分类号 R573
Variability of flaA gene of Helicobacter pylori
YU Yi1, XU Zhi-Min2, OU Xi-Qi1, SONG Shan2 and ZHANG Miao-Ying1
1Department of Daliang Hospital, Shunde 510300, Guangdong Province, China
2PLA Institute for Digestive Diseases, Nanfang Hospital, the First Military Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Subject headings Helicobacter pylori; flaA gene; stomach diseases
Abstract
AIM To study the variability and pathogenjcity of Helicobacter pylori (Hp).
METHODS PCR was performed in fifty-two biopsy specimens of gastric mucosa and 18 strains of Hp for 16S rRNA gene and flagellin A gene (flaA). And PCR-RFLP and RFLP-SSCP were also analyzed.
RESULTS Seven flaA genotypes were found by PCR-RFLP in 43 strains of Hp (detecting rate of variance was 16.3%), but 37 were found by PCR-RFLP-SSCP in the same group of cases (detecting rate of variance was 86.0%).
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CONCLUSION Very large variability in flaA gene of Hp was detected by PCR-RFLP-SSCP, which is a more effective method than PCR-RFLP to identify Hp strains in human stomach.
0 引言
幽门螺杆菌(Hp)是人类胃病的重要病原菌. 作为致病因素之一的Hp鞭毛，在其致病过程中起重要的作用[1-7]. 同时Hp的鞭毛从结构到基因型，均存在很大的差异[2-7]. 因此，表现在不同的Hp菌株所致人类病变也可能存在差异. 为研究Hp鞭毛基因的变异情况，我们采用Hp特异鞭毛A基因(flaA)引物，研究Hp鞭毛基因的变异的多态性.
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 ①标本来源：本研究检测72例标本，包括人胃粘膜活检标本52例和临床Hp分离株18例. ②引物设计：本研究采用Ho et al[8]设计的Hp特异16S rRNA基因正链引物Hp 1(5’-GCGCAATCAGCGTCAGGTAATG-3’)和反链Hp 2(5’-GCTAAGAGATCAGCCTATGTCC-3’)PCR扩增用于鉴定Hp(扩增长度509bp)(由上海生化所合成)；采用Leying[3]设计的Hp鞭毛蛋白A基因(flaA)引物Fla1(5’-ATGGCTTTTCAGGTCAATAC-3',1～20nt)和Fla2(5’-CTTAAGATATTTTG TTGAA CG-3'，1500～1521nt)(由加拿大合成)PCR(扩增长度1521bp)用于检测Hp株之间的差异性. ③PCR试剂及器材：10×PCR反应缓冲液(500mmol/L KCl， Tris-HCl (pH 9.0)和10g/L Triton X-100；MgCl2 25mmol/L，dNTP, Tag酶购自南方医院基因检测中心，DNA分子质量标准物购自北京天象人公司，HindⅢ由天象人公司购得. 所用DNA扩增仪(Perkin Elmer-480)、电泳仪(Bio-RAD/PAC300)、电泳槽(Bio-Rad，Protean Ⅱ XI Cell)、恒压恒流电流电泳仪(DF-C，北京东方仪器厂)、28B型垂直电泳槽(北京)、水平电泳槽(北京东方仪器厂)及恒温循环器(HX-10555，军科院)由第一军医大学南方医院提供.
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1.2 方法 胃粘膜标本采用10g/L SDS+蛋白酶K消化，苯酚∶氯仿∶异戊醇脱蛋白、乙酸钠及乙醇沉淀模板DNA，临床分离株直接将Hp菌落刮入灭菌双蒸水中，冻融后直接作为模板. 实验方法和步骤：①内镜下胃窦粘膜活检，用于Hp分离培养或抽提DNA；②PCR检测：在25μL反应体积中含dNTP各2.0mmol/L，1×PCR缓冲液，Fla1和Fla2各500nmol/L，DNA模板2μL，Tag酶1U，上覆2滴轻矿物油. PCR过程：将没有加酶及dNTP的PCR混合液95℃预变性5min→80℃×3min(加酶和dNTP)→(94℃×1min→47℃×1min→72℃×2min)×10循环→(94℃×30s→47℃×30s→72℃×1min)×25循环→72℃ 10min结束. 用于16S rRNA基因扩增的复性温度为55℃. ③PCR产物的琼脂糖凝胶电泳：吸取PCR产物6μL～8μL，在10g/L～15g/L的琼脂糖凝胶上100V×15min电泳，紫外分析仪上观察结果；④PCR-RFLP：PCR产物10μL用内切酶HindⅢ 2U+Buffer B于37℃消化2h，取10μL行丙烯酰胺凝胶电泳(2000V)，PAGE凝胶行银染观察其酶切产物的多态性. ⑤PCR-RFLP-SSCP：取上述酶切产物10μL，电泳前+等量SSCP上样缓冲液于95℃变性10min，在低温(<4℃)下上样及丙烯酰胺凝胶电泳(2000V)，PAGE凝胶行银染观察Hp鞭毛基因HindⅢ酶切片段单链构象的多态性.
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2 结果
我们对52例胃粘膜标本采用Hp特异16S rRNA基因引物的PCR检出Hp 27例(阳性率为51.9%)，而采用Hp特异的flaA基因引物的PCR检出Hp 25例，阳性率为48.1%，相对于Hp-16S rRNA基因的PCR的阳性率92.6%. 两者比较无显著性差异. 另对18例Hp临床分离株均可扩增出特异的flaA带，阳性率100%. 43株Hp的flaA基因PCR-RFLP(HindⅢ)大约可分7个型(变异检出率为16.3%)，而PCR-RFLP-SSCP可分37个型(变异检出率为86.0%)，两者有非常显著性差异.
3 讨论
我们观察到Hp的鞭毛有双级的单根鞭毛和多根鞭毛，部分临床株光镜下观察动力不明显或电镜下也难以观察到鞭毛，而鞭毛是Hp重要的致病因子之一. 文献报道，Hp的鞭毛基因变异很大，其研究一般采用PCR-RFLP的方法[5]. 而我们采用PCR-RFLP-SSCP方法，首先选用鞭毛flaA基因引物对其进行PCR检测，在PCR基础上对其产物行酶切片段长度的多态性分析(RFLP)和单链构象多态性分析(SSCP).
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本研究结果表明，Hp-flaA基因的PCR-RFLP可以检测出其基因型的差异，且差异的检出率与国外报道的结果接近[5]，但由于DNA的酶切反应受位点的限制，只要不是发生于位点的变异，而采用PCR-RFLP检出差异的很小. PCR-SSCP是将DNA的两条单链解开，在非变性PAGE凝胶中形成一定的空间结构，导致在电场中的泳动速度不一，形成一定的构象差异. 但其对DNA的片段大小有一定的要求，片段一般需小于400bp，且片段越小，检出点突变的机会越高，一般以200bp左右最为合适. 本研究选用的Hp flaA基因PCR产物达1521bp，采用PCR-SSCP便难以得到差异的结果. 为此，我们在PCR-RFLP的基础上，将PCR产物消化成一系列的片段，再进行SSCP电泳，使变异的检出率有明显的提高(16.3% vs 86.0%). 因此，PCR-RFLP-SSCP是鉴定菌株，了解变异的敏感方法.
鞭毛基因型的差异，可影响到Hp鞭毛动力的强弱、也可能与其粘附的强弱有关. Hp的感染首先需依靠其鞭毛动力，从致命的酸性胃液迅速穿入胃粘膜粘液层中定植，进而粘附于胃上皮细胞表面并在胃粘液层中扩展. Hp感染人胃后，为抵抗人类的自洁作用，也依靠其动力和粘附性，继续在胃内寄生，导致人类的胃病的发生和发展. 当然，影响Hp感染和导致人类胃病的因素尚有多种，如Hp的尿素酶、CagA,VacA等都与Hp的致病性有一定的关系. 除鞭毛基因外，鞭毛特异的ATP酶(flagellar-specific ATPase, FliⅠ)[10]也是影响Hp鞭毛动力的重要因素. 找出Hp基因差异与Hp株的致病性关系是非常困难的，需要大量的检测和对比研究. 我们在Hp flaA基因的变异检测方面做了一些工作，本研究证明，基于大片段的PCR-RFLP-SSCP是区分不同Hp株的理想方法，进而可检测不同Hp flaA基因型与其致病的关系.
, http://www.100md.com
作者简介：余毅，女，1965-10-19生，广东省中山市人. 1986年广州军区军医学校毕业，1992/1993第一军医大学南方医院进修内镜诊断及幽门螺杆菌研究，从事内科学消化系病专业，主治医师.
通讯作者 徐智民，510515，广州市同和南方医院全军消化内科研究所.
Correspondence to: XU Zhi-Min, PLA Institute for Digestive Diseases, Nanfang Hospital, the First Military Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
E-mail xu_zm@ usa. net
4 参考文献
, 百拇医药
[1] Newell DG. Virulence factors of Helicobacter pylori. Scand J Gastroenterol, 1991;187(Suppl):31-38
[2] Penn CW, Luke CJ. Bacterial flagellar diversity and significance in pathogenesis. FEMS Microbiol Lett, 1992;79:331-336
[3] Leying H, Suerbaum S, Geis G, Haas R. Cloning and genetic characterization of a Helicobacter pylori flagellin gene. Mol Microbiol, 1992;6;2863-2874
[4] Hurtado A, Owen RJ, Desai M. Flagellin gene profiling of Helicobacter pylori infecting symptomatic and asymptomatic individuals. Res Microbiol, 1994;145:585-594
, http://www.100md.com
[5] Akopyanz N, Bukanov NO, Westblom TU, Berg DE. PCR-based RFLP analysis of DNA sequence diversity in the gastric pathogen Helicobacter pylori. Nucleic Acids Res, 1992;20:6221-6225
[6] Mobley HL. Defining Helicobacter pylori as a pathogen: strain heterogeneity and virulence. Am J Med, 1996;100:2S-9S
[7] Forbes KJ, Fang Z, Pennington TH. Allelic variation in the Helicobacter pylori flagellin genes flaA and flaB: its consequences for strain typing schemes and population structure. Epidemiol Infect, 1995;114:257-266
, http://www.100md.com
[8] Ho SA, Hoyle JA, Lewis FA, Secker AD, Cross D, Mapstone NP. Direct polymerase chain reaction test for detection of Helicobacter pylori in humans and animals. J Clin Microbiol, 1991;29:2543-2549
[9] Eaton KA, Suerbaum S, Josenhans C, Krakowka S. Colonization of gnotobiotic piglets by Helicobacter pylori deficient in two flagellin genes. Infect Immun, 1996;64:2445-2448
[10] Jenks PJ, Foynes S, Ward SJ, Constantinidou C, Penn CW, Wren BW. A flagellar-specific ATPase (FliⅠ) is necessary for flagellar export in Helicobacter pylori. FEMS Microbiol Lett, 1997;152:205-211
收稿日期 1998-07-07, 百拇医药
单位：余 毅 欧锡祺 张妙英 广东省顺德市大良医院 528300； 宋 姗 徐智民 第一军医大学南方医院全军消化内科研究所 广东省广州市 10515
关键词：螺杆菌，幽门；鞭毛素A基因；胃疾病
世界华人消化杂志990415 摘 要
目的 鞭毛是幽门螺杆菌(Hp)的重要侵袭因子，本研究拟检测Hp鞭毛素A基因的变异性，进而研究其与Hp致病性的关系.
方法 我们对52例胃粘膜活检标本和18株Hp临床分离株进行Hp特异的16S rRNA基因和鞭毛素A基因PCR扩增和PCR-RFLP及PCR-RFLP-SSCP分析.
结果 对43例Hp(+)的flaA基因PCR-RFLP(HindⅢ)大约可分7个型(变异检出率为16.3%)，而PCR-RFLP-SSCP可分37个型(变异检出率为86.0%)，两者有非常显著性差异.
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结论 flaA基因变异性极大，PCR-RFLP-SSCP优于PCR-RFLP，是检测其变异的有效方法.
中国图书资料分类号 R573
Variability of flaA gene of Helicobacter pylori
YU Yi1, XU Zhi-Min2, OU Xi-Qi1, SONG Shan2 and ZHANG Miao-Ying1
1Department of Daliang Hospital, Shunde 510300, Guangdong Province, China
2PLA Institute for Digestive Diseases, Nanfang Hospital, the First Military Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Subject headings Helicobacter pylori; flaA gene; stomach diseases
Abstract
AIM To study the variability and pathogenjcity of Helicobacter pylori (Hp).
METHODS PCR was performed in fifty-two biopsy specimens of gastric mucosa and 18 strains of Hp for 16S rRNA gene and flagellin A gene (flaA). And PCR-RFLP and RFLP-SSCP were also analyzed.
RESULTS Seven flaA genotypes were found by PCR-RFLP in 43 strains of Hp (detecting rate of variance was 16.3%), but 37 were found by PCR-RFLP-SSCP in the same group of cases (detecting rate of variance was 86.0%).
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CONCLUSION Very large variability in flaA gene of Hp was detected by PCR-RFLP-SSCP, which is a more effective method than PCR-RFLP to identify Hp strains in human stomach.
0 引言
幽门螺杆菌(Hp)是人类胃病的重要病原菌. 作为致病因素之一的Hp鞭毛，在其致病过程中起重要的作用[1-7]. 同时Hp的鞭毛从结构到基因型，均存在很大的差异[2-7]. 因此，表现在不同的Hp菌株所致人类病变也可能存在差异. 为研究Hp鞭毛基因的变异情况，我们采用Hp特异鞭毛A基因(flaA)引物，研究Hp鞭毛基因的变异的多态性.
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 ①标本来源：本研究检测72例标本，包括人胃粘膜活检标本52例和临床Hp分离株18例. ②引物设计：本研究采用Ho et al[8]设计的Hp特异16S rRNA基因正链引物Hp 1(5’-GCGCAATCAGCGTCAGGTAATG-3’)和反链Hp 2(5’-GCTAAGAGATCAGCCTATGTCC-3’)PCR扩增用于鉴定Hp(扩增长度509bp)(由上海生化所合成)；采用Leying[3]设计的Hp鞭毛蛋白A基因(flaA)引物Fla1(5’-ATGGCTTTTCAGGTCAATAC-3',1～20nt)和Fla2(5’-CTTAAGATATTTTG TTGAA CG-3'，1500～1521nt)(由加拿大合成)PCR(扩增长度1521bp)用于检测Hp株之间的差异性. ③PCR试剂及器材：10×PCR反应缓冲液(500mmol/L KCl， Tris-HCl (pH 9.0)和10g/L Triton X-100；MgCl2 25mmol/L，dNTP, Tag酶购自南方医院基因检测中心，DNA分子质量标准物购自北京天象人公司，HindⅢ由天象人公司购得. 所用DNA扩增仪(Perkin Elmer-480)、电泳仪(Bio-RAD/PAC300)、电泳槽(Bio-Rad，Protean Ⅱ XI Cell)、恒压恒流电流电泳仪(DF-C，北京东方仪器厂)、28B型垂直电泳槽(北京)、水平电泳槽(北京东方仪器厂)及恒温循环器(HX-10555，军科院)由第一军医大学南方医院提供.
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1.2 方法 胃粘膜标本采用10g/L SDS+蛋白酶K消化，苯酚∶氯仿∶异戊醇脱蛋白、乙酸钠及乙醇沉淀模板DNA，临床分离株直接将Hp菌落刮入灭菌双蒸水中，冻融后直接作为模板. 实验方法和步骤：①内镜下胃窦粘膜活检，用于Hp分离培养或抽提DNA；②PCR检测：在25μL反应体积中含dNTP各2.0mmol/L，1×PCR缓冲液，Fla1和Fla2各500nmol/L，DNA模板2μL，Tag酶1U，上覆2滴轻矿物油. PCR过程：将没有加酶及dNTP的PCR混合液95℃预变性5min→80℃×3min(加酶和dNTP)→(94℃×1min→47℃×1min→72℃×2min)×10循环→(94℃×30s→47℃×30s→72℃×1min)×25循环→72℃ 10min结束. 用于16S rRNA基因扩增的复性温度为55℃. ③PCR产物的琼脂糖凝胶电泳：吸取PCR产物6μL～8μL，在10g/L～15g/L的琼脂糖凝胶上100V×15min电泳，紫外分析仪上观察结果；④PCR-RFLP：PCR产物10μL用内切酶HindⅢ 2U+Buffer B于37℃消化2h，取10μL行丙烯酰胺凝胶电泳(2000V)，PAGE凝胶行银染观察其酶切产物的多态性. ⑤PCR-RFLP-SSCP：取上述酶切产物10μL，电泳前+等量SSCP上样缓冲液于95℃变性10min，在低温(<4℃)下上样及丙烯酰胺凝胶电泳(2000V)，PAGE凝胶行银染观察Hp鞭毛基因HindⅢ酶切片段单链构象的多态性.
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2 结果
我们对52例胃粘膜标本采用Hp特异16S rRNA基因引物的PCR检出Hp 27例(阳性率为51.9%)，而采用Hp特异的flaA基因引物的PCR检出Hp 25例，阳性率为48.1%，相对于Hp-16S rRNA基因的PCR的阳性率92.6%. 两者比较无显著性差异. 另对18例Hp临床分离株均可扩增出特异的flaA带，阳性率100%. 43株Hp的flaA基因PCR-RFLP(HindⅢ)大约可分7个型(变异检出率为16.3%)，而PCR-RFLP-SSCP可分37个型(变异检出率为86.0%)，两者有非常显著性差异.
3 讨论
我们观察到Hp的鞭毛有双级的单根鞭毛和多根鞭毛，部分临床株光镜下观察动力不明显或电镜下也难以观察到鞭毛，而鞭毛是Hp重要的致病因子之一. 文献报道，Hp的鞭毛基因变异很大，其研究一般采用PCR-RFLP的方法[5]. 而我们采用PCR-RFLP-SSCP方法，首先选用鞭毛flaA基因引物对其进行PCR检测，在PCR基础上对其产物行酶切片段长度的多态性分析(RFLP)和单链构象多态性分析(SSCP).
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本研究结果表明，Hp-flaA基因的PCR-RFLP可以检测出其基因型的差异，且差异的检出率与国外报道的结果接近[5]，但由于DNA的酶切反应受位点的限制，只要不是发生于位点的变异，而采用PCR-RFLP检出差异的很小. PCR-SSCP是将DNA的两条单链解开，在非变性PAGE凝胶中形成一定的空间结构，导致在电场中的泳动速度不一，形成一定的构象差异. 但其对DNA的片段大小有一定的要求，片段一般需小于400bp，且片段越小，检出点突变的机会越高，一般以200bp左右最为合适. 本研究选用的Hp flaA基因PCR产物达1521bp，采用PCR-SSCP便难以得到差异的结果. 为此，我们在PCR-RFLP的基础上，将PCR产物消化成一系列的片段，再进行SSCP电泳，使变异的检出率有明显的提高(16.3% vs 86.0%). 因此，PCR-RFLP-SSCP是鉴定菌株，了解变异的敏感方法.
鞭毛基因型的差异，可影响到Hp鞭毛动力的强弱、也可能与其粘附的强弱有关. Hp的感染首先需依靠其鞭毛动力，从致命的酸性胃液迅速穿入胃粘膜粘液层中定植，进而粘附于胃上皮细胞表面并在胃粘液层中扩展. Hp感染人胃后，为抵抗人类的自洁作用，也依靠其动力和粘附性，继续在胃内寄生，导致人类的胃病的发生和发展. 当然，影响Hp感染和导致人类胃病的因素尚有多种，如Hp的尿素酶、CagA,VacA等都与Hp的致病性有一定的关系. 除鞭毛基因外，鞭毛特异的ATP酶(flagellar-specific ATPase, FliⅠ)[10]也是影响Hp鞭毛动力的重要因素. 找出Hp基因差异与Hp株的致病性关系是非常困难的，需要大量的检测和对比研究. 我们在Hp flaA基因的变异检测方面做了一些工作，本研究证明，基于大片段的PCR-RFLP-SSCP是区分不同Hp株的理想方法，进而可检测不同Hp flaA基因型与其致病的关系.
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作者简介：余毅，女，1965-10-19生，广东省中山市人. 1986年广州军区军医学校毕业，1992/1993第一军医大学南方医院进修内镜诊断及幽门螺杆菌研究，从事内科学消化系病专业，主治医师.
通讯作者 徐智民，510515，广州市同和南方医院全军消化内科研究所.
Correspondence to: XU Zhi-Min, PLA Institute for Digestive Diseases, Nanfang Hospital, the First Military Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
E-mail xu_zm@ usa. net
4 参考文献
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[1] Newell DG. Virulence factors of Helicobacter pylori. Scand J Gastroenterol, 1991;187(Suppl):31-38
[2] Penn CW, Luke CJ. Bacterial flagellar diversity and significance in pathogenesis. FEMS Microbiol Lett, 1992;79:331-336
[3] Leying H, Suerbaum S, Geis G, Haas R. Cloning and genetic characterization of a Helicobacter pylori flagellin gene. Mol Microbiol, 1992;6;2863-2874
[4] Hurtado A, Owen RJ, Desai M. Flagellin gene profiling of Helicobacter pylori infecting symptomatic and asymptomatic individuals. Res Microbiol, 1994;145:585-594
, http://www.100md.com
[5] Akopyanz N, Bukanov NO, Westblom TU, Berg DE. PCR-based RFLP analysis of DNA sequence diversity in the gastric pathogen Helicobacter pylori. Nucleic Acids Res, 1992;20:6221-6225
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[7] Forbes KJ, Fang Z, Pennington TH. Allelic variation in the Helicobacter pylori flagellin genes flaA and flaB: its consequences for strain typing schemes and population structure. Epidemiol Infect, 1995;114:257-266
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[9] Eaton KA, Suerbaum S, Josenhans C, Krakowka S. Colonization of gnotobiotic piglets by Helicobacter pylori deficient in two flagellin genes. Infect Immun, 1996;64:2445-2448
[10] Jenks PJ, Foynes S, Ward SJ, Constantinidou C, Penn CW, Wren BW. A flagellar-specific ATPase (FliⅠ) is necessary for flagellar export in Helicobacter pylori. FEMS Microbiol Lett, 1997;152:205-211
收稿日期 1998-07-07, 百拇医药